靶向MRP1基因pRNAT-H1.1以及shuttle-RFP重组质粒表达载体构

齐 齐 哈 尔 大 学

毕业设计（论文）

题 目 靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质

粒表达载体构建

学 院

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成 绩

2011 年 6 月 20 日

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摘 要

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。

目的：本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。

方法：将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α后大量提取重组质粒，经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。

结果：成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。

关键词：RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒；穿梭载体

I

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Abstract

Cancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplaceable way in cancer treatment. MDR of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively complicated, and the excessively expression of multidrug resistance-associated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing MDR1 gene by RNAi, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR.

Objective: In this study, pRNAT-H1.1/shuttle-RFP plasmid was selected to construct the RNAi expression vector of mrp1 mRNA.

Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into pRNAT-H1.1/shuttle-RFP vector to construct recombinant vector. Transformed the recombinant vector into E.coli DH5α. The result of recombinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing .

Results: Constructing pRNAT-H1.1/shuttle-RFP recombinant plasmid expression vector was constructed successfully. It may be the foundation of restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells.

Key Words：RNA interference；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP plasmid；shuttle vector

II

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目 录

摘 要 .................................................................... I Abstract .................................................................. II 第1章 绪 论 .............................................................. 1

1.1 RNAi的研究进展 .................................................... 1

1.1.1 RNAi的发现过程 .............................................. 1 1.1.2 RNAi的分子作用机制 .......................................... 2 1.1.3 RNAi的特点 .................................................. 3 1.1.4 siRNA简介 ................................................... 3 1.1.5 siRNA的设计原则 ............................................. 3 1.1.6 RNAi在抗肿瘤方面的研究 ...................................... 4 1.2 用于RNAi的载体 ................................................... 4

1.2.1载体的选择 ................................................... 5 1.2.2 质粒人工构建的目的 ........................................... 5 1.3 MRP1的研究进展 ................................................... 5

1.3.1 MRP的转运底物、组织分布及生理作用 ........................... 6 1.3.2 MRP在组织中的表达 ........................................... 6 1.4 基因治疗 ........................................................... 7 1.5 本课题在国内外的研究现状 ........................................... 7 1.6 本论文的研究目的及意义 ............................................. 8 1.7 本论文的主要内容 ................................................... 8 第2章 实验材料与方法 ..................................................... 9

2.1 实验材料 ........................................................... 9

2.1.1 宿主菌 ....................................................... 9 2.1.2 质粒载体 ..................................................... 9 2.1.3 载体通用引物 ................................................ 11 2.1.4 主要试剂及工具酶 ............................................ 11 2.1.5 主要仪器 .................................................... 12 2.2 实验方法 .......................................................... 13

2.2.1 shRNA的设计与退火 .......................................... 13 2.2.2 合成干涉片段的退火 .......................................... 16 2.2.3 重组载体的构建 .............................................. 17 2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子 .................................. 20 2.2.5 测序鉴定重组载体 ............................................ 21 2.2.6 重组质粒大提的OD值检测 ..................................... 21

III

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第3章 结果与分析 ........................................................ 22

3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果 .......................... 22

3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果 ........................... 22 3.1.2 目的片段的回收 .............................................. 23 3.2 重组载体的菌落PCR ............................................... 24 3.3 重组质粒大量提取 .................................................. 25 3.4 重组质粒测序结果 .................................................. 26 讨 论 .................................................................... 29

4.1 菌落PCR鉴定重组 ................................................. 29 4.2 重组质粒穿梭载体的构建 ............................................ 29 结 论 .................................................................... 30 参考文献 ................................................................. 31 致 谢 ................................................................... 34

IV

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基因(ABCC1)位于染色体16p13.1上并且编码含有1531个氨基酸的蛋白。经序列分析，将MRP1分为ATP-结合框超家族中的一员，MDR/P-糖蛋白也属于这一超家族。MRP1是一个膜整合糖磷蛋白，其表观分子量为190kDa[23,24]，一个运用ATP结合/水解[25,26]产生的能量，来行使此蛋白主要的有活性的转运功能。

1.3.1 MRP的转运底物、组织分布及生理作用

MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，

MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。MRP1表达水平最高的组织包括：肺，睾丸，肾，心和胎盘；

MRP1的生理作用 MRP1在作为机体主要防线的组织中分布，以及MRP1的底物特异性，表明MRP1有保护机体免受外源生物质和内源毒性代谢物侵害的生理作用。通过对基因敲除的动物进行研究确定了MRP1的功能。尽管很多体外实验明确的证实了：MRP1介导外源和内源物质的转运。但是几次尝试证实MRP1在体内的保护作用都没有成功。

1.3.2 MRP在组织中的表达

典型的MDR机制在肿瘤耐药中起一定作用，但多数学者发现MDR1基因和P-gP在肿瘤中的表达水平并不高，难以解释NSCIC的高度耐药。Narasaki等发现许多癌组织同时表达MRP1和MDR1，但后者表达较低，故认为MRP 1较MDR1能是反映肿瘤多药耐药更好的指标。在肿瘤复杂的耐药机制中，MRP1和MRP3的过度表达发挥了重要作用。Oguri等报道在运用铂类化疗药物后，40例肿瘤患者的MRP5表达较用药前明显增高，且伴有MRP1及GSH的升高，故认为MRP5可能与GSH 一起参与MRP1导的多药耐药[27]。

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1.4 基因治疗

基因治疗是肿瘤多药耐药逆转的手段之一，所谓基因治疗是指利用遗传或分子生物学方法将外源基因导人生物体内或人体细胞内，以弥补所缺失的基因或关闭、降低异常基因的表达，从而对疾病进行治疗。基因治疗是治疗肿瘤的新手段，目前共有3种MDR基因治疗的策略：将相关凋亡基因转导入肿瘤细胞，促使其凋亡；使用反义技术抑制肿瘤细胞耐药基因表达；将外源mdr1基因转导入人造血干细胞以提高骨髓对化疗药物的耐药性。

1.5 本课题在国内外的研究现状

多药耐药蛋白基因1编码的多药耐药蛋白的过度表达是重要的肿瘤耐药机制之一。RNAi是一种用dsRNA作为序列特异性的触发器指导同源单链RNA降解的细胞机制。在最近的研究中显示特定目的基因的表达可被RNA干扰高效抑制。小干扰RNA(siRNA)作为一种中间介质，介导哺乳动物细胞中与之同源基因的沉默

[28]

。RNAi的作为一种经济、快捷、高效的技术手段，正逐步被应用于遗传性疾病、从1990年，植物学家对矮牵牛花注入红色素基因，却使花变成白色，到1995年

病毒性疾病以及肿瘤等的基因治疗。

Su Guo博士利用线虫完成的实验，科学家首次发现了RNA干扰的现象，但是并未能对其理论做出合理解释。直到1998年，Andrew Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，Andrew Fire和Craig Mello将这一现象命名为RNAi，并于1998年在Nature上发表了相关论文。随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于果蝇，线虫，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNA干扰来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。近几年来RNAi的研究取得了很大进展,2001年它被《Science》杂志评为十大科学成就之一,2002年被评为十大科学成就之首。[29]自2002年5月以后，先后出现将RNAi技术应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美国科学家Mc Caffrey）和癌细胞（如我国徐根兴教授）的研究报道。这一发现提示可以应用RNAi技术来抑制MRP1基因的蛋白表达。Nieth C等（2003）发现临床上化学合成siRNA更适于联合治疗，可以利用化学合成的siRNA同时转录多种MRP相关基因，如其他ABC转运编码基因或细胞凋亡编码基因等，而且也可同时编码其他致癌基因或血管生成因子进行联合治疗2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家，以表彰他们发现了RNA干扰现象。

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由于RNAi技术的高效性和高度特异性，RNAi已成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段，并为基因治疗开辟了新的途径。现RNAi已广泛应用到HIV、病毒性肝炎、基因治疗及药物筛选探索中，对肿瘤细胞多药耐药性干扰作用的研究也正在迅速发展中，随着研究的深入和发展，将为MRP细胞的逆转提供一个安全有效的途径。

1.6 本论文的研究目的及意义

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。

本实验针对mrp1基因设计并合成了两对能编码siRNA的DNA片段，进而构建pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达穿梭载体，为研究以RNAi技术逆转肿瘤细胞多药耐药提供实验基础。

1.7 本论文的主要内容

依据研究的目的及实验思路，本论文主要内容包括

1．根据肿瘤细胞的mrp1基因核苷酸序列，按照靶位点的寻找原则，设计并合成2个编码shRNA的DNA模板sh-mrp1-1和sh-mrp1-2。

2．pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大量提取。

3．质粒载体经Hind Ⅲ和BamH I双酶切，并进行胶回收。

4．载体与设计合成的干涉片段连接，构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。

5．用已构建的靶向mrp1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体转化大肠杆菌E.coli DH5α进行菌落PCR，检测重组质粒构建是否正确；重组质粒大量提取，进行OD值检测。

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第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 宿主菌

E.coli DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。

2.1.2 质粒载体

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒由华中科技大学吴政星教授惠赠，该质粒源自Genscript公司（Scotch PlamsUSA）。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒特性如下：

pRNAT-H1.1/shuttle 是一种腺病毒siRNA穿梭质粒，shRNA的表达由人的转录启动子H1 Promoter启动，H1启动子属于PolⅢ启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成RNA，转录过程遇到4~5个连续的U即终止，非常精确；同时CMV Promoter为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白（Red Fluorescence Protein，RFP）的表达；MCS为多克隆位点。质粒图谱见图2-1

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HindIII (6162)KpnI (6160)BamHI (6144)H1 promoter (6043-6142)CMV Promoter (37-624)Ampcillin (4746-5606)RFP (641-1336)pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP6168 bpPoly A(1351)P1 Sce 1(1802)pUC ori (3958-4598)SV40 Promoter (2064-2409)Neomycin (2450-3244)

图2-1 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒图谱 Fig.2-1 Detailed map of pRNAT-H1.1/shuttle-cRFP

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2.1.3 载体通用引物

正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′- GAGTTAGCTCACTCATTAGGC -3′

2.1.4 主要试剂及工具酶

质粒快速提取试剂盒

Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒 10×PCR buffer dNTP

Marker(1kb,100bp) Goldview DNA染料 吖啶橙 氨苄青霉素 EDTA 溶菌酶 LiCl RNase bacto-typtone bacto-yeast extract PEG8000 TriS饱和酚 HindⅢ BamHI T4DNA连接酶 Taq酶

2.1.4.1 电泳缓冲液及培养基

1、 50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，EDTA（Na2EDTA·2H2O）37.2g溶水，定容至1000mL。

2、10×TBE电泳缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA（5M，pH8.0）20ml，ddH2O定容至500ml。

3、LB液体培养基：将bacto-typtone 2g、bacto-yeast extract 1g和NaCl 2g，溶于195mL

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上海生工生物工程技术服务有限司 上海生工生物工程技术服务有限司 北京鼎国生物技术有限责任公司 上海生工生物工程技术服务有限司 上海生工生物工程技服务有限公司 北京赛百盛基因技术有限公司 北京鼎国生物技术有限责任公司 上海生工生物工程技术服务有限司 Bio Basic Inc

北京鼎国生物技术有限责任公司 Amresco Sigma Bio Basic Inc Bio Basic Inc

北京鼎国生物技术有限责任公司 北京鼎国生物技术有限责任公司 NEB公司 NEB公司 NEB公司

北京鼎国生物技术有限责任公司

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双蒸H2O，溶解后用5MNaOH调PH值至7.0，定容至200ml，共配置5份，121℃湿热灭菌30min。

4、固体选择培养基（Ampr）：每100ml LB液体培养基中加1.5g琼脂粉，121℃湿热灭菌20min，待温度降至60℃加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，混匀后倒平板，4℃保存备用。

2.1.4.2 大提质粒溶液配置

(1)溶液I：50mmol/L C6H12O6，25mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 (2)溶液II：0.2mol/L NaOH，1% SDS。

(3)溶液III：5mol/L KAc600mL， 冰乙酸115mL，H2O 285mL。

(4)溶菌酶（现用现配）：取0.1g溶菌酶溶于10mL 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）。 (5) PEG8000缓冲液：取6.5g PEG8000溶于50mL 1.6mol/L NaCl.。 (6) 70%乙醇：取300mL无水乙醇溶于700mL水中。

(7) TE（pH8.0）缓冲液：1mol/L Tris-HCl（pH8.0）500μL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100μL，加水至50mL。

2.1.5 主要仪器

微量振荡器（MM-2型） 微量振荡器（MM-2型） 恒温空气摇床 电子天平

紫外分析仪（ZF型） 低温离心机（SK18） 低温离心机（SK18） PCR仪（9600型） 恒温磁力搅拌器（2003-16） 恒温水浴锅 自动双重纯水仪

上海像华化工有限公司 上海像华化工有限公司

北京鼎国生物技术有限责任公司 北京赛多利斯天平有限公司 上海康华生化仪器制造厂 SIGMA公司 SIGMA公司 ABI

常州国华电器有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海博通仪器厂

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2.2 实验方法

2.2.1 shRNA的设计与退火

根据siRNA设计原则[34]，根据MRP1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(TTCAAGAGA)，5′端带有BamHⅠ酶切位点，3′端带有HindⅢ酶切位点，用BLAST进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shRNA的DNA模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。 干涉靶点在mrp1基因mRNA全序列中的位置如下(粗体代表靶序列)：

1 ccaggcggcg ttgcggcccc ggccccggct ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc 61 gccgccgccg ccgccgccag cgctagcgcc agcagccggg cccgatcacc cgccgcccgg 121 tgcccgccgc cgcccgcgcc agcaaccggg cccgatcacc cgccgcccgg tgcccgccgc 181 cgcccgcgcc accggcatgg cgctccgggg cttctgcagc gccgatggct ccgacccgct 241 ctgggactgg aatgtcacgt ggaataccag caaccccgac ttcaccaagt gctttcagaa 301 cacggtcctc gtgtgggtgc cttgttttta cctctgggcc tgtttcccct tctacttcct 361 ctatctctcc cgacatgacc gaggctacat tcagatgaca cctctcaaca aaaccaaaac 421 tgccttggga tttttgctgt ggatcgtctg ctgggcagac ctcttctact ctttctggga 481 aagaagtcgg ggcatattcc tggccccagt gtttctggtc agcccaactc tcttgggcat 541 caccacgctg cttgctacct ttttaattca gctggagagg aggaagggag ttcagtcttc 601 agggatcatg ctcactttct ggctggtagc cctagtgtgt gccctagcca tcctgagatc 661 caaaattatg acagccttaa aagaggatgc ccaggtggac ctgtttcgtg acatcacttt 721 ctacgtctac ttttccctct tactcattca gctcgtcttg tcctgtttct cagatcgctc

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根据2个靶序列设计的2对DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2序列见表2.1；2.2：

表2.1 根据靶位点合成的干涉片段1（mrp1-1）序列 Table 2.1 siRNA sequence synthesized according to target 1point 1

Mrp1 靶序列1 正义链（2-sense）

aattctcaatgggatcaaagt

5′-GATCCaattctcaatgggatcaaagtTTCAAGAGAactttgatcccattgagaattTTTTTTGGAAA-3′

反义链（2-antisense） 5′-AGCTTTTCCAAAAAAaattctcaatgggatcaaagtTCTCTTGAAactttgat

cccattgagaattG-3′

表2.2 根据靶位点合成的干涉片段2（mrp1-2）序列 Table 2.2 siRNA sequence synthesized according to target 1point 2

Mrp1 靶序列2 正义链（3-sense）

ggatcaagaccgctgtcat

5′-GATCCggatcaagaccgctgtcatTTCAAGAGAatgacagcggtcttgatccTTTTTTGGAAA-3′

反义链（3-antisense） 5′-AGCTTTTCCAAAAAAggatcaagaccgctgtcatTCTCTTGAAatgacagc

ggtcttgatccG-3′

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2.2.2 合成干涉片段的退火

合成片段的退火体系：

sense antisense 10×PCR buffer dd H2O

各管混匀后90℃保温3分钟，37℃保温1h，再取5μL退火溶液加45μL 灭菌双蒸水混匀，使干涉片段终浓度为8ng/μL。

下面以一对DNA片段为例描述干涉片断退火过程。其退火过程见图2-2：

图2-2 干涉片段的退火 Figure 2-2 Anneal of DNA fragment

干涉片段1 2 μL 2 μL 5 μL 41 μL

干涉片段2 2 μL 2 μL 5 μL 41 μL

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2.2.3 重组载体的构建

2.2.3.1 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大量提取

（1）将含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大肠杆菌接种入盛有200mL LB培养基（含2μg/mL氨苄青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振荡培养过夜（置摇床中160r/min）。

（2）实验前预先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。预冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌悬液，观察菌体生长状况，将菌悬液分装于两个250ml离心桶中，调平。预冷离心机至4℃，4℃下8000r/min离心5min，弃上清，得菌体。

（3）加预冷的溶液Ⅰ50ml于每离心桶，混匀，洗涤沉淀。8000r/min离心5min，弃上清，得沉淀。此步骤的目的为出去培养基，以获得更纯的细菌沉淀物。

（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重悬细菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，温和混匀，室温放置10min，裂解大肠杆菌。

（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌体破碎，释放质粒DNA等内容物。缓慢颠倒数次，防止破坏基因组DNA，室温放置3min。

（6）加30ml预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒数次，防止SDS破坏基因组DNA，冰浴放置15min，使蛋白质沉淀出来。4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液全部倒入新离心桶中。

（7）将上清液在4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液经8层纱布过滤至新离心桶中，以尽量除去蛋白质。

（8）加0.6倍体积（约54ml）的异丙醇，充分混匀，室温放置15min，以沉淀核酸。8000r/min离心15min，小心倒掉上清，敞开瓶口倒置于纸巾上，使残余上清液流尽，晾干。

（9）加15ml水再加15ml LiCl（预冷）混匀，静置沉淀15min，4℃下10000r/min离心15min，以出去蛋白质和RNA。

（10）倒上清于新的离心桶中，加30ml异丙醇，剧烈震荡，静置沉淀15min，在4℃下以10000r/min离心15min。再次沉淀核酸。

（11）弃上清，得到沉淀的核酸。敞开瓶口倒置于纸巾上使残余上清液流尽。 （12）用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下以10000r/min离心5min，弃去乙醇，离心桶敞口倒置于纸巾上，使乙醇挥发殆尽。此步骤可以沉淀DNA。

（13）加2ml无菌水溶解沉淀，将液体吸到10ml离心管中，再吸2ml ddH2O冲洗瓶壁，随后将洗液加到同一10ml离心管中，随后加100μl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA彻底分解。

（14）加等体积含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，

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用微量离心机于4℃以12000转/分，离心15分钟，以回收质粒DNA。

（15）沉淀用3ml70%乙醇重悬清洗，以除去PEG，12000r/min离心8min。 （16）重复上步操作，将离心管倒扣于纸巾上10min，使乙醇挥发干净，加1ml H2O溶解，用等体积酚/氯仿/异戊醇再抽提一次蛋白质，室温下8000r/miin离心10min。质粒DNA溶解于酚相中，中层为蛋白质，下层为氯仿/异戊醇。

（17）小心吸上清与另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，再加0.1体积的NaAC（3mol ，pH5.2）以除去酚，冰上沉淀20min，4℃下10000r/min离心15min，使DNA沉淀出来。

（18）去上清加入3ml 70%乙醇重悬清洗，10000r/min 离心15min，晾干，用500μl无菌水溶解沉淀。

测量OD260/280值及1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。 2.2.3.2 双酶切pRNAT-H1.1/shuttle-RFP载体 反应体系如下：

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP（3.75μg/μL） 2μL HindⅢ （10U/μL） BamHI （10U/μL） 10×buffer tangoTM with BSA dd H2O

反应条件：37℃ 3h, 80℃ 20min 。 2.2.3.3 酶切产物的回收纯化

酶切产物分别经1%的TAE琼脂糖凝胶分离后，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化，按照说明书操作： 试剂盒成分：

（1）纯化套件（吸附柱+收集管）：50套 （柱上含有树脂）。 （2）Buffer B2：30ml。

（3）Wash Solution：12ml，使用前加入48ml无水乙醇，充分混匀。 （4）Elution Buffer：5ml，可以用TE缓冲液或无菌水代替。 操作步骤：

（1）切取含DNA片段的琼脂糖（100mg～400mg）称重，按重量比1：3（切取重量：Buffer B2的体积比）加入Buffer B2。

（2）50℃水溶5-10分钟，胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2-3次，待溶化后将溶液置于吸附柱中， 8000g/分 离心30s，若一次加不完，可分多次离心。

（3）倒掉液体，加入500μL Wash Solution于吸附柱中9000g/分，离心30s，弃液体。

1μL 1μL

2μL 14μL

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（4）重复步骤4。

（5）空吸附柱9000g/分再次离心1分钟，甩干剩余液体以除去残余酒精。 （6）将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10分钟，使乙醇挥发殆尽。

（7）加入15～40μL Elution Buffer（60℃水浴Elution Buffer可提高得率），静置2分钟。

（8）9000g/分离心1分钟，管底溶液即为双酶切后质粒载体。 2.2.3.4 双切载体与干涉片段的连接

使连接反应体系中双切载体与干涉片段摩尔比为1:3，设计反应体系：

退火后干涉片段 10×buffer 双切P1.1载体

dd H2O T4DNA连接酶

P1.1-1 1μL 1μL 1μL 5μL 1μL

P1.1-2 1μL 1μL 1μL 5μL 1μL

负对照 1μL 1μL 6μL 1μL

反应条件：混匀后，16℃，12～16h。

注：以下分别将四组干扰片段构建重组质粒标记为p1.1-1、p1.1-2。 2.2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）从大肠杆菌JM109平板上挑取一个单菌落于3mL LB试管中，37℃振荡培养过夜。

（2）取0.4mL 菌液转接到LB液体培养基中，37℃培养2-3h。(此时，A600应在0.4-0.5之间，细胞数务必＜108/mL，此为实验成功的关键。)

（3）将菌液转移到50mL 离心管中，冰上放置10min。 （4）4℃离心10min（4000r/min）。

（5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽。

（6）用冰冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min。 （7）4℃离心10min（4000r/min）。

（8）倒出上清液，用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞（务必放冰上）。 （9）分装细胞，每200μL一份，此细胞为感受态细胞。[32] 2.2.3.6 连接产物转化感受态大肠杆菌细胞DH5α

（1）从冰箱中取出一管（分装6管，每管100μL）感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

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（2）取两支感受态细胞悬液，各加入5μL上述连接产物，轻轻摇匀，同时设立转化阳性对照组（加1μL pUC19质粒）和阴性对照组（不加质粒）。 转化体系如下：

名称 实验组1 实验组2 空白对照 阳性对照 阴性对照 自连对照

（3） 各组放置冰上30分钟， 42℃水浴中热击90s，迅速置于冰上冷却2min。 （4）向各管中加入1mL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1h，保证恢复细菌正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp）。

（5）将上述菌液4000r/min离心，弃800μL上清后。混匀后取100μL 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h（培养箱中）。、

所加物质 P1.1-1 （5μL） P1.1-2 （5μL） 水（1μL） 原质粒（1μL） E.coli DH5α（1μL） 双酶切后的质粒（1μL）

标记 A B C D E F

2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子

灭菌牙签挑取LB筛选平板上圆滑单菌落，先在预先分隔并标记的另一LB平皿上划板，然后点入制备好的PCR反应混合液，开始扩增。PCR反应条件为：

模 板 10×buffer

dNTP（10mmol/L） 正向引物（载体通用引物） 反向引物（载体通用引物） Taq酶（2U/μL） ddH2O

单菌落 2.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 17.7 μL

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模 板

10×buffer without MgCl2 MgCl2 （25 mmol/L） dNTP （2.5mmol/L） 正向引物（载体通用引物） 反向引物（载体通用引物） Taq酶（2U/μL） ddH2O

单菌落 2.5 μL 1.8 μL 0.5 μL 1μL 1μL 0.5 μL 17.7 μL

94℃预变性2分钟；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环；72℃ 延伸1分钟，4℃保存，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。划板的平皿于37℃培养12-16h。

2.2.5 测序鉴定重组载体

将小提鉴定结果正确的质粒送交上海生工生物工程技术服务有限司，以载体反向引物为测序引物。将经鉴定后未发生突变的H1.1-1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重组质粒的宿主菌摇瓶扩大培养后，进行质粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。

2.2.6 重组质粒大提的OD值检测

按照优化的碱裂解法大提质粒，稀释50倍后利用Genespec进行OD值检测。

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第3章 结果与分析

3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果

3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒经HindⅢ和BamHI双酶切结果见图3-3，结果显示单酶切产物大小约为6200bp，双酶切产物略小于单酶切产物，与预期结果相符。

6000bp

1.1 kb marker ； 2. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒； 3.HindIII和BamHI双酶切；4. HindIII单酶切

图3-3双酶切pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒

1.1kb DNA ladder ;2. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒3. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP cutted by HindⅢand

BamHI 4. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP cutted by BamHI Fig.3-3 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP digested by enzyme

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3.1.2 目的片段的回收

目的片段回收结果见图3-4 ,结果显示回收产物大小约为6Kb，与预期结果相符。

1 2 3

6000bp

图3-4胶回收质粒片段

1、 1kb marker 2、质粒经Hind Ⅲ单酶切产物3、回收的双切产物

Fig.3-4 Recovery products of linear plasmid

1、1kb marker 2、pRNAT-H1.1/shuttle-RFP digested by HindⅢ 3、Recovery products of p1.1 plasmid digested by double enzymes

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3.2 重组载体的菌落PCR

重组载体菌落 PCR电泳结果见图3-5，结果显示PCR扩增产物,电泳分析发现阳性产物可以扩增出560bp大小的条带，假阳性产物不能扩增出560bp大小的条带,与预期结果相符，可以初步筛选出阳性产物。

1 2 3 4 5 6 7 8 9

600bp

pppppp

500bp

图3-5 重组质粒菌落PCR电泳图

1、100bp marker；2-8、均为单菌落PCR产物,其中2,5为阳性产物 Fig.3-5 bacterial colony PCR screening pRNAT-H1.1/shuttle-RFP recombinant clone

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3.3 重组质粒大量提取

重组质粒大量提取后的电泳结果见图3-6，结果显示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重组质粒大小约为6.2kb，与预期结果相符。

1 2 3 4 5 6

6000

图3-6 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重组质粒大量提取电泳图 1、1kb DNA Marker； 2-3、H1.1； 4、H1.1-1；5-6、H1.1-2 Figure 3-6 recombined plasmid of pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 1、1kb DNA Marker； 2-3、H1.1； 4、H1.1-1；5-6、H1.1-2

重组质粒大提并稀释50倍以后在紫外分光光度仪Genespec上测其OD值，结果见表3.3：

表3.3 重组质粒大提后OD值检测结果

Table 3.3 the OD value result of recombination vector

H1.1-1 H1.1-2

OD260 1.820 1.819 OD280 1.010 1.012 Ratio 1.820 1.793 Conc（μg/mL）

89.35 92.24 25

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3.4 重组质粒测序结果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒测序鉴定结果见图3-7、3-8，结果显示重组质粒的碱基序列与预期结果一致，未发生碱基突变，说明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒构建成功。

重组质粒p1.1-1

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图3-7 重组质粒p1.1-1测序色谱图

Figure 3-7 Chomatography of the sequencing of recombined plasmid p1.1-1

重组质粒p1.1-2

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图3-8 重组质粒p1.1-2测序色谱图

Figure 3-8 Chomatography of the sequencing of recombined plasmid p1.1-1

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讨 论

4.1 菌落PCR鉴定重组

采用菌落PCR鉴定重组质粒，可不必提取基因组DNA，不必酶切，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。

4.2 重组质粒穿梭载体的构建

RNAi技术是一项快速、高效和便于操作的使靶向基因失活的新技术。，据此设计出的siRNA可以使某些特定的基因沉默[33]。实验选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒作为载体。这个载体的特点是含有H1启动子，在此H1启动子的作用是精确的起始和终止转录的过程。将具有茎环结构的shRNA的cDNA序列插入其下游多克隆位点区，通过这样的操作产生的RNA会折叠成shRNA，由于Dicer的作用，生成21bp的siRNA作为介质促发RNAi作用。

在参考了大量文献的基础上，构建、筛选并鉴定靶向mrp1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP穿梭质粒表达载体。并在此基础上做了些调整：为了可以广泛的筛选菌落，采用菌落PCR的实验方法进行初步筛选阳性菌落；利用含Amp抗生素的平板筛选阳性重组子，也起到了大大简化筛选工作的功效[34]。

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结 论

1、传统的碱裂解法配合使用氯化锂、PEG8000，可以快速、高效、优质的提取质粒DNA。实验中得到的质粒纯度约为1.835。

2、采用双酶切切割载体，可保证插入外源片段的方向，并且可以防止载体的自连，提高重组率。

3、通过菌落PCR初步筛选阳性菌落，减少了繁琐的质粒提取过程及大量的酶切鉴定，大大提高了效率。

4、利用含Amp抗生素的平板筛选阳性重组子，简化了筛选工作。 5、经测序检测结果可知成功构建了重组表达载体。

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致 谢

本论文从论文选题、实验设计、技术方法的选择到论文的写作审定，都是在邵淑丽教授的悉心指导和大力支持下完成的。衷心感谢我敬爱的邵老师在学习、生活等方面对我的深切关怀和谆谆教导！

感谢陈微微学姐及全体同学在本实验完成过程中给予我的极大支持与帮助，在毕业设计的这两个月时间内，我学到很多知识与实验技能。我深深地感受到这个大家庭带给我的温暖。在此致以我最真诚的谢意！

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