生物分离工程考试范围

13、下游加工过程概论

1、下游加工工程是生物工程的一个组成部分。生物化工产品通过微生物发酵过程，酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液。反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程。

2、传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异，主要表现在下列三方面。①传统生化产品都为小分子，其理化性能数据都为已知，因此放大比较有依据；相反基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验；②由于第一代基因工程产品都以大肠杆菌作为宿主，无生物传送系统、故产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定，故提取较困难；③大分子（如蛋白质）的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都由氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法。

3、生物技术下游加工过程的特点：①培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高。需要多步纯化。②欲提取的生物物质通常很不稳定、预热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解，特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子、金属离子的存在和分子的空间构型有关。③发酵或培养都是分批操作，且微生物总有一定的变异性，故各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性。 4、整个下游加工过程应遵循下列四条原则：①时间短；②温度低；③pH适中（选择在生物物质的稳定范围内）；④严格清洗消毒。

5、一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：①培养液的预处理和固液分离；②初步纯化（提取）；③高度纯化（精制）；④最后纯化。

6、初步纯化（提取） 目的：在于浓缩，也有一些纯化作用。

有8种方法： ①吸附法②离子交换法③沉淀法（盐析、加入有机溶剂、调pH至等电点、加入非离子型聚合物、加入聚电解质）④溶剂萃取法⑤两水相萃取法⑥超临界流体萃取⑦逆胶束萃取⑧膜过滤法 7、各种层析方法对比

方法 凝胶色谱 离子交换色谱 聚焦色谱 疏水色谱 亲和色谱 机理 分子的大小和形状 电荷和离解度 等电点 表面自由能 特殊的生物作用力 分离能力 中等 高 很高 高 优异 容量 小 很大 大 大 很大 8、选择纯化方法应根据目标蛋白质和杂蛋白在物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。

9、当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，而且经前一种方法处理的液体应能适合于作为后一种方法的料液，不必经过脱盐、浓缩等处理。如经盐析后得到的液体，不适宜于离子交换层析，但对疏水层析（或超滤），则可直接应用。

10、非蛋白质类杂质的去处

①DNA的去除 （了解）DNA 在pH4.0以上呈阴离子，可用阴离子交换剂吸附除去，但目标蛋白质pI值应在6.0以上。

②热原质的去除（重点） 注射用药必须无热原质。热原质制药是肠杆菌科所产生的细菌内毒素。内毒素到处存在，她们是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分—

—脂多糖，在细菌生长或细胞溶解时会释放内毒素，其性质相当稳定，即使经高压灭菌也不失活性。最好的办法是防止产生热原质，整个生产过程在无菌条件下进行。所有层析介质在使用前先除去热原质，操作在2-8℃下进行，洗脱液需先经无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即通过0.2nm微滤膜，并在2-8℃在保存。（预防为主）

③病毒的去除 经过色层分离一般能将病毒去除，必要时也可用UV照射或过滤使病毒失活或除去。

10、目标蛋白质的表征和分析方法 （见课本P10）

仅用一种分析方法是不够的

14、 发酵液的预处理和固液分离方法

1、凝聚和絮凝的差异：

凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

2、不同来源的培养液和发酵液其固液分离速度有很大的差异，取决于该介质的理化性质，主要影响因素是细胞或菌体的大小和介质的黏度。

3、 胶体的特征参数ζ电位 ：胶体双电层中唯一一个能够测量的电位，唯一的标准，ζ电位越大，点排斥作用就越强，胶粒的分散程度越大。 4、阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+ > Fe3+ > H+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > Na+ > Li+

5、絮凝的原理：架桥作用，臂要足够长。（见课本P15）

6、搅拌速度和时间上在絮凝过程中也是十分重要的，加入絮凝剂的初期应高转速，使絮凝剂快速均匀分散到料液中，不形成局部过浓，但接着应低转速搅拌，有利于絮凝体长大成团；如仍高速搅拌易将絮凝团打碎，影响絮凝效果，所以应采用变速搅拌。

7、杂蛋白的其他去除方法（简答）

①等电点沉淀法 蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。和氨基酸等两性物质一样，蛋白质在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下净电荷为0、溶解度最小，可使其产生沉淀而除去。

②活性降低（加热法、有机溶剂法等） 蛋白质从有规则的排列变成不规则的过程称为变性，变性蛋白质溶解度较小，最常用的使蛋白质变性的方法是加热 ，加热还能使液体粘度降低、加快过滤速度。

③吸附作用 利用吸附作用也可除去蛋白质。把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。

④蛋白质沉淀剂 加蛋白质沉淀剂，使形成复合物沉淀，也是除去杂蛋白的方法。在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子，使其形成沉淀，在碱性溶液中，加入一些阳离子。

8、高价无机离子的去除方法：①为了去除钙离子，宜加入草酸，但草酸较贵，用过注意回收。②要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，Na5P3O10,用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。③要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。

9、用于生化物质分离的常规过滤设备主要是板框压滤机和鼓式真空过滤机。

板框特点：过滤面积大、过滤推动力能较大幅度调整、结构简单、价格较低、动力消耗少、但这种设备不能连续操作，设备笨重，劳动强度大、卫生条件差、非生产的辅助时间长。鼓式特点：实现自动化控制，但是压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过程。

10、影响离心分离的因素：①提高离心转速②与颗粒直径有关，大颗粒容易沉降；③与颗粒密度和机制密度之差（ρp-ρm）成正比，当ρp 》 ρm 时，颗粒沿离心力方向沉降。两者差距越大沉降速度越快。④随介质粘度增大而减小。 （颗粒沉降或漂浮速度Up的公式见课本P20）

15、细胞破碎

1、细胞破碎技术：

㈠机械法：①高压匀浆器 适用范围比较广，在微生物细胞核植物细胞的大规模处理中常用，但是，在处理过程中发热，因此，对热不稳定的生物物质不适用。②X-挤压器 适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，但是该法对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。③高速珠磨机 珠体的直径应依据细胞的大小和浓度以及在操作时不使珠体带出为限度进行选择，发热也是必须考虑的问题。④超声波振荡器 原理：超声波对细胞的破碎作用与液体中空穴的形成有关。当超声波在液体中传播是，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用，产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性漩涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。

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