分子生物学实验理论与操作教程

分子生物学实验理论与操作教程

分子生物学实验理论与操作教程

中国农科院研究生院 中国生化及分子生物学学会 植物病虫害生物学国家重点实验室

二零零四年七月

目 录

前 言-----------------------------------------------------------I 第一部分 核酸提取----------------------------------------------1 实验一：基因组DNA提取--------------------------------------------1 实验二：总RNA提取------------------------------------------------3 第二部分 亚克隆技术---------------------------------------------8 实验三：质粒DNA提取----------------------------------------------8 实验四：DNA片段的酶切--------------------------------------------9 实验五：DNA片段的酶修饰-脱磷-------------------------------------12 实验六：DNA片段的连接--------------------------------------------13 实验七： DNA片段的回收-------------------------------------------15 第三部分 PCR技术-----------------------------------------------18 实验八：PCR产物的克隆技术----------------------------------------18 八．1：T-载体构建 ---------------------------------------------19 八．2：PCR产物的T-载体克隆------------------------------------20 八．3：PCR产物的平端克隆技术----------------------------------21实验九：RT-PCR技术-----------------------------------------------21 实验十：定量PCR -------------------------------------------------25 第四部分 文库构建技术------------------------------------------29 实验十一：mRNA的提取及纯化 --------------------------------------29 实验十二：cDNA文库构建技术- cDNA 链的反转合成--------------------32实验十三：1,cDNA文库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染----------34 实验十三：2,RACE技术---------------------------------------------36 第五部分 核酸杂交技术-------------------------------------------40 实验十四：DNA探针的标记------------------------------------------40 实验十五：Southern杂交技术---------------------------------------44 第六部分：基因及基因产物检测技术----------------------------------48 实验十六：DNA的测序技术------------------------------------------48 实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译-------------------------53 2，基因的诱导表达-----------------------------54 实验十八：报告基因的应用------------------------------------------57 实验十九：Western杂交技术----------------------------------------58 第七部分 基因表达轮廓技术---------------------------------------67 实验二十：DD-PCR技术---------------------------------------------73 实验二一：SSH技术------------------------------------------------74 第八部分：遗传转化技术-------------------------------------------75 实验二二：感受态细胞制备-----------------------------------------75 实验二三：重组基因的转化及筛选------------------------------------77 实验二四：原生质体分离--------------------------------------------78 实验二五：农杆菌转化技术------------------------------------------79 第九部分：分子标记技术--------------------------------------------80 实验二六：RFLP技术-----------------------------------------------86 实验二七：RAPD技术-----------------------------------------------86 实验二八：AFLP技术-----------------------------------------------87 实验二九：SSR技术------------------------------------------------89 第十部分：细胞技术-----------------------------------------------89 实验三十：细胞凋亡------------------------------------------------89 十一：附录 一----------------------------------------------------92 二-----------------------------------------------------96

１

第一部分 核酸提取 目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分已知的寡聚核苷酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利用PCR、RT- PCR及RACE技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或CDNA文库，再用探针从相应文库中钓相关基因。本部分主要介绍基因组DNA的提取纯化，RNA提取纯化等实验方法，其余内容见相应章节。

实验一:基因组DNA的提取 DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。

方法1，基因组总DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。

一：仪器 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪

二：试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液 三:操作 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织) 液氮,研碎

10ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热),

加入等体积氯仿, 65℃放臵30分钟，

间隔5－10min轻摇一次,

离心(12000-15000rpm, 15min )

上清液

静止下

0.6体积冷异丙醇,

0.1体积3MpH5,2乙酸钠,

挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空干燥, 2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA 等体积酚/氯仿,氯仿抽提

２

（轻轻混匀、冰浴沉淀5min，5000RPM离心5min，取上清）

上清液

2V无水乙醇、1/10VnaAC, -20,2或-80℃，30min

10000RPM,10min 沉 淀

70%冷乙醇洗涤 真空干燥

干粉-20℃保存，

或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20℃或4℃保存

四：鉴定

所提DNA进行Agarose胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶成像系统拍摄。 注意:

1,裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解 2，酚一定要碱平衡

3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解 4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.

5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。

7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取.

方法二：细菌基因组DNA的微量提取法 本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分 一：仪器：同方法一

二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；

20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇

三：操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀

溶于500μl TE缓冲液中混匀

30μl 10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时

３

100μl NaCL(5M) 混匀

80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃ 10min（可不做） 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，

离心12000rpm,4-5min

取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。

注意 １，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。

2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,?可以获得较为完整的DNA分子。

方法三：酵母菌基因组DNA的提取 一：仪器：同方法一

二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20％PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前 三：操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，12000rpm,1-2min 沉淀

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr 离心，12000rpm,8-10min 沉淀

溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr

加入1.2ml的CTAB/NaCL,200μl20%PVP 混匀 65℃,30min

等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀, 离心,12000rpm,4-5min

上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。

实验二： 总RNA的提取

完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；

４

2),直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

方法一:总RNA的试剂盒快速提取 一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。 一：仪器 恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽 二：试剂 RNA提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇 操作步骤

(一):细胞或组织破碎

A:微生物材料 １：发酵３－４天(或对数生长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)

２：用经DEPC处理的水洗菌丝体２－３次，并尽量除去残存的水 ３：加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA

４：研磨后的样品转移至１２ml变性液的容器中匀浆。

B:动植物细胞培养材料(适用的样品量为细胞:108) 1:细胞或组织培养:按常规方法进行 2:深层悬浮培养细胞的破碎:

(1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液臵于无菌离心管中,4℃,3000g离心5?分钟

(2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1〓PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3000g离心5分钟,

(3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆

3:表面培养细胞的破碎:

(1)确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108

(2)细胞收集:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶

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中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大.

(3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次.

(4)将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞.

C:植物组织破碎(适用的样品量为0.05g组织)

(1)将600ul变性液臵于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟. (2)将0.05g新鲜组织用液氮冰冻 (3)在液氮下,研磨组织块

(4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中. D:动物组织破碎(适用的样品量为1克组织)

(1)将12毫升变性液臵于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟. (2)在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎.

注1:研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。 2:变性液及相应的离心管需预冷

(二):RNA的抽提 在经变性液匀浆的细胞或组织600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混

匀，可用漩涡振荡器

600ul酚\\氯仿\\异戊醇(25\\24\\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒 冰裕中10-15分钟, 离心,4℃，10000g,20分钟

上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA 离心4℃，10000g,20分钟

沉淀RNA,冷冻干燥15分钟 , RNA沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡(有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短)

60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器

600ul酚\\氯仿\\异戊醇(25\\24\\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒 冰裕中10-15分钟, 离心,4℃，10000g,20分钟 上层水相吸至无菌离心管中

等体积异丙醇二次沉淀(-70℃,30分钟),７５％乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA酶的水中(对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，－７０℃保存。)

注：1变性液组成：25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mMβ-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。 2酸性酚配制：55℃时，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠，混匀，静止分

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层后，去上清，再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠,直到pH<4.1。 方法二:氯化锂法提取总RNA 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。 仪器：同上 试剂： 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】 悬浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 其余同上

操作步骤： 1：对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中 2：匀桨液在0－4℃放臵4小时后，12000g离心30分钟

3：取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2 4：沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放臵15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟 5：取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放臵1小时，5000g离心。 6：70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。 方法三：蛋白酶－热酚法 本方法适合于病毒RNA的提取

仪器：同上

试剂：蛋白酶K（终浓度50ug/ml）

2〓缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6) 0.2MnaCL 其余同上

操作： 1，提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟

2，加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。 3，离心，取上清，氯仿抽提一次

4，取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放臵1小时，5000g离心(10000g,10min)。 5，70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

6，RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。

上面介绍了一些核酸（DNA、RNA）提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作

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一定的修改。以下一些原则和建议对核酸提取的操作可能会有一定的裨益。

1：在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。

2：有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50－60℃，并将反应时间缩短到15－25min，但酶用量必须提高10－20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。

3：许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。 4：许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法

（1）CTAB多次抽提。

（2）在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。

（3）在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

5：在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。

6：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。

7：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。 8：在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－70℃下>30min;－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。

9：在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储

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藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

10：核酸提取后可通过PCR 、RT－PCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。有关这些内容在下面各篇幅中会详细介绍。

第二部分：基因克隆技术 目的基因的克隆是分子生物学实验中的核心内容，起着承上启下的作用，通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实现基因重组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基因克隆技术主要包括载体的获取、酶切、脱磷、连接和转化及筛选、鉴定等内容。本部分将介绍除基因鉴定外的其他内容。

实验三：质粒DNA的提取和纯化

整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此过程中携带外源基因的工具为载体。载体有1）在宿主细胞中具独立复制能力；2)带抗性等选择标记；3)有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片断长度的外源DNA而不影响自身复制的特点。目前经基因操作已构建了一大批适合不同宿主细胞，有不同选择标记的克窿载体或表达载体。这些载体有以下几类：1)宿主为大肠杆菌的细菌质粒、Lamda噬菌体、噬菌粒、噬菌体M13、拈粒和卡粒等；2)宿主菌为酵母的以酵母人工染色体克隆系统（YAC）为代表的酵母菌质粒载体及酵母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体；3)以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体；4)宿主为植物细胞的Ti质粒、植物病毒及带有真核启动子的改造质粒；5)动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。在上述所有载体中通用型大肠杆菌质粒载体因具有通用引物序列、多克隆位点区具极多的内切酶特异序列、许多具α互补性质等特点而成为最基本的通用克隆载体。

在克隆操作中往往都是将待克窿片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆位点区，或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。大肠杆菌质粒多为一些双链、环状的DNA分子，其大小范围从1Kb-200以上Kb不等，它们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。

质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒DNA的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒DNA提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮沸法，SDS法，碱解法,Triton-溶菌酶法等。质粒DNA的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等，但由于目前所用质粒的复制量极大，小量常规

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制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及探针标记等方面的工作需要。在质粒DNA提取中，质粒DNA的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验发现,下列培养方式能获得较好的结果：

1培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌 2培养菌应在37℃,220rpm下,生长16-18小时 3不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。 下面介绍几种质粒DNA提取的方法：

方法一: 碱解法提取质粒DNA

－本方法适合于质粒DNA的微量提取

一：仪器

超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪 二：试剂 １：Solution Ⅰ 50mM 葡萄糖,

25mM Tris-HCl(pH 8.0)

10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌，4℃保存 ２：Solution II 0.2M NaOH, 1% SDS, 现配现用

３：Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存 ４：3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4℃保存 ５：氨苄青霉素 50mg/ml, ６：溶菌酶

７：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1) ８：异丙醇 ９：LB培养基 10:电泳试剂见附 11:TE缓冲液 三：操作步骤

含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜 │ 吸取1.5ml

离心，5000rpm,1min

沉淀

( 充分去除LB培养液)

加入预冷的100ul Solution Ⅰ,充分振荡悬浮 加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min, 加入150ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min 离心,12000g,5min 取上清

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酚/氯仿/异戊醇、氯仿各一次，离心 5000g 5min

上清

0.6体积的异丙醇,室温,5min, 离心,12000g,,5min 沉淀 冷冻干燥

悬于50μldd水或TE

RNA酶至20ng/ul37-65℃，30-60分钟(可不做)

酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀（-70℃，15min/-20℃,2 hr） 离心 10000g，5-10min

沉淀― 冻干―――― 复溶

-20℃保存───┴───电泳鉴定

注１：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解

２：试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。

３：试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。

4：如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留；C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。

质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进行氯化铯梯度离心，或直接采用试剂盒提取。

另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、高浓度的质粒DNA

如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA

实验四： DNA片断的酶切技术 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。而对于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。

本部分实验主要通过EcoRⅠ，Hind III两种限制性内切酶对λDNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术 一：仪器： 离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪 二：试剂

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EcoRⅠ,Hind Ⅲ,λDNA/HindⅢ及λDNA/EcoRⅠ 标准 质粒（或其他DNA样品）（浓度> 0.5μg/μl） TAE缓冲液 三：操作

(一)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切

1, 取２支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入 Ａ(μl) B(μl)

灭菌水 １3 １3 EcoR Ⅰ缓冲液 ２

Hind Ⅲ缓冲液 ２ λDNA （或质粒DNA ） 4 4 EcoR Ⅰ １

Hind Ⅲ １ 总体积 ２０ ２０ ２，37℃保温１－4小时

3，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提) 4，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳 （二）EcoR Ⅰ、Hind III双酶切

1,取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂 加入试剂 体积（μl） 灭菌水 1２ MULT buffer 2 λDNA（或质粒DNA） 4 EcoR Ⅰ １ Hind Ⅲ １ 总体积 2０ ２，37℃保温１－２小时

３，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提) ４，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳

注意：１，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒， ２，加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀

３，反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时，应将体积控制在20－30ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于５％，而此浓度将抑制内切酶活性。

4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE

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缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。 5，本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法

a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCL及第二种酶，继续保温。

b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。

C:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。

在上述3种方法中遇到最多的可能为C

6，在水解结束灭活酶时可采用65℃加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。

有关DNA限制性内切酶使用中的一些其他问题可参见附录。

实验五:酶切片断的脱磷技术 在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5'磷酸基团，而DNA的脱5'磷酸基团是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3’端为羟基、5’端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而5’脱磷后,载体在5’与3’位均为羟基不能自连只有与带5’磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的5’端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。 一：仪器 离心机 恒温设备 真空干燥机 取液器 二：试剂

碱性磷酸酶、λDNA酶切片段、酚、氯仿、0.5M EDTA(pH 8.0) 、SDS、 TE缓冲液、电泳缓冲液、7.5M NH4AC(pH 7.5) １０〓碱性磷酸酶缓冲液： 10mM ZnCL 10mM MgCL

100mM Tris-HCL(pH 9.0) 三：操作 １：在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入

10〓碱性磷酸酶缓冲液 10μl 碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1-2ul ddH2O 到 100ul

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对于5’突出则37℃下温浴30分钟,再加入1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37℃下温浴30分钟.

对于平末端或3’突出末端,则37℃下温浴15分钟,56℃下温浴15分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37℃下温浴15分钟. 56℃下温浴15分钟 ２：温浴结束后加入EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为10mM，65℃加热20min，以灭活碱性磷酸酶 ３：用酚、氯仿各抽提一次

４：加入1/2体积NH4AC，充分混匀，再加入２体积的乙醇，－20℃放臵2hr（或－70℃30分钟），12000g离心10分钟，沉淀DNA。 ５：冷70%乙醇洗沉淀一次

６：TE溶解（终浓度为100μg/μl），-20℃保存 四:检测 将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,,连接反应后,Agarose电泳分析,脱磷片断不能连接,而非脱磷对照片断能连. 注：1, pmol ends=3.04〓ugDNA/DNA的碱基数

2，在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M的NH4AC，如用pH5.2的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连接反应。

3,碱性磷酸酶有两类BAP（细菌碱性磷酸酶）和CIP（小牛肠道碱性磷酸

酶），因BAP耐热，灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在68℃10％SDS条件下级可灭活，因此实验中一般都采用CIP。

实验六: 基因的重组连接技术 DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和T4DNA联接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA联接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与DNA片断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在AFLP、文库构建、PCR片断的克隆等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的T－载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。下面拟通过T4DNA联接酶对酶切片段的连接

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操作，使学员掌握这一DNA片段的连接操作技术。 A：溶液中连接 一：仪器 离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器 二：试剂 T4DNA联接酶

10〓T4DNA联接酶缓冲液

200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT 500μg/ml ／牛血清白蛋白(可不用)

λDNA/HindIII 酚/氯仿、 酚、氯仿、TE缓冲液、电泳缓冲液、3M NaAC(pH 5.2)

三:操作： 1:取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液 T4DNA联接酶缓冲液 1ul 载体DNA片断 1ng 插入目的片断 Xng

连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u) 加无菌水到 10ul

X=目的片断与载体片断的分子比例〓载体ng数〓目的片断的碱基数/载体ng数

（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1） 2:连接反应

22℃保温3小时或4℃过夜(Promega连接酶,粘端连接) 或22-26℃1hr(BRL连接酶,粘端连接) 或22℃4-16hr(Promega连接酶,平端连接) 或14℃16-24hr(BRL连接酶)

B：胶内连接：该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外源DNA片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入缓冲液、载体DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因组片断也可为PCR片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的DNA量、载体量及酶量都要增加。 一：仪器：同A 二：试剂：同A 三：操作 1：低熔点琼脂糖胶分离外源DNA片断，在紫外灯下切下目的片断

2：65℃保温彻底溶化琼脂，取18ul（约0.1-0.5ug）于一新管内再加入2ul载体（约0.01-0.05ug）混匀，37℃5－10min

3：配制2〓T4DNA连接酶反应体系20ul，（其中含2〓T4DNA连接酶缓冲液和不低于2uT4DNA连接酶）混匀，点动离心后臵于冰浴

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4：将预冷的2〓T4DNA联接酶反应体系20ul加到“2”中含待连接DNA样品管中立即混匀后立即臵于冰浴中待凝固 5：臵于12℃连接过夜。

6：此连接片断可直接用于转化，即转化前65℃溶化，取5－10ul转化。 注1：粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应>0.5ug。拈连时温度可在4℃过夜，而平连时最好在12－16℃过夜 2：用于转化的连接片断最好不要冰冻

3：胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。

4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。

实验七: DNA片断的回收技术 目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断；回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等，下面分别介绍树脂、微量柱及液氮冻冻融回收技术。

方法一：树脂回收技术 本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。 dsDNA长度 bp 200 1500 300 200 75 50 回收率% ≥ 60 96 99 69 3 2 一：仪器 离心机 电泳议 电泳槽 取液器 微量真空装臵 抽滤装臵 二：PCR片断纯化试剂盒 80％异丙醇 三：操作

（一）从琼脂糖介质中纯化DNA片断

1:用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为TAE.

2:在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 (约300毫克)

3:如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行,如为低融点琼脂,则安B步骤进行。

A：将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,加入1毫升纯化用树脂,

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然后将其臵于65℃水浴保温5分钟,或保温至琼脂完全溶解。

B： 将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,然后将其臵于70℃水浴保温至琼脂完全溶解,然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中,将其混合20秒,但不要振动。

4:为每一个待回收片断准备好一个微量柱. 在每个柱的开口处,联上一针筒,然后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连

5:在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物,打开真空装臵,将树脂与DNA的混合物抽到 微量柱中,断开真空装臵与柱的连接。

6:洗柱,加入2毫升80%的异丙醇,打开真空装臵,使这些洗柱液完全流经微量柱。

7:继续真空30秒以干燥树脂,注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空,移去针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10000g离心2分钟,以彻底除去残存的异丙醇。

8: 将微量柱,再转移至一新的1.5毫升微量离心管中,加入50微升水或TE缓冲液,静臵1分钟(在头30秒,DNA仍将吸附于柱上), 10000g离心20秒,以洗脱DNA片断，所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20℃保存。 注：1对于>3Kb的片断在纯化回收时,洗脱前,如先将水或TE缓冲液预热到65-80℃,则将能有效的提高回收率。待洗脱片断>3Kb时,洗脱液温度应为65-80℃;待洗脱片断>20Kb时,洗脱液温度应达80℃。

2应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。

3：在取用纯化柱树脂中的液体前,应将树脂充分搅匀,如树脂中出现结晶或结块,则应将树脂在25-37℃,温热10分钟,冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。 4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。

PCR回收示意图

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（二）尿素丙烯酰胺变性胶中分离DNA片断

1:从变形胶上切下待回收片断,将其放如一微量离心管中。 2:加入100微升TE缓冲液,37℃保温30分钟以上。

3:将上清液吸入一新管中,加入1毫升树脂,振荡20秒以混匀树脂与清液 4－8:同（一）中“4－8”。

方法二：微量柱法纯化DNA片段

本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收 一：仪器：同方法一

二：试剂：微量柱、其它试剂同方法一 三：操作：

1：紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中 2：离心管在－20℃冷却5－10分钟

3：将微量柱下套上一Epphendof管，将冷却的胶条装进微量柱中，4℃ 12000rpm离心10分钟

4：弃微量柱，用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次 5：1/10体积乙酸钠＋2体积无水乙醇沉淀2小时 6：70％乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于dd水或TE中 方法三：液氮冻融法 一：仪器 同方法一

二：试剂：液氮，其余同方法一 三：操作：

1：紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中

2：离心1min，加入500ulTE，200ul酚/氯仿混匀

3：离心管放入液氮中10－15min，再室温放臵，反复冻融 4：用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次 5：1/10体积乙酸钠＋2体积无水乙醇沉淀2小时 6：70％乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于dd水或TE中 方法四：从变性PAGE中纯化DNA片断的常规方法 一：仪器：同方法一

二：试剂：PAGE电泳试剂 TE 无水乙醇 70％乙醇

洗脱缓冲液I（10mM Tris-HCL pH 8.0 0.1Mm EDTA pH 8.0）

洗脱缓冲液II（0.5MNH4AC 10mM Tris-HCL pH 8.0 0.1Mm EDTA pH 8.0） 三：操作：

1：PAGE电泳，如EB染色的则在紫外灯下切下目的片断，如龈染或其他非放染色的则在关下切下目的片断

2：用少量脱缓冲液I将目的片断胶条洗至一Eppendorf管中，用玻棒将凝胶捣碎，用150ul洗脱缓冲液II将玻棒上的凝胶洗至Eppendorf管中 3：振荡后臵于37℃3－5小时或过夜

4：振荡后离心（10000g10min），取上清液，并再用200ul洗脱缓冲液II洗

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涤旧管，离心再取上清液

5：合并两次上清液，乙醇＋醋酸钠沉淀同前。

第三部分：PCR技术

实验八:PCR扩增产物的克隆技术

利用各种PCR技术扩增特异DNA是获得目的基因和特异探针的一种最有效、最简便的方法。但PCR扩增出的片断如不经进一步克窿是无法变成可利用基因，因此PCR扩增产物的克窿技术是DNA重组技术中的一个最重要部分，该技术是目前分子生物学实验中最重点内容，要综合前面实验中所介绍的各种技术，起着承上启下的作用。PCR产物的克隆一般要经过PCR产物的纯化、产物与载体的酶切、脱磷及连接、转化、筛选等几个步骤实现。PCR产物与载体的连接方式有实验八中提到的溶液连接和胶内连接，可粘连、平连、粘平连及与T－载体的单位点配对连接（见图9－1）。

PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物 （上下游引物中各带 （上下游引物中仅有 （上下游引物 （PCR产物与载体 一种特异酶切位点） 一种特异酶切位点） 中无酶切位点） 均有两个酶切位点 但只有一个是相同的） PCR产物 纯化回收

PCR产物及载体 PCR产物单酶切 PCR产物Klenow酶补平 PCR产物与载体 T－载体 双酶切，载体脱磷 载体双酶切、脱磷 载体用平末端酶切割 双酶切载体脱磷 单碱基

粘连 粘连, Klenow酶补平 载体脱磷后平连 粘连 Klenow补平 粘连

后平连 或加接头粘连酶补平 平连

八－1：PCR产物克窿方式示意

粘连时载体与外源DNA的比例1：3比较合适，而平连时可达到1：10

在这些方法中，T－载体技术比较简便有效的，尤其对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用。该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，即能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。通用载体的T-载体有商品出售，一些特殊载体的T－载体可自己制备。T-载体均是通过载体是通过用EcoRⅤ或SmaI等平末端酶将相关载体切割出平端,然后再在其两个3`端加上T而构成的。这些存在于插入位点的突出的3`末端可防止载体的自身环化,并为PCR产物提供碱基配对区（因PCR扩增产物的3`末端为非特异性的A碱基）而有效地提高了PCR扩增片断的克隆效率。

本实验中用pGEMR-T载体为材料，来让学员学习T－载体克窿技术。PGEM－T载体来自于PGEM系统载体，这类载体中中含有T7和SP6RNA聚合酶的启动子系列,该系列侧翼为一多克隆位点区,该区有β-半乳糖苷酶的α-肽端的编码区。β-半乳糖苷酶的α-肽编码区的插入失活,能使重组子在指示平板上通过颜色反应加以检测。此两个载体的多克隆位点区含有多种内切酶位点,此很容易来构建嵌套缺失位点。pGEMR-T Easy载体系统的多克隆位点两侧都存在

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EcoRⅠ、BstZⅠ、NotⅠ,因此该载体可通过这三类酶进行单酶切构而建重组片断; 而pGEMR-T载体系统的多克隆区两侧都有BstZⅠ酶切序列,因此用此酶进行单酶切操作,即可释放出可插入位点。除了单酶切外,这两类载体都可通过双酶切操作来形成插入位点。pGEMR-T及pGEMR-T Easy载体系统中都有嗜菌体f1的复制起始区,借此可以合成单链DNA。并可用双重反向启动子(T7,SP6)进行体外转录。在 pGEMR-T系列载体系统中,外源片断的克隆将打破载体中的β半乳糖苷酶的编码序列,因此重组子可在指示平板上用颜色反应加以筛选。将外源片断克隆到pGEMR-T载体中,然后再转入感受态细胞,这样在指示平板上蓝白斑的比例将下降,在通常情况小,外源片断的插入将产生白斑,但在某些情况小,含重组子的载体也能形成蓝斑,这主要是插入片断长度(包括3`A突出末端)为3`核苷酸的倍数,且插入位点在lacZ基因的阅读框内,并插入片断不含终止密码子。这样就可能不破坏阅读框而翻译出含β半乳糖苷酶N端多肽片断的融合蛋白,与宿主菌的C端片断发生α-互补而形成蓝斑。有文献报道当重组的外源DNA片断接近2Kb时,其可能会克隆到阅读框,并产生蓝斑。即使实验中预设扩增片断并非3`核苷酸倍数,但扩增过程可能会导致核苷酸突变(缺失突变或点突变),这种片断与 pGEMR-T系列载体重组后,再转化到感受态细胞中后,即有可能产生蓝斑。这点已有文献报道，因此在筛选重组菌斑时要特别注意。

实验八.1：T－载体的构建 一：仪器：同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验

二：试剂：SmaI、其余同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验 三：操作：

1：提纯载体DNA

2：将1ug提纯的PGEMDNA用SmaI1ul进行全酶切（为了切割彻底、甚至能破坏酶切位点周围碱基序列而防止自连发生，酶可过量使用，并在25℃过夜） 2：酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶 3：在上述酶切反应后复溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入 10〓 PCR缓冲液 5 ul 10mM dTTP 10 ul 1mg/ml BSA 10 ul 5U/ul Taq酶 0.5ul 加水至50ul

70℃2小时，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶 此载体即可直接用于PCR产物的克隆。

实验八.2：PCR产物的T－载体克隆 一：仪器

同连接、转化实验 二：试剂

T－载体，其余同连接、转化实验

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三：操作：

1:PCR产物的纯化见实验八

2：PCR产物的克隆用自制或购臵的T－载体按下述比例进行连接反应

反应体系 阴性对照体系 背景对照体系 10〓T4DNA连接酶缓冲液 1 1 1 T－载体 1 1 1 PCR产物 X(计算见附) 0 0 阴性对照DNA（500bp 4ng/ul ） 0 2 0 T4DNA连接酶（3u/ul） 1 1 1 加水至10ul 3：4℃过夜

4：T－载体与外源片断连接后的转化见实验二二与二三 附：连接反应中PCR产物用量的确定 1：待重组片断与载体间的最佳分子比

T载体与待克隆的对照DNA间的最佳分子比为1:1。一般分子比从1:8到8:1都是适合的。如果在实验开始前,没有确定载体与待克隆片断间的最佳分子比,那么有必要在实验时将最佳比给确定下来。3:1-1:3的比值在大多数情况下都能得到较好的实验结果。PCR扩增后的片断其浓度在实验时也必须确定,确定其浓度的方法为或通过凝胶电泳后对待测片断与一系列成梯度的已知浓度的DNA相比较而确定,或可通过比色法确定。

2：连接反应中待扩增片断的用量可通过下列公式计算 X=A〓B〓D/C a=载体的ng数、b=待克隆片断的碱基数Kb、c=载体碱基数Kb d=待克隆片断与载体分子比（根据附1确定）、x=连接反应中待扩增片断的用量 3用pGEMR-T系列载体系统生成单链DNA方法 要诱导单链DNA的生成,应用特定的辅助嗜菌体去感染含pGEMR-T或

pGEMR-T Easy载体的菌体。质粒进入f1嗜菌体的复制区,使得单链DNA象存在于包装蛋白内的病毒颗粒一样被分泌出来。这种单链DNA很容易通过沉淀和抽提方法加以提取和纯化。

注：1：在室温下,缩短保温时间,也可能是有效的操作方法,但这有可能降低克隆数。最适的连接条件为4℃过夜，因PCR产物与T－载体间的配对碱基少，高温不利于连接的进行。经验表明如连接反应高于15℃，则兰斑数大大升高，可能T载体中存在没有加上T的载体，高温下平端自连的比例增加。 2：连接酶最好用相关的经修饰纯化的T4DNA连接酶,因其他连接酶可能具核酸外切酶的活性,这样如用这种酶就有可能导致对载体3’T产生切割。

3：T4DAN连接酶的10〓缓冲液中含ATP,在温度频繁波动时,此成分有可能被降解,因此要避免仅为了少量使用而对缓冲液反复冻融。如果在融化后的

T4DAN连接酶10〓缓冲液中出现沉淀,则应将此缓冲液振荡,以使沉淀复融。 4：重组T载体转化时最好用SOC培养基,LB培养基也能用,但转化数可能低。

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5：因含β半乳糖苷酶的菌落生长速度慢于无此酶活的菌落,因此保温过夜后,蓝斑菌落要远小于白斑菌落,白斑菌落的直径近1毫米。

实验八.3：PCR产物的平端克隆 仪器：同上

试剂：SauI,Klenow片段,T4连接酶

操作：载体提取后用过量SmaI切割，提取、纯化

PCR反应液加热到99℃10 min，灭活Taq酶，补镁离子到5-10mM加入1u Klenow片段，70℃15min。纯化

载体与PCR产物以1：10比例16℃连接过夜

PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。

实验九:RT-PCR技术 目前已有多种方法用来研究有关细胞和组织中，基因表达产物方面的内容，这些方法主要有Northern印迹、RNase保护分析法、原位杂交、点印迹、Ｓ１核酸酶分析法及反转录与PCR扩增串联的RT-PCR技术等。在这些方法中RT-PCR技术具敏感度高和应用范围广的特点，该技术提供给研究人员有效的进行测定转录产物存在与否、评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选cDNA文库的前提下，完成对cDNA片段的克隆。利用RT－PCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径，RT－PCR扩增产物经纯化、回收、与载体重组克窿，即可实现基因的分离。

RT-PCR可由总RNA或mRNA作为模板，该技术目前有多种操作方法 一:两步法：

(一)MMLV、MuLV(莫洛尼鼠反转录酶)，AMV(鸟成骨髓细胞性白血病毒反转录酶)/Ｔaq酶系统:在此系统中，先有反转录酶合成cDNA第一条链,随后灭活反转录酶,有Taq?酶合成cDNA第二条链和进行PCR扩增。

(二)TthDNA聚合酶/Mn,Mg离子系统。在此系统中，TthDNA?聚合酶在不同离子缓冲液中表现为不同酶性质，在Mn离子缓冲液中，该酶表现为反转录酶性质，而在Mg离子缓冲液中又表现为聚合酶性质。因此操作中，先使系统处于Mn离子状态，有TthDNA酶反转录出cDNA第一条链，随后加入EGTA[乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸]鏊合Mn(因Mn?的存在将抑制TthDNA 酶的聚合酶性质的发挥)，再将系统调整到Mg离子状态，有TthDNA酶合成cDNA第二条链及PCR扩增。

二：一步法：

(一)TthDNA聚合酶/Ｎ－二(羟乙基)甘氨酸系统。在此系统中，Ｎ－二(羟乙基)甘氨酸的存在时，Mn离子将不具有抑制聚合酶的聚合活性，因此该酶不需用在中途添加任何试剂到反应系统中，而完成cDNA第一条链－cDNA第二条链－PCR扩增的全过程，但Mn离子的存在虽不会抑制聚合酶活性，且会降低核苷酸渗入的忠实性，因此在要求高度忠实性的实验中,不主张使用该系统。 (二)AMV/Tfl系统。在此系统中cDNA的第一条链的合成有AMV反转录而成，

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而cDNA第二链的合成及随后的PCR则有Tfl聚合酶催化而成。

下面我们就分别介绍二步法中的MMLV/Taq系统及一步法中的AMV/Tfl?系统的详细操作过程。

MMLV/Taq系统进行RT-PCR（二步法） 一：仪器 PCR仪、离心机、取液器、电泳仪 、电泳槽 、紫外观测仪 二：试剂 PCR试剂、Taq酶、dNTP、DDT、RNA酶抑制剂

10〓缓冲液 500 mM KCL 100 mM Tris-HCL (pH 8.3 室温) 15 mM MgCL 0.1% 明胶 三：操作

１：总RNA及mRNA的提取见实验二，十一 ２：cDNA第一条链的合成

（1）变性及褪火

（m）RNA 1-2μg 特异引物(100μg/ml) １μl 补水至10ul

90℃ 1min，50℃ 5min,冰浴

（2）：上述管中按下表加入各反应成分 １０〓扩增缓冲液 ２μl ４种dNTP混合液 ２μl 50mM MgCL2 1μl DTT 1ul

RNA酶抑制剂 ２０单位 MMLV 200单位 加水至 20μl （2）：３７－42℃反应３０分钟

（3）：于９５℃ 加热５分钟，灭活反转录酶 3：PCR扩增

按下表加入：

１0〓扩增缓冲液 5ul dNTP 2ul

上游寡核苷酸引物 10-50pmol 下游寡核苷酸引物 10-50pmol Taq聚合酶 2.5u 加上至总体积 50μl 加矿物油 50μl 4：设定参数，PCR扩增 AMV/Tfl系统（一步法）

在本系统中一个反应管、二种酶系统为分析RNA尤其是衡量RNA提供了灵敏度高、快捷便利、可重复性强的方法。由AMV催化cDNA第一链的反转合

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成;Tfl催化合成cDNA的第二链及进行PCR的扩增反应。该系统提供单一的反应缓冲液体系,而不需要在RNA反转和PCR扩增之间添加其他缓冲液。这样既简化了操作步骤,又降低了RNA模板被污染的可能性。另外该系统的操作

中,AMV的反转温度为48℃,这又在最大程度上防止了RNA二级结构的形成。 一:仪器：同上 二：试剂： 1：同上

2：Access RT-PCR试剂盒 三：操作

１：反转录反应

按下表准备反应液

样品 体积 终浓度 ５〓反应缓冲液 10μl １〓 dNTP混合液 1μl 0.2mM 下游引物 50pmol* 1μm 上游引物 50pmol* 1μm 25mM MgSO4 2μL 1mM

AMV反转录酶 1μl 0.1μ/μl TflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl RNA模板 xμl**

去核酶无菌水 加至５０μl ２：滴加１－２滴去核酶的矿物油

３：在控温水浴或其它设备中48℃保温４５分钟

４：设定PCR参数，PCR循环以合成cDNA第二链及扩增 ５：RT-PCR产物分析

反应产物上１％的琼脂糖凝胶电泳分析结果，对于对照样品，扩增条带为323bp。

６：扩增产物在－20℃保存。

注1：引物，５０pmol＝16.3ng〓b,b:引物碱基数。对于对照样品上下游引物钧取3.3μl；模板，用103－106拷贝量的模板，或1pg-1μg总RNA，对于对照反应，选用对照模板量为2μl(106拷贝量)

2：RT-PCR能否有效地进行,依赖于模板mRNA的完整性和纯度。在操作中必须具备一个无RNA-酶的环境,实验过程中应该用消毒的离心管、吸液头,戴手套,用DEPC处理的水。如果要从核酸酶活性高的样品中分离RNA时,建议使用RNA酶抑制剂。

3：在使用此RT-PCR系统时,为了获得精确的实验结果,要求作模板的RNA,不管是总RNA、mRNA、还是合成的RNA,都要是无DNA的样品。系统中TflDNA聚合酶在系统规定的操作条件下,无反转酶活性,但是如果反应体系中含与模板有同样序列的微量DNA,则该酶会催化扩增出非实验所需的片断。

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4：RT-PCR反应中模板RNA的最小需要量,与模板RNA和引物片断的类型有关,对于系统提供的对照RNA模板,每一反应所需的最小量为10的3次方分子(2.5Zeptomoles，2.5〓10-25mole)。为了使RT-PCR实验能获得较好的结果,要求,对于总RNA作为模板,这在每一反应中其量应为10pg-1μg,而对于mRNA做模板则要求量为1pg-100ng。

5：在RT-PCR实验中,最好进行对照和空白对照反应,在进行对照反应实验时,反应体系中加入试剂盒提供的对照模板和对照上下游引物；在进行空白对照反应时,则采用灭菌的无DNA水代替RNA作为模板,用于反应体系。在实验中要特别注意防止各次实验之间样品与前次实验的残留核酸(DNA或RNA)的交叉污染。每次实验中扩增前的操作步骤应与扩增后的操作步骤最好有相互分开的工作区和取液器具。操作中最好使用能很好防尘的吸头。操作人员要戴上手套,并经常更换。实验中应用UNG或其他灭活技术处理以防止残留DNA被带入反应过程。

6：镁离子浓度

在RT-PCR反应系统中,由AMV逆转录酶和由TflDNA聚合酶催化的两步反应均需要镁离子,而这两步反应中所需的镁离子量且由反应体系中的核苷酸、寡聚核苷酸引物及模板的终浓度决定。反应体系中硫酸镁的使用浓度必须满足模板/引物的综合需求,虽然1-2.5mM的浓度的硫酸镁能基本满足大多数RT-PCR的要求,但镁离子浓度更进一步精确,将使逆转录和扩增过程灵敏度更高、专一性更强、质量更好。为了正确确定反应中所需镁离子的浓度,在正式实验前应先进行一系列平行实验,在这些平行实验中,在50μl反应液中分别加入

1,2,3,4,5,6μl硫酸镁储液(试剂盒所带,25mM),然后比较各实验结果,以确定镁离子浓度。 7：引物设计

在操作中必须用特殊的引物来进行第一链的合成。这种引物与模板上一特定序列煺火,将模板上的某一段mRNA(而非整个样品mRNA)反转成cDNA。对于cDNA和基因组DNA的扩增差异来讲,前者的引物是与外显子而非内显子互补的。基因组DNA的扩增产物要比RT-PCR的产物大许多,这种长度上的差异不仅有助于在胶上将两者分开,而且更有助于cDNA的扩增产物的形成(因PCR在短片断的合成上更具优越性)。引物浓度是RT-PCR中应考虑的另一个引物方面的问题,我们建议开始时的引物浓度最好用50pmol(这样终浓度可为1μM)。 8：模板 温度及循环数

RT-PCR反应中并不要求模板变形,如操作人员想加这一步,则应经模板/引物混合物与其他反应液分开,单独对模板/引物在94℃变性2分钟(AMV千万不能参与变性,否则将失活),然后再将其加入到RT-PCR的其他反应液中,在48℃保温。在AMV/Tfl反应缓冲液中AMV的最适反应温度为37-48℃,我们建议操作温度最好采用48℃,应在此温度下,能最大程度的防止mRNA 的二级结构的形成,从而合成最为完整的cDNA。反转完成后我们建议在94℃保温2分钟,以打破RNA/ cDNA间的二级结构,并灭活AMV反转酶。有报道AMV必须灭活后才能保

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证Tfl等DNA聚合酶进行片断扩增。引物的序列是PCR扩增中各温度设定时首要考虑的因素。常规的扩增过程为变性(94℃),煺火复性(42-60℃),延伸

(68℃),如引物有高的Tm值,则可提高上述的煺火复性(42-60℃)和延伸(68℃)温度,煺火温度越高,非特异性扩增越少,特异性扩增越多。另外如上游引物的Tm低,则应降低煺火复性温度,使引物与模板能很好的煺火。对于PCR循环数我们建议用40个,如模板RNA为稀有RNA,或量很少,则循环数可相应增加到45-50个循环。

实验十：在MJ Chromo4实时荧光系统通过反转录定量（RT-qPCR）对基因表达进行分析

反转录定量PCR(RT-qPCR)具有很高的灵敏性和非常好的动力学检测范围，为基因表达分析提供了一个基准。应用这一技术可以通过荧光强度变化对PCR反应产物进行实时监测。传统的方法，如溴化乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而实时荧光定量技术能够对起始摸板进行定量，与传统方法相比实时荧光定量技术显出了极大的优势。

所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(如图1)。

图1 实时荧光扩增曲线图

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）（如图2所示）。

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图2. 荧光定量标准曲线

CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图3所示）。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图3 阈值线和CT值

对反转录定量PCR而言，就是定义不同处理或者不同组织间某个基因初始转录本的含量，我们可以用含有目标基因和看家基因的质粒做标准品，生成各自的定量标准曲线，再用标准曲线去定量不同样品中的目的基因的表达水平。

定量的试剂包括与DNA双链结合的荧光染料和TaqMan探针、分子信标等特异性的杂交探针。与DNA双链结合SYBR-GreenI(SGⅠ)染料因使用简单而被许多定量实验采用。

SGⅠ是一种特异结合双链DNA的染料，已被证明能灵敏的检测核酸。SGⅠ结合双链DNA后荧光增强1000倍左右，极为适合检测PCR扩增产物。由于SGⅠ能结合于所有双链，因而不能特异性的检测某一特定模板。使用杂交探针要求细心设计引物组，而SGⅠ仅需要两个用于扩增的引物，无需对其进行标记。

DyNAzymesII聚合酶在多种扩增反应中产生了很好的结果。这种由Thermus brockianus中分离出来的聚合酶比Taq酶热稳定性更好，能在广泛的反应条件下保持很好的活性。SGⅠ对DyNAzymesII聚合酶的抑制作用更小。本研究的实时定量PCR结果表明使用

DyNAzymesII聚合酶和SGⅠ能够精确灵敏的检测到λ噬菌体和人类基因组DNA的初始浓度。

材料与方法

材料

1．含有?-actin转录本的RNA样品

CT值

阈值线

2．?-actin荧光检测试剂盒（东胜创新Chromo4装机试剂盒）

2×DyNAmo SGI mix 100μl 5uM ?-actin forward primer 20μl 5uM ?-actin reverse primer 20μl

方法

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Ⅰ定量标准曲线的绘制

34567

1．将含有?-actin基因的质粒做系列浓度稀释，分别为10、10、10、10、10个拷贝。 2．建立15μl PCR反应体系

2 Χ DyNAmo SGI mix 7.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl ddH2O 3.5μl ?-actin标准质粒 1μl 每个样品做２－３个重复

ⅡSYBR Green I荧光染料用于基因表达表达分析

1． 灭菌的微量离心管中加入2ng RNA作为模板，在75°C加热5分钟，迅速置于冰上冷却。 2．每一反应的反应组分如下

MgCl2, 25mM* 4μl Reverse Transcription 10X Buffer 2μl dNTP Mixture, 10mM 2μl Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.5μl AMV Reverse Transcriptase (High Conc.) 15u Oligo(dT)15 Primer OR Random Primers 0.5μg RNA模板 2ng Nuclease-Free Water to a final volume of 20μl

在42°C下 孵育15分钟-60分钟。

3.上述反应液在95°C 变性5分钟，然后在冰上迅速冷却。

4. 建立15μl PCR反应体系

first-strand cDNA reaction 1μl 2 Χ DyNAmo SGI mix 7.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl ddH2O 3.5μl Nuclease-Free Water to a final volume of 15μl

Ⅲ PCR反应

1．打开Chromo4定量PCR仪

2. 将反应管置于循环仪中，进行板设置 3．如下设置程序：

step 1 94 ℃, 2min step ２ 96 ℃, 10sec step ３ 63 ℃, 15sec step ４ 72 ℃, 20sec step 5 plate read step 6 84 ℃, 1sec step ７ plate read

step 8 Goto step 2, 39 more times

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step 9 72 ℃, 10min

step 10． Melting curve analysis: 65 ℃-95 ℃, 0.2 ℃ /read , 1 sec hold step 11． 10℃, forever step 12 开始运行

结果分析

1 绘制熔解曲线

随着温度的升高与双链接连结合的SGⅠ释放，荧光信号也随之平滑的下降。荧光强度随温度变化的负一次倒数也被显示。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）处清晰地看到了一个单一的峰。这个峰对应着扩增产物的熔解温度，表明特异扩增了β-actin。荧光强度随温度变化的负一次倒数图中如没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和假阳性现象。 2 绘制标准曲线

C(t)值（荧光曲线与域值线交叉的点）随着初始模板浓度的增加而成比例的减少，这是因为初始模板浓度高的样品更快的生成足以被SGⅠ检测到的数量的扩增产物。?-actin基因的标准质粒拷贝数与对应的C(t)值成正比，具有极好的线形关系。 3 未知样品中?-actin基因转录本的定量分析

对照标准曲线，依照初始模板量与C(t)的线性关系，可轻松对?-actin基因转录本进行定量。计算每ng总RNA中?-actin的拷贝数。

讨论

实时定量PCR实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，本实验中所做的是对一个样品中基因表达的绝对定量。研究人员在设计实时定量PCR实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最后会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。

本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤： （i） 选择一个内标基因。 （ii） 确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。

（iii） 通过PCR扩增目标基因和内标基因RNA或cDNA的一系列梯度稀释模板确保它们

的扩增效率相同。 -△CT

最后通过2计算将统计数据转化成线性形式而不是原始CT值。

第四部分：文库构建技术 实验十一.：mRNA的提取及纯化 真核细胞的mRAN是单顺反子，其最显著的特征是具有５'端帽子结构和3'端的poly A的结构，此poly A结构为mRNA的提取提供了有效的途径，人们利用碱基配对原理，采用寡聚Ｔ结构作为亲和柱材料，当含mRNA的总RNA样品流经寡聚Ｔ柱时，mRAN即被特异性的结合到柱上，从而可与其它RNA相分开，这就是寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲和柱分离mRAN的原理。目前虽然mRNA的提取已有多种方法，如超速离心法、免疫法，但较常用的、简便的方法还应是柱层析法。不过近几年,mRNA的提取方法又有所改进和突

破,mRNA的磁珠分离即是这些新方法中的一类主要技术。该技术建立于３类强有力的相互作用上，即A与T碱基间的强配对性；链菌素抗生物素与生物素间

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的强免疫作用及稀土元素磁铁与顺磁性物质间的强磁性作用。mRNA的磁珠分离技术提取mRNA的原理主要为用生物素标记的Oligo(dT)与mRNA3'端的poly A退火形成杂交体，然后用带有亲和素(链菌素抗生物素)的顺磁磁珠洗涤并捕获杂交体，形成杂交体－磁珠复合体，最后用磁架将此复合体捕获，这样mRNA即可与其它形式的RNA相分开，进一步用无RNase无菌水洗涤，即可获得纯化的mRNA。

方法一:磁珠法提纯mRNA

一：仪器 水浴 离心机 取液器 分光光度计 二：试剂 mRNA 分离系统试剂盒, 异丙醇， 3MNaAC 三:磁珠法分离mRNA的原理图示如下：

四：操作

（一 ）生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火

１：在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。 ２：65℃加热10min

３：加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20〓SSC于RNA中轻轻混匀，室温放臵，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。 （二）亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗

4：将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒)， 小心去除上清（不用离心方法）用1.5ml0.5〓SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠， 去除上清，漂洗３次。

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5：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5〓SSC中。 杂交体的生成及漂洗

6：将上步\３\中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针，全部加到上步\管中,轻轻混匀，室温放臵10min。每隔2分钟轻轻混匀一次 7：用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。

8：用0.3ml0.1〓SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。

（三）洗涤收集mRNA

9：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。

１0：用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并(约0.25ml)

１1：在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇，－２０℃沉淀过夜，12000g 离心10min,75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

１2：提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260,280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1 .

１3:提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。 方法二:亲和柱层析法提纯mRNA

该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。 一：仪器，层析系统，其他同方法一 二：试剂，

柱材Oliga(dT）－纤维素

上样液：20mM Tris-HCL(pH 7.6) 0.5M NaCL

1mM EDTA (pH 8.0)

0.1% 十二烷基肌氨酸钠（SLS） 洗脱液：10mM Tris-HCL(pH 7.6) 1mM EDTA (pH 8.0) 0.05% SDS 三：操作

1：DEPC处理层析柱

2：0.1M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素 3：用1〓上样液洗柱至pH< 8.0

4: 无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2

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〓上样液，上样，分部收集。

5：1倍体积1〓上样液洗柱，分部收集。

6：OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。

7：2－3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。 8：测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。 9：进行方法一的“11－13”步。

实验十二:cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成 构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲，一是丰度，二是纯度，丰度愈高，纯度越好，合成效率越好。在逆转录酶作用下，以Oligo(dT)或寡聚６核苷酸(随机)为引物，进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成,外加引物合成及臵换合成,本实验采用臵换合成法进行,即在RNaseH作用下，部分降解RNA，再用DNA多聚酶Ⅰ产生的DNA片段取代，以合成第二条链。

一：仪器：恒温水浴,离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪

二：试剂： cDNA合成试剂盒、饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液 三：操作

１：第一链的合成：

a:在灭菌的DEPC处理Eppondef管中,分别加入: 模板 样品mRNA 1μg

引物 (0.5μg/μl) 1μl （6碱基随机引物 或oligdt） 加水至 10μl b:70℃5-10分钟,冰浴冷却5分钟

c:在上管中，根据下表依次序分别加入 5〓第一链缓冲液 4μl 核酶抑制剂 40μ 40mM焦磷酸钠 2μl AMV反转录酶 20 μ 加水至 20μl d:敲打混合,离心后放于37℃或42℃60分钟。

e:反应完毕后,将反应管臵于冰浴。用于第二链合成。

３２

注：引物可为特异引物（构建特异文库）、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物，但不同引物RT时温度不同，前两种在42℃下进行，而随机引物则在37℃下进行。 ２：第二链的合成

a:第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入 2.5〓第二链缓冲液 40μl， DNA聚合酶Ⅰ 23μ RNase H 0.8μ 加水至 100μl

b: 14-１６℃下放臵2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时) c：70℃，10min，点动离心,臵于冰浴

d: 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放臵１0分钟。 e：加入 4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后臵于冰浴上. f: 等体积加入酚\\氯仿\\异戊醇抽上清,12000g，3min。

g: 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠，-20℃30min沉淀,12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。

合成后的cDNA链既可经与一定的通用接头连接后,生成末端序列,也可通过一定的内切酶处理,形成一定序列的末端片断,然后（1）与未端有互补序列的λ臂-DNA连接，形成重组λ-DNA,再经体外包装形成完整λ噬菌体，经转染后,生成噬菌体cDNA文库.（2）与未端有互补序列的质粒载体连接，形成重组质粒DNA, 生成质粒cDNA文库。目前经常使用的一些载体已经商品化,商品化的λ载体主要有噬菌体左右臂、复制原点及启动序列构成,其在连接酶作用下,可直接于具相同末端序列的cDNA互补连接。cDNA末端序列的产生可通过1)可添加核苷酸后酶切；2)直接加商品接头而形成与相应噬菌体左右臂相互补的序列。不同载体有不同的末端序列,有不同的宿主菌,有不同的筛选方式,因此在进行文库包装时,一定要搞清楚这些情况,以有的放矢的进行工作.

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cDNA合成模式图

cDNA文库构建流程

实验十三-1：cDNA链的连接、包装及转染 一：仪器:同实验十二

二：试剂:EcoRⅠ连接子试剂盒 三：操作: 1:cDNA加接头反应 a:按下表准备反应体系

10〓缓冲液T4DNA连接酶 3μl BSA 3μl cDNA 2.5μl 连接子 1μl T4DNA连接酶 1μl

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加水至 30μl b: 15℃保温6-18小时

c:70℃加热10分钟后放臵于冰浴 2:磷酸化反应

a:按下表准备反应体系

上述1.a反应物 30μl T4磷酸激酶10〓缓冲液 4μl 0.1mM ATP 2μl T4激酶(10μ/μl) 1μl 水 3μl 总体积 40μl

b:37℃保温30分钟。用DNA纯化柱纯化带接头的cDNA

c: 用1ml Sephacryl S-400装柱，TEN缓冲液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min

d: 上样,用1mlTEN缓冲液洗柱2次,收集洗脱液。洗脱时加套管，800g5min e：合并洗脱液.

D：3M NaAC和无水乙醇沉淀，干燥复溶 3:cDNA与载体联接：

a:准备4个离心管,按下表加入

A B C D 载体DNA0.5ug/ul) 2

cDNA(10ng/ul) 0 3 2 1 10〓T4DNA连接酶缓冲液 1

水 6 3 4 5 T4DNA连接酶 1 b:保温，室温:3小时;4℃过夜 4:体外包装：

a：从－７０℃取出包装蛋白，冰浴中溶化，每管50ul

b：包装蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的连接液，轻弹管壁，轻轻混匀。

c：22℃（室温）放臵3小时

d：上述包装混合液中加入445ul的phage缓冲液和25ul氯仿，轻轻混匀，冰浴保存。（包装液4℃下可存放7天） 5：感染

a：灭菌培养皿中倒入下层LB培养基，凝固后，37℃保温 b；安1：1000的比例稀释“4”中的包装混合液。 c：取100ul稀释液和100ul菌株（Y1090、LE392）

d：取4ml熔化45℃保温的上层培养基加入到“c”中的混合液中，混匀后铺板在37℃预热的下层培养基上，37℃过夜。

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6：收集和扩增文库

构建的cDNA文库经扩增后，才能保存和进行长期筛选。本文库由λgt11作为载体而构成，因此扩增时应在大肠杆菌Y1090中进行。

a：在过夜后的培养皿上挑取出现的噬菌斑，加2－3mlSM缓冲液，室温震荡２小时。４℃7000g离心30min,以除去细胞碎片，分装上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速离心10min，以除去细胞碎片和培养基成分。 b：重复上步操作

c：上清液转入一新管 中，如要在4℃短期保存则按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要长期保存则应加入终浓度为７％的二甲基亚砜，于－70℃保存。以被需要时重新涂板筛选文库。?。

总结：C文库构建的简单流程为： RNA－mRNA－cDNA单一链的合成－cDNA单二链的合成－加接头－与载体连接－体外包装－转染－筛选文库（实验二－实验十一－实验十二－ 实验十三－1）

实验十三-2:RACE(Rapid Amplification of mRNA Ends by PCR)

技术扩增构建全长cDNA文库

上面介绍的cDNA文库构建技术,是一种经典技术。但由于1，在以mRNA模板进行逆转录过程中，逆转录酶在从模板mRNA中逆转录酶脱落，只能得到部分拷贝的cDNA产物；2，mRNA极易降解，而在进行逆转录过程中，这些5'末端部分被降解的mRNA仍可为模板合成cDNA，因此用此方法构建的文库在多数情况下其5'末端为部分缺失的cDNA。另外传统C库构建时需要在合成的cDNA双链两端加上adaptor，连接效率较低,上述原因往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。而好的cDNA克隆应包含模板mRNA的5'帽的结构以及3'多聚A尾的全长序列,并包含低丰度的基因信息。至于利用检测特异表达产物如抗体技术等进行筛库时,要求C库为表达文库，而传统建库技术在构建表达文库时,能得到的正确表达信息很低,这是因为1,加接头时是在cDNA的两端同时进行,因此无法保证cDNA插入载体时,不出现反向插入，而反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50%的可能丢失。2,表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。

利用RACE(利用PCR技术快速扩增全长mRNA)技术构建全长cDNA文库是传统C库构建技术的改进。其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子结构作为标签，用通用引物识别并配对标签序列，PCR扩增后克隆PCR产物，从而构建出全长并有正确阅读框架的C库。

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RACE技术最早是cDNA水平上加接头，以扩增未知5’序列。而随着技术的进展，目前RACE技术已发展到直接以mRNA为模板进行操作，这就保证了全长cDNA的克隆，为研究5’和3’非编码区及启动子提供了条件。

RACE分3’RACE和5’RACE。3’RACE原理如图13－3－1。其用带olig(dt)和特异酶切位点的序列为3’引物；用特异序列为5’引物，经RT－PCR后，扩增出3’全长序列，利用特异酶切位点，插入载体。

5’RACE分两种，其一为SMART（Mechanism At 5' end of the RNA Transcript）技术，其原理为在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）或特异3’序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA其5’端为完整序列。其二为寡核苷酸帽法(Oligo capping method)。其原理如图13－3－2。具体为利用CIAP脱磷，而全长mRNA由于有帽子结构，不被CIAP作用，这样非mRNA及无帽子结构的5’不完整mRNA5’端为OH结构。然后用TAP（烟草酸性焦磷酸化酶，tobacco acid pyrophosphatase）焦磷酸化帽子结构，使5’完整的mRNA在5’端带磷酸基团。用RNA连接酶将无磷酸化的adapt连接到5’末端，3’引物RT后，adapt配对序列扩增，这时由于只有5’完整mRNA才有接头序列，因此扩增的结果只能是扩增出5’完整的mRNA。在此过程中PCR的放大作用，使低丰度的基因也能被信号放大。利用RACE技术构建全长cDNA文库，是综合利用3’和5’RACE，3’RACE引物选择poly(A)，5’RACE引物选择帽子结构，这样使得扩增产物为带有5’、3’非编码区、起始密码、中止密码的完整cDNA。利用RACE技术建库时，模板RNA可为总RNA或mRNA，但要扩增低丰度样品，以纯化的mRNA为模板为好。模板用量一般为总RNA1-5ug;mRNA为50-250ng。

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图13－2－1：3’RACE原理图

本实验即是利用寡核苷酸帽法，进行全长C库的构建，从而掌握RACE技术的原理与基本操作方法。 一：仪器：同实验12，13－1

二：试剂：RACE试剂盒（invitrogen），其余同实验12，13－1

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图13－2－2：5’RACE法的原理图

三：操作

1：RNA、mRNA提取见实验2、12 2：mRNA5’端加接头

1)：脱磷酸化 A：按次序加入下述试剂

RNA/mRNA Xul(RNA1-5ug,mRNA50-250ng)

10×CIP buffer 1ul RNase inhibit(40u/ul) 1ul CIP(10u/ul) 1ul

加DEPC水到10ul B：混匀后50℃1hr, 轻微离心，臵于冰浴。 C：沉淀mRNA

a:上述反应管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提

b: 1/10体积，3MpH5.2乙酸钠、2体积乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀 c:干燥后溶于7ulDEPC水中

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