Microchemi-荧光素酶的检测

Microchemi -荧光素酶的检测

前言

一 生物发光 二 荧光素酶

三 荧光素酶报告基因 四 荧光素酶的检测方法

五 利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光

附成功案例1：中国农业大学生命科学学院检测烟草叶片中荧光素酶的发光 附成功案例2：吉林大学植物科学学院（已购买）

前言

以色列DNR生物影像公司成立于1993年，他致力于为科研工作者提供杰出而专业的支持与服务，现在已有超过10,000套的DNR成像系统应用于全世界的大学、科研院所、政府、制药和生物公司。

2009年，东胜创新成为DNR公司生产的凝胶成像系统全线产品的中国区总代理。三年多以来，经过东胜人的不懈努力，我们在全国范围内取得了良好的销量。同时，DNR凝胶成像系统凭借优异的质量和出色的表现，得到了新老用户的一致认可，成为广大科研工作者的良好伙伴。

其中，特别是MicroChemi化学发光凝胶成像受到众多用户好评如潮 如：中科院微生物所（已推荐并完成动物所老师的购买）

华中科技大学同济医学院（购三台MicroChemi），完成多篇SCI的文章发表

中科院遗传与发育生物学研究所、吉林大学、中国医科大学、东北师范大学、东北农业大学、北京康为世纪生物科技有限公司等高校、科研单位和生物制药公司

Microchemi+BIS910搭档，兼顾蛋白+核酸检测应用

Microchemi + MiniLumi / LumiBIS搭档，兼顾化学发光+多色荧光/可见光检测应用

除此之外，面对一些进行植物或使用荧光素酶检测的用户，我们还自豪的说—Micorchemi可完成这项检测。下面请看详细内容：

北京市海淀区上地信息路12号中关村发展大厦二层E座︱销售热线：400-818-2168︱客服热线：800-810-8897 电话：010-51663168 ︱ 传真：010-82898283 ︱ http://www.eastwin.com.cn ︱info@eastwin.com.cn

一 生物发光

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。

它与荧光的区别在于

荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。 发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。

二 荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。目前,以北美萤火虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+ 、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580 nm 的荧光,其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。

三 荧光素酶报告基因

报告基因（report gene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。

1 常见的报告基因：β‐半乳糖苷酶（β‐Gal）、葡萄糖醛酸酶（GUS）、绿色荧光蛋白（GFP）、

分泌型碱性磷酸酶（SEAP）、荧光素酶（LUC） 2 报告基因简单实验流程

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构建包含有报告基因的质粒 将构建好的质粒转染细胞 提供相应的刺激（诱导） 检测报告基因 数据分析 3 荧光素酶作为报告基因的优势：

? 内源性低，植物无内源性表达

? 荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响 ? 发光检测，检测方便

? 灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子 ? 检测范围广，大于7个数量级

正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，没有激发光的非特异性干扰，信噪比较高，具有其他报告基因不可替代的优势。

四 荧光素酶的检测方法

依赖生物发光特性,利用闪烁计数器( scintillation counter) 对荧光素酶的活性作出定量检测。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测，如DNR的Microchemi。

五 利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光

准备阶段：构建包含有luc（荧光素酶基因）和目的基因的载体，

将构建好的质粒转染细胞

提供相应的刺激（诱导）

试验阶段：

1 打开MicroChemi，相机开始制冷

2将植物叶片喷加发光底物（喷底物的过程需遮光） 3 将样品置入MicroChemi暗室室温孵育5-10min 4 打开MicroChemi软件，设置拍摄参数

5利用binning3x3，每10分钟曝光一次，共曝光三张 6添加伪彩，调节照片的对比度，得到最佳照片

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附成功案例1：中国农业大学生命科学学院院长实验室

MicroChemi2.0检测转基因烟草叶片中荧光素酶的发光 条件：分别为曝光10、20、30min，binning3x3（Fig1、2、3）

对比：Berthold Night OWL Ⅱ LB 983；Andor Tech，ikon-L936（Fig4） 结论：达到相似结果，但金额远低于Berthold和Andor！！

Fig1 Fig2 Fig3 Fig4

附成功案例2：吉林大学植物科学学院（已购买）

MicroChemi4.2检测拟南芥叶片中荧光素酶的发光 条件：曝光10min，binning3x3 对比：GE LAS4000 Min

结论：比GE效果好，但金额低于GE LAS4000 Min！！

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ib5r.html