天门冬氨酸生产工艺小总

天冬氨酸生产工艺的研究进展

一、天冬氨酸简介

天冬氨酸(Aspartic acid)又称氨基丁二酸，是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。结构式为：HOOC－CH2－CH(NH2)－COOH，分子量133.10。它有两种旋光异构体：D型和L型。通常所说的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物，为无色单斜棱柱形结晶，溶于水，微溶于75%(w/w)乙醇，不溶于乙醚，熔点278℃～280℃；L型为无色菱形片状结晶，溶于水，微溶于醇，熔点269℃～271℃；D型溶于水、盐酸，不溶于乙醇及乙醚，熔点251℃。 二、合成方法 2.1化学合成法

化学法主要用于生产天冬氨酸的外消旋体DL-天冬氨酸。

顺丁烯二酸酐和过量氨水与NH4C反应，反应在一间歇反应釜中，于140℃、0.4MPa下反应2.5h。将得到的混合物冷却至70℃后用盐酸酸化至pH2.5，再冷却至室温，此时天冬氨酸沉淀析出，将沉淀过滤，4℃下水洗后得到产品，产率为55%。

成都有机化学研究所的邓润华等采用微波法合成的收率为61.4%。该方法采用苯亚甲氨基乙酸乙酯为原料，在相转移催化剂（TEBA）催化下进行卤化反应，经水解生成天冬氨酸外消旋体。

2002年，浙江大学的邢亚军等在一钛材高压釜中，对顺丁烯二酸酐)进行氨化反应合成了DL-天冬氨酸。通过实验研究对原有合成工艺作出了改进，使产品收率提高到70%以上，并且对产品的分离提纯采用顺丁烯二酸(马来酸)代替盐酸进行酸化结晶从而提高了反应物的利用和减少反应剩余物的污染。

2003年天津大学的王亚权等提出了一种简便的、不使用任何催化剂的化学合成法。实验在聚四氟衬里的250ml高压釜中进行。实验步骤如下：将32.5g顺丁烯二酸酐(分析纯)溶于70ml水中，加入氨水(分析纯)至pH8，充1MPa氮气，然后在电磁搅拌下加热至453K，反应6h，反应后冷却至室温，过滤后得无色晶体，收率63.1%，熔点338℃。产物的红外光谱与DL-天冬氨酸的标准谱图吻合，容量分析表明天冬氨酸含量≥98%。 2.2生物酶法生物酶法

IC法（固定化细胞法或固定化酶法） 1973年，Chibata I等将大肠杆菌中提纯的天冬氨酸酶，包埋在交联聚丙烯酰胺中制成固定化酶，富马酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成L-天冬氨酸。 1974年，Chibata I等进一步将高天门冬氨酸酶活力的大肠杆菌直接用聚丙烯酰胺包埋，制成固定化细胞。提高了酶的稳定性，避免了酶提取的复杂过程，首次实现了由富马酸转化为L-天冬氨酸的工业化生产，转化率达到99%，开创了细胞固定化应用于工业生产的先例。

1979年，SatoT等对固定化细胞的方法进行了改进，用天然产物κ-角叉菜胶代替聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌细胞，并用戊二醛、戊二醛及环己二胺处理固定化细胞，以可溶性天冬氨酸酶为对照，研究了这三种固定化细胞中酶的性质。三种固定化细胞的酶促反应的最适pH为9，而可溶性天冬氨酸酶的最适反应pH为9.5。固定化酶的最适温度比可溶性天冬氨酸酶高5℃～10℃。固定化细胞的表

观Km值大约为可溶性天门冬氨酸酶的Km值的5倍。细胞经固定化后，热稳定性得到提高。固定化细胞柱在pH8.5时比在天冬氨酸酶反应最适pH下操作稳定性高。

1981年～1983年居乃琥等利用大肠杆菌菌株，制备固定化大肠杆菌细胞，用于连续生产天冬氨酸，小试每g湿细胞的天冬氨酸的产量最高可达1007g（30天）。中试每g湿细胞的天冬氨酸产量为722g（25天）。该法所用的戊二醛的浓度和添加量，比一般方法的低。由于戊二醛用量少，交联不充分，所以固定化细胞酶活力的回收率高，成本低，但稳定性较差，使用寿命短，所以要适当增加戊二醛的用量。

1995年胡永红，欧阳平凯建立了固定化细胞分离L一苹果酸生产中残留富马酸并将其转化成L-天门冬氨酸的新方法。对生成L-天门冬氨酸的工艺条件进行优化,结果表明,当L-苹果酸反应液pH调至8~9,L-天门冬氨酸添加量为

2+2+2+

6-8g/L,碳酸铵加量为15-20g/L,Mg、Mn、Ca等二价阳离子加量为1mmol/L时,固定化细胞可将L一苹果酸反应液中残留的20%左右的富马酸几乎全部转化成L-天门冬氨酸,且L一苹果酸含量的损失小于5%。

1996年张波采用三种不同发酵培养基，经过不同发酵时间取样测定酶活(EA)、pH、生物量(Biomass)，确定选用培养基A；经不同底物浓度、不同金属离子对固定化细胞转化率的影响的实验，确定使用较高浓度底物及含Mg2+的底物为佳，经实验测得固定化细胞的使用寿命为3个月，即3个月之内能保持转化率在85%以上，固定化细胞的转化时间为3.5h。

1997年石屹峰等[21]设计了用于固定游离细胞生物转化的反冲式膜反应器 （图1），利用膜将游离细胞阻挡于反应器内，同样达到固定化目的而又不损伤细胞(酶)。菌种采用研究者自己选育的含高活力天冬氨酸酶的Escherichia coli SF-D4,培养基为1%反丁烯二酸胺,1%玉米浆,0.7%蛋白

胨,0.1%KH2PO4,0.5%(NH4)2SO4,0.02%Mg2SO4。pH 7.2,37℃,摇床培养24 h。细胞离心10,000 r/min、10 min收集,用生理盐水洗2次。选择0.22Lm微滤膜，最佳细胞浓度为35 mg/mL。

张今等围绕天冬氨酸酶的活性部位、末端缺失突变、蛋白质工程菌的固定化

等方面进行了研究。将突变菌株用琼脂凝胶包埋法进行固定，固定菌量为95%，表观酶活力为82000单位，半衰期184d。实验表明，1kg固定化细胞，每24h约得L-天冬氨酸30kg，

日本三菱石化公司已用黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)发酵法生产L-天门冬氨酸。以往常用的细菌是大肠杆菌(E.coli),因它的细胞壁脆弱,要循环使用必须将菌固定化于载体上,而该公司所用黄色短杆菌有坚韧的细胞壁,故无需用昂贵的固定化方法,经离心分离反复可供反应使用。所以,用这种制造方法生产成本下降。

FWC法（游离细胞法或游离酶法）

1996年，南京化工大学徐虹等使用发酵培养基：富马酸2%，,玉米浆4%,KH2PO4;0.2%,MgSO4,0.025%,用氨水调节pH至7.2~7.5。培养温度为37C，培养时间为26h左右。以大肠杆菌培养液作酶源，采用游离酶法由富马酸转氨生成天冬氨酸。取培养26h左右的培养液，37℃酶反应6d，可转化富马酸9kg/L。

2000年，王雪根、徐虹等又实现了游离整体细胞法工业化生产L-天冬氨酸，发酵培养基:富马酸铵0.4%,富马酸钠2.0%,蛋白胨0.9%,牛肉膏0.4%,玉米浆1.4%,KH2PO40.05%,MgSO4#7H2O 0.05%泡敌0.01%;pH 7.0~7.5。发酵工艺：在摇床上培养5-10 L种子,接种于800 L气升式发酵罐。发酵条件:初始pH 6.5-7.0,风量0.6 VVM,温度37℃,装液量500-550 L。L-天冬氨酸的生产流程见下图。游离整体细胞可以在较短的时间内转化为较多的富马酸，且转化较为彻底，转化率平均在99％以上，有的接近l00％。

2003年北京化工大学唐芳等利用较为便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作为氮源，用葡萄糖部分代替富马酸作为复合碳源，培养产天冬氨酸酶的大肠杆菌。结果表明，改变培养基配比后，对菌体的总体酶活力(即对底物转化能力)影响不大，转化率可达99%以上，通过上罐发酵初步估算可以节约培养基碳氮源成本大约60%

2.3生物拆分法

生物拆分法主要用来合成D-天冬氨酸

利用L-Asp-β-脱羧酶进行拆分自然界中含高活性L-Asp-β-脱羧酶的微生物较多。该酶能专一催化L-Asp脱除β位羧基生成L-丙氨酸(L-Ala)，因此可以利用该酶把DL-Asp中的L-Asp转化成L-Ala，而获得D-Asp。利用L-Asp-β-脱羧酶进行的拆分是目前研究较为成熟的一种方法。

2008年韩铭海等提出了一种利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶生物转化拆分DL-天冬氨酸得到D-天冬氨酸的方法。当牛肉膏浓度为0.2%、玉米浆为1.0%、蛋白胨为1.0%时，发酵液酶活力可以达到最高。转化过程最适pH值为6～7，转化过程最适温度50℃，浓度6.0%以上的丙氨酸能显著提高转化过程中酶的热稳定性。利用D-天冬氨酸和L-丙氨酸的等电点的差异来分离提取D-天冬氨酸的制备工艺。同年，韩冲等开发了以L-天冬氨酸为原料制备D-天冬氨酸的新方法：以天冬氨

酸为原料经过酯化、消旋、拆分和水解制备D-天冬氨酸。使L-2，3-二苯甲酰酒石酸(L-DBTA)与DL-天冬氨酸-β-甲酯在水溶液中于65℃ ～70℃反应形成非对映体盐，冷却到室温，D-天冬氨酸L-DBTA盐析出，过滤后再经水解得到D-天冬氨酸，收率78.2%，旋光纯度达到99%以上。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/i4ff.html