中国药科大学生物制药工艺实验指导

第二部分 生物药物制备实验

第一节 氨基酸及其衍生物类药物

实验二十二 固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸

注：此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸，丙氨酸（国家攻关课题）的成果 【实验目的】

1．学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。

2．了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。 3．掌握固定化细胞的技术。

【实验原理】

固定化细胞（Immobilized cell）技术，就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞，定位于限定的空间领域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。

固定化细胞的制备方法主要有以下几种：吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法；交联可以是细胞通过离子相互作用或共价连接到一个表面，也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接；吸附法是细胞通过静电相互作用（范德华力、离子键和氢键）吸附到支持物表面，此法简单价廉，但经常发现有细胞泄露；絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法；包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术，它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中，减少了细胞泄露，因此具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。

L-天冬氨酸（L-Aspartic acid）是天然存在的重要氨基酸，在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用。L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用，是钾、镁的有效补充剂，适用于各种心脏病。在食品方面，L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味，L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯（其甜度为蔗糖的150倍），是一种新型甜味剂。在化工方面，L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料，其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。

工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展，人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。

L-丙氨酸（L-Alanine）是一种脂肪族的非极性氨基酸，是丙酮酸代谢体系的非必需氨基酸，在血液中含量最多，与糖代谢密切相关，使转氨反应中重要的氨基供体，具有重要的生理功能；同时又是一种重要的氨基酸类药物，为多种复方氨基酸输液的重要组成成分，并可作多种医药中间体。

本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌制成固定化细胞，利用生物反应器，可连续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸。

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【实验材料】

1．器材

（1）水浴振摇培养箱 1台 （2）磁力搅拌器 1台 （3）HPLC 1台 （4）三角烧瓶 250 ml 5个 （5）抽滤瓶 1个 （6）离心机 1台 （7）布式漏斗 2只 （8）恒温水浴锅 1台 （9）酶柱 1根 （10）烧杯 1 000ml 1个 （11）烧杯 500ml 2个 （12）烧杯 250ml 2个 （13）超级恒温水浴 1台 （14）恒流泵 1台 （15）高压灭菌锅 1个 （16）锋利小刀 1把 （17）试管 12支 2．试剂

（1）菌种 （2）玉米浆

（3）延胡索酸铵

（4）PLP（5-磷酸吡哆醛） （5）牛肉浸膏 （6）KH2PO4 （7）MgSO4·7H2O （8）浓氨水 （9）氯化钾 （10）氯化镁 （11）浓硫酸 （12）95％乙醇

（13）Ｌ-天冬氨酸标准品 （14）延胡索酸标准品 （15）Ｌ-丙氨酸标准品

【实验方法】

1．细菌的培养及菌体制备

接种1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中，内含50ml已经灭菌的

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培养基(1%延胡索酸铵， 2%玉米浆，2%牛肉浸膏，0.5%KH2PO4，0.05%MgSO4?7H2O，pH7.0)，37℃振摇培养24h，培养液离心（3 000r/min，20min）倾出上清液，再用生理盐水洗涤1次，离心收集菌体，置冰箱备用。

接种1ml对数生长期L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌种至250ml三角烧瓶中，内含50ml已灭菌的培养基（1.5%L-谷氨酸钠，0.5%富马酸铵，1%富马酸钠，3.0%玉米浆，2%蛋白胨，0.05% KH2PO4，0.01%MgSO4?7H2O，pH7.0），37℃振摇培养24h，培养液离心（3 000r/min，20min）倾出上清液，再用生理盐水洗涤一次，离心收集菌体，置冰箱备用。 2．固定化细胞的制备

（1）天冬氨酸酶产生菌的固定化

将4g湿菌体悬浮于4ml生理盐水中，置45℃恒温水浴保温，0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中，加热至70-80℃使之溶解，再降温至45℃，两者于45℃混匀，混合物置4℃冰箱放置30min，将凝胶在100ml 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h，然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。经生理盐水洗涤后，将固定化细胞置于1mol/L延胡索酸铵中，于37℃活化24h，即可使用。

（2）L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的固定化

将5g湿菌体悬浮于5ml生理盐水中，置45℃恒温水浴保温，0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中，加热至70-80℃使之溶解，降温至45℃，两者于45℃混匀，混合物置4℃冰箱放置30min，将凝胶在100ml 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h，然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。用0.1mol/L甘氨酸充分洗涤，在1mol/L天冬氨酸铵（含0.1mol/LPLP）底物中，于37℃活化24h，即可使用。 3．酶活力测定

（1）湿菌体天冬氨酸酶活力的测定

取0.5g湿细胞悬浮于2ml蒸馏水中，加入30ml 1.0mol/L延胡索酸铵，内含1mmol/L MgCl2，1%Triton pH 9.0，37℃搅拌反应30min，煮沸终止反应，1200rpm,5min离心后，稀释反应上清液于240nm处测定吸收值，按延胡索酸残余量计算酶活力，一个酶活力单位定义为在测定条件下，每小时每克细胞转化生成1μmol天冬氨酸所需的酶量。

（2）固定化细胞的天冬氨酸酶活力的测定

取相当于0.5g天然细胞的固定化细胞， 置于30ml 1.0mol/L延胡索酸铵，内含1mmol/L MgCl2，37℃搅拌反应30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，经稀释后于240nm处测定延胡索酸残余量，并计算每克固定化细胞的酶表现活力。总活力用每克固定化细胞，单位小时内所产生的L-天冬氨酸的微摩尔数表示（μmol/h·g·cell）。

（3）延胡索酸（即富马酸）标准曲线的绘制

延胡索酸在240nm处有特征峰吸收，在一定范围内与延胡索酸含量成线性关系，且反应系统中无干扰。

标准曲线的绘制

试管号

延胡索酸标准液（50μg/ml）

1 0 5

2 1 4

3 2 3

4 3 2

5 4 1

6 5 0

蒸馏水 OD240nm

根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。

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（4）湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的测定

取1g湿菌体悬浮于10ml生理盐水中，取0.5ml悬浮液，加入含0.1mmol/L PLP的1mol/L天冬氨酸铵的底物2ml（pH6.0）于37℃反应30min，煮沸终止反应。生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定。

展开剂选用正丁醇:醋酸:水=4:1:1，显色剂用0.5%茚三酮溶液，烘干后，将显色斑点剪下用0.1%CuSO4·5H2O:75%乙醇=2:38洗脱后，于520nm处比色，再从标准曲线上读得L-丙氨酸的含量。L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的的定义为：每克细胞每小时生成1μmol /L-丙氨酸为1个酶活力单位（U）。

（5）固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力的测定

取6g固定化细胞（相当于1g的湿细胞）加入20ml生理盐水，于37℃保温，加入含0.1mmol/L PLP的1mol/L L-天冬氨酸铵4ml，pH6.0，于37℃反应30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定。

（6）L-丙氨酸标准曲线的绘制 按（5）法用纸层析法定量测定L-丙氨酸的含量与显色斑点脱色后在520nm处比色的关系。

标准曲线的绘制

试管号

L-丙氨酸标准液（40μg/ml）

1 0 5

2 1 4

3 2 3

4 3 2

5 4 1

6 5 0

蒸馏水 OD520nm

根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。 4．L-丙氨酸的制备

分别将6g天冬氨酸酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶的固定化细胞装入带夹套的固定化生物反应器内（Φ1.5cm×30cm），1.0mol/L延胡索酸铵（含1mmol/L MgCl2，pH9.0）底物，以恒流速度通过天冬氨酸酶固定化细胞柱，SV=0.87h-1，然后将流出液通过L-天冬氨酸β-脱羧酶固定化细胞柱，并加0.1mmol/L PLP和28%的氨水，使pH6.0，流出液用纸层析法计算L-丙氨酸的量，并计算转化率（L-丙氨酸转化率=L-丙氨酸浓度/延胡索酸铵浓度×100%）。

【思考题】

１．分别求出湿菌体天冬氨酸酶活力、固定化细胞的天冬氨酸酶活力及湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力、固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力。 ２．分别求出两种菌体包埋后的活力回收率。 ３．分别求出L-天冬氨酸和L-丙氨酸的转化率。

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第二节 多肽及蛋白质类药物

实验二十三 重组水蛭素Ⅲ的制备

注：此实验内容来自校企合作课题，部分成果已申请专利

【实验目的】

1．了解以基因工程菌种E.coli/pHV3为材料进行工程菌发酵培养、外分泌表达小分子多肽类药物重组水蛭素Ⅲ及表达蛋白制备和抗凝血酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理。

2．掌握基因工程菌发酵培养条件、分泌表达目的蛋白及表达蛋白分析鉴定的操作技术方法。

【实验原理】

水蛭素(hirudin)是一类由医用水蛭(Hirudo)唾液腺中分泌出的低分子量的酸性单链多肽， 1904年，Markwardt首先将其分离纯化，并于1970年确定它是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，即使在较低的浓度也可充分地阻止血液的凝固。药理学及临床研究表明，水蛭素能有效地预防静动脉血栓的形成及弥散性血管凝结，不引起过敏、免疫反应，不会造成循环功能障碍。可用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等，是很好的抗凝抗栓药物。

水蛭素的分子质量约为7 000Da，含有65～66个氨基酸残基，水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其N端的3个二硫键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，将二硫键氧化，或分子发生蛋白降解，则失去抗凝活性。若Ｃ端羧基被酯化，或失去Ｃ端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。

水蛭素干燥状态下稳定，室温下水中可稳定存在6个月，80℃下加热15 min不被破坏。pH值升高则稳定性下降，在0.1 mol/L盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15 min。水蛭素不被胰蛋白酶水解，对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。

由于天然水蛭素来源非常困难，每条水蛭只含20μg的水蛭素，不能满足临床应用。为此，国外多家公司及研究单位从80年代末就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素。目前，在国外已上市的水蛭素产品有Hoechs公司的重组水蛭素(Lepirudin,商品名Refludon)，Novartis公司的重组水蛭素产品(Desirudin)。1997年，本院合成了重组水蛭素Ⅲ基因并构建了大肠杆菌外分泌表达体系，分泌型重组水蛭素Ⅲ基因工程菌的表达产物重组水蛭素Ⅲ（recombine hirudin Ⅲ, 简写为rHV3）相对分子质量为7 010.8Da。

此工程菌为外分泌表达体系，其基因表达产物rHV3易于纯化。但该表达系统会产生一些杂质蛋白和色素，影响下游的分离纯化。提取纯化工艺采用了大孔吸附树脂疏水层析和离子交换层析方法较好地解决了杂质蛋白和色素的分离。大孔吸附树脂作为rHV3的第一个提取步骤，高分子量杂蛋白被基本去除，而离子交换则是去色素的关键。吸附及离子交换时采用合适的洗脱条件是提高活力收率的重要因素。该纯化方法工艺简单、rHV3收率和纯度均较高，适用于rHV3的大规模制备。

本实验以此工程菌为材料，先进行工程菌发酵培养，再将发酵液经离心，从工程菌发酵液上清中分离纯化rHV3。发酵上清液经过大孔吸附树脂HP20处理后，用DEAE-52阴离子纤维素交换层析，得到较高纯度表达产物rHV3。rHV3进行抗凝血酶活力分析和15%SDS-PAGE电泳分析。rHV3生物活性的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行。

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比活力测定方法为：精确称取纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定抗凝血酶活力，rHV3比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。

【实验材料】

1．器材

（1）玻璃层析柱：1.6 cm×20cm或/和2.6 cm×40cm 1套 （2）恒流泵 1台 （3）自动部分收集器 1台 （4）记录仪 1台 （5）恒温水浴锅 （6）高速台式离心机 （7）冷冻离心机 （8）旋涡混合器 （9）752紫外分光光度计 （10）稳压电泳仪 （11）摇床 （12）垂直板式电泳槽 （13）电炉 （14）秒表 （15）高压灭菌锅 （16）电磁搅拌器 （17）酸度计 （18）发酵罐 （19）微量移液器（20μl，200μl，1 000μl） （20）标准净化工作台 （21）真空泵和真空干燥器 （22）电子天平(精确到10mg) （23）照相器材 （24）基因工程菌菌种：E.coli/pHV3为本实验室保存

（25）大孔吸附树脂HP20 （26）DEAE-52阴离子纤维素 （27）Eppendorf离心管架 （28）96孔酶标板 （29）脱色摇床 （30）灭菌的移液器枪头 （31）灭菌的Eppendorf管（1.5ml微量离心管） （32）试剂瓶（5 000 ml，1 000 ml，500 ml，250 ml，100 ml） （33）量筒（2 000 ml，1 000 ml，100 ml，10 ml） （34）烧杯（2 000 ml，1 000 ml，500 ml，250 ml，50 ml） （35）布氏漏斗（8 cm 1只）和吸滤瓶（1 000 ml） （36）滤纸 （37）玻棒 （38）试管(5ml，150支；15ml，16支)

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1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1套 1只 1只 1台 1台 1台 1台 各1支 1台 1套 1台 1套 若干 若干 1只 1只 1台 若干 若干 若干 各1只 各3只 各1只 若干 2根 （39）三角瓶（250 ml） 2只 （40）大塑料桶 1只 （41）石英比色杯 1对 2．试剂

重组水蛭素Ⅲ制备和抗凝血酶活力：

（1）培养基：

种子培养基（LB 液体培养基）：1% 胰蛋白胨（Tryptone），0.5% 酵母提取物（Yeast Extract），1% NaCl，加蒸馏水配制，pH 7.0，分装，高压蒸汽（1.03×105Pa）灭菌20 min。接种前在无菌条件下加入抗生素，氨苄青霉素的终浓度为100μg/ml。

发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，4%谷氨酸钠，10%麦芽汁。pH6.5，摇瓶装液量为12%；

（2）氨苄青霉素(Amp)；

（3）0.5%牛血纤维蛋白原：0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制； （4）凝血酶溶液：500 NIH单位加5 ml蒸馏水； （5）低分子量标准蛋白(17. 5～94 K Da)； （6）20 mmol/L乙酸； （7）盐酸；

（8）异丙醇；

（9）20 mmol/L哌嗪； （10）氯化钠；

（11）三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）； （12）乙醇； （13）氢氧化钠；

（14）谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）； 15%SDS-PAGE电泳分析： 同实验九。

【实验方法】

1．工程菌发酵培养

（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为60 μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，摇床转速220r/min，培养18h。 （2）摇瓶培养：再按3%接种量转接于发酵培养基中，37℃，250 r/min，30h，离心收集上清。

（3）补料-批式发酵：30L的发酵罐装入15L发酵培养基，初始pH值为6.5，121℃下灭菌20 min，待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为60μg/ｍl，接入种子液1 000ml，37℃培养，调节搅拌速度及通气量，控制溶氧在10～20%，通过补充酸、碱物质控制pH在6.0～7.5，同时通过流加葡萄糖或蛋白胨调节培养基中营养成分，延长活力表达时间。培养9～16h。

2．重组水蛭素Ⅲ分离纯化制备 （1) 发酵上清液制备

下罐后发酵液经12 000 r/min高速离心除去菌体，收获发酵上清液。采用Lowry法和Markwardt的凝血酶滴定法分别检测目的蛋白重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS –PAGE电泳分析。计算收率。

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（2) 大孔吸附层析

大孔吸附树脂HP20处理装柱，用20 mmol/L乙酸平衡。调节发酵上清液pH值至5.0～6.0，于抽气泵中脱去气泡，以1ml/min的流速将样品上柱。依次用20 mmol/L乙酸洗涤和50 mmol/L pH8.5 Tris-HCl洗涤，再用含10～40%异丙醇的20 mmol/L乙酸梯度洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集6ml， 测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性，绘制洗脱曲线。收集显示活性组分，检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。

大孔吸附柱处理方法：首先用蒸馏水漂洗，去除漂浮的细小颗粒，再用95%乙醇反复浸泡使其充分溶胀和初步除杂。然后用95%乙醇在布氏漏斗中淋洗至乙醇在254nm的紫外吸收值小于0.03为止。再用蒸馏水洗尽乙醇。最后分别用5%盐酸和5%氢氧化钠浸泡3h，均分别洗至pH值为中性。 （3) DEAE-52阴离子交换柱层析

DEAE-52阴离子纤维素柱经20 mmol/L哌嗪平衡。 大孔吸附层析产物液样品经10 mmol/L哌嗪调节至pH6.0后上样。用平衡缓冲液洗涤至基线平稳。再用含0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L哌嗪(pH6.0) 溶液梯度洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集6ml， 测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性，绘制洗脱曲线。收集显示活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的重组水蛭素Ⅲ冻干粉。检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。 3．重组水蛭素Ⅲ生物活性测定

于酶标板小孔中加0.5% 牛血[0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制]200μl，再加入重组水蛭素Ⅲ溶液10～100μl，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100 NIH单位)，时间间隔为1 min，若在1 min内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出重组水蛭素Ⅲ的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1:1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。

4．重组水蛭素Ⅲ比活力测定方法

精称纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定抗凝血酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rHV3比活力。rHV3比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。

5．15%SDS-PAGE电泳分析样品纯度

电泳方法同实验九。

（1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度15％。

（2) 将发酵液上清、解吸液和离子交换洗脱液样品处理后，进行15%SDS-PAGE电泳析。

（3) 电泳2～3h后，取出凝胶，用0.15%考马斯亮兰-R250进行染色。过夜后倾出染液，不断脱色，起初每20min换液1次，1h后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区

带图谱。 6．结果处理

（1）用箭头图表示重组水蛭素Ⅲ制备的操作流程。 （2）绘制洗脱曲线。

（3）重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析

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重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析

纯化步骤 总蛋白(mg) 总活力(ATU) 比活(ATU/mg) 纯化倍数 收率(%) A.发酵上清液

B.大孔吸附层析 C.DEAE-52 纤维素柱层析

（4) 电泳图谱分析

【思考题】

1．影响重组水蛭素Ⅲ纯度和收率的因素有哪些？如何加以控制？ 2．试说明电泳图谱，并用电泳图谱判断所制得的重组水蛭素Ⅲ的纯度。 3．如何在原核内成功表达小分子多肽类药物而不被宿主内蛋白酶水解？

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实验二十四 酸醇提取法制备猪胰岛素

注：此实验内容来自校企合作课题

【实验目的】

1．学习胰岛素的制备方法

2．了解胰岛素的理化性质及其在制备方面的应用 3．掌握酸醇提取法制备猪胰岛素的技术

【实验原理】

胰岛素（insulin）是动物胰腺中兰氏小岛β-细胞所分泌的一种动物激素，在体内具有降低血液中葡萄糖含量和调节血糖平衡的作用。医疗上主要用于治疗糖尿病， 也是生化工程中作为研究蛋白质结构与功能的常用材料。胰岛素共51个氨基酸，由A、B两条肽链组成。A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸，两条肽链之间借两个二硫键联结，A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键。人胰岛素分子量为5 734Da，等电点为pH5.6。在酸性环境（pH2.5～3.5）较稳定，在碱性溶液中极易失去活力，可形成锌、钴等胰岛素结晶。又由于其分子中酸性氨基酸较多，可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合，形成分子量大、溶解度低的鱼精蛋白锌胰岛素。在显微镜下观察呈正方形或偏斜方形六面体结晶。胰岛素不溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂，但易溶于稀酸和稀碱的水溶液，也能溶于酸性或碱性的稀乙醇和稀丙酮中。

胰岛素一般由动物脏器提取， 其生产方法有酸醇提取减压法、分级提取锌沉淀法和磷酸钙凝胶、DEAE-纤维素及离子交换树脂吸附法。本实验介绍酸醇提取减压浓缩法由猪胰提取胰岛素的方法。

【实验材料】

1．器材：

（1）组织捣碎机 1台

（2）布氏漏斗 10cm 1个 （3）抽滤瓶 1 000ml 1个 （4）抽气泵 1台 （5）剪刀 1把 （6）烧杯 400ml 2个 200ml 2个 100ml 1个

（7）纱布 25cm×25cm 1块 （8）玻璃棒（大） 2根 玻璃棒（小） 2根

（9）量筒 500ml 1只 100ml 1只 10ml 1只

（10）容量瓶 100ml 1只 （11）分液漏斗 250ml 1只 （12）离心机 1台 （13）真空干燥器及真空泵 1套 （14）温度计 100℃量程 1根

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（15）pH试纸 各种量程规格 1套 2．试剂：

（1）86％乙醇、68％乙醇 （2）草酸

（3）6mol/L硫酸溶液

（4）浓氨水、2mol/L氨水、4mol/L氨水 （5）氯化钠 （6）冷丙酮

（7）20％、6.5％醋酸锌溶液 （8）2％、10％柠檬酸溶液 （9）0.01mol/L 盐酸

（10）0.1mol/L磷酸二氢钠溶液 （11）乙醚 （12）乙腈

【实验方法】

1．操作方法：

(1) 提取：取冻胰块100g用匀浆机绞碎后加入2.3～2.6倍的86％乙醇(w/w)，5％冻胰重的草酸（少许硫酸调至pH2.5～3.0），在10～15℃温度下搅拌提取3h。过滤或离心取上清，滤渣再用l倍量68％乙醇和0.4％冻胰重的草酸及少许硫酸按上法提取2h，同上法分离合并乙醇提取液。

(2) 碱化、酸化：提取液在不断搅拌下加入浓氨水调溶液pH为8.0～8.4（液温10～15℃），立即压滤或离心除去碱性蛋白。澄清液及时加6M硫酸酸化至pH为3.4～3.8，降温至0～5℃，静置4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。

(3) 减压浓缩：离心取上清液，在30℃ 以下真空浓缩除去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04～1.06（约为原来体积的1/9～l/10）为止。

(4) 去脂、盐析： 将浓缩液转入烧杯，于10min内加热至50℃，立即用冰盐水冷却降温至5℃，转置分液漏斗静置3～4h，使油层分离。分出下层清液（上层油脂可用少量蒸馏水洗涤回收胰岛素），调pH为2.3～2.5，于20～25℃在搅拌下加入23％ (W/V)固体氯化钠，搅拌盐析， 静置数小时，盐析物即为粗品胰岛素（含水量约为40%）。

(5) 精制：

① 除酸性蛋白： 取粗制胰岛素，按其干重加入7倍量冰冷蒸馏水溶解 （7倍量水应包括粗制胰岛素中所含水量），再加入3倍量的冷丙酮（按粗品计）并用2mol/L氨水调节pH为4.2～4.3，然后按耗用的2mol/L氨水量补加丙酮使溶液中水和丙酮的比例为7 : 3。充分搅拌后，低温放置过夜，使溶液冷至5℃以下，次日在5℃以下用离心分离法或用布氏漏斗过滤法将沉淀分离。

② 锌沉淀： 在滤液中加入2mol/L氨水调pH到6.2～6.4，按溶液体积加入3.6％醋酸锌溶液（浓度为20％），再用2mol/L氨水调节使最终pH为6.0，低温放置过夜，次日用布氏漏斗过滤，分离沉淀。

③ 结晶： 经丙酮脱水后按每克精品（干重）加入2％柠檬酸50ml、6.5％醋酸锌2ml，丙酮16m1，并用冰水稀释至100ml，置冰浴中速冷至5℃以下，用2M氨水调pH8.0，迅速过滤。滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH6.0，然后补加丙酮使整个溶液体系保持丙酮含量为l6%。在10℃下缓慢搅拌2～5h后放入3～5℃冰箱72h使之结晶，前48h内需用玻璃棒间歇搅拌，后24h

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静置不动这一步骤关系到结晶优劣，须仔细操作。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜方形六面体结晶。结晶离心收集，并用毛刷小心刷去晶体上面所覆灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵溶液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素，效价每毫克应在25单位以上。

(6) 检测：取对照品及供试品适量，分别加0.01mol/L 盐酸溶液制1ml中含40单位的溶液，照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5μm)；柱温40℃；以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH值为3.0）-乙腈(73:27)或适宜比例的混合液（含0.1mol/L硫酸钠）为流动相；检测波长为214nm；流速为1ml/min。取供试品溶液及对照品溶液各20μl 注入液相色谱仪，记录主峰的保留时间，供试品的主峰保留时间应与同种属对照品的主峰保留时间一致。

(7) 效价测定：将效价确定的Insulin标准品用0.01mol/L盐酸液配制并稀释成40、30、20、10、1和0.5U/ml溶液。样品原料以0.01mol/L盐酸液配制并稀释成1.5mol/ml溶液进样测定。效价计算以主峰面积为纵坐标，Insulin浓度为横坐标进行线性回归，计算而得。

【思考题】

1．提取过程中，影响胰岛素活性/效价的因素有哪些？如何提高提取率？ 2．制备猪胰岛素的原理及其应注意的问题

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实验二十五 多肽缩宫素的Fmoc固相合成法

注：此实验内容来自校企合作课题

【实验目的】

1．学习多肽固相合成的方法及其分离纯化操作。

2．了解多肽固相合成的基本原理以及合成中功能基团的侧链保护策略。 3．掌握缩宫素Fmoc固相合成法的基本原理及其注意事项。

【实验原理】

1963年Merrifield创建并发展了多肽固相合成（solid-phase polypeptide synthesis）方法之后，多肽研究领域发生了划时代的变化。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性，应用该方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。

缩宫素(oxytocin)是垂体后叶激素的主要成分之一，临床主要用于引产、产时子宫收缩乏力、产后出血、子宫复位不良及月经过多等，是由8种氨基酸按如下所示的顺序排列，通过肽键结合而成的9肽化合物。

S S

(C端)-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-(N端)

Fmoc固相合成法制备缩宫素的原理是：

首先将其所含的8种氨基酸分别制成Nα-芴甲氧羰基( Fmoc)氨基酸，然后从C端开始，将氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性高分子树脂相连，就以这一氨基酸的氨基作为合成的起点，使其同排列顺序中相邻的氨基酸的羧基发生酰化反应，形成酰胺键（肽键），然后再让这一包括两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸上的羧基形成肽键，并不断重复这一过程，即可逐渐延长肽键，直至缩宫素的N端形成为止。

用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满足3个条件：一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上，然后从氨基端逐步增长肽链；二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去；三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化。

【实验材料】

1．器材

（1）多肽合成反应器 1台 （2）旋转蒸发仪 1台 （3）高速冷冻离心机 1台 （4）HPLC 1台 （5）真空泵 1台 （6）电子天平 1台 （7）电动搅拌机 1台 （8）电热恒温干燥箱 1台 （9）圆底烧瓶 50ml 1个 (10) 量筒 10ml 1个 100ml 1个 (11) 布氏漏斗 1个 2．试剂

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（1）Fmoc保护氨基酸: Fmoc-Cys(Trt)-OH； Fmoc-Tyr(tBu)-OH；

Fmoc-Asn(Trt)-OH； Fmoc-Gln(Trt)-OH； Fmoc-Ile-OH； Fmoc-Pro-OH； Fmoc-Leu-OH；

注：Fmoc–氨基酸(Trt)-OH表示氨基酸的α-氨基和侧链基团已分别被Fmoc和Trt（三苯甲基）所保护。 （2）HOBt

（3）DIC（二异丙基碳二亚胺） （4）TFA（trifluoroacetic aci） （5）DMSO

（6）哌啶经重蒸后使用

（7）DMF（二甲基甲酰胺） （8）茚三酮

（9）Cys(Trt)-2-Chlorotrityl Resin （半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂）

【实验方法】

1．粗品制备

(1) 称取约含0.2mmol半胱氨酸的半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂，用10ml DMF溶胀30min，抽滤。

活化Fmoc-氨基酸：向0.3mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH中加入10ml溶有0.33mmol DIC和0.45mmol HOBt的DMF溶液，摇匀静置活化20min。

(2) 缩合：将活化好的Fmoc-氨基酸溶液加到盛有上述树脂的反应器皿中，室温下缓慢摇动反应2h，抽滤，用DMF洗3次，每次5ml。

(3) 脱除Fmoc保护： 将10ml含20%哌啶的DMF溶液加到盛有上述树脂的反应器中室温下反应30min除去Fmoc保护基团，抽滤，然后用5ml DMF洗涤3次。采用同样的试剂用量和操作步骤，按缩宫素分子序列顺序依次用下一种保护型氨基酸重复上面的接肽反应，直到最终形成所需的多肽序列。

(4) 侧链脱保护及多肽链脱离树脂：向肽-树脂样品中按15ml/g树脂的比例加入K试剂[三氟乙酸/二氯甲烷/1，2-乙二硫醇/苯甲醚/水(80/10/5/3/2，v/v)]，室温下摇动反应4h。抽滤后用1ml~2ml TFA分两次洗涤树脂，洗涤液并入裂解液中。将裂解液旋转蒸发浓缩至小体积，然后将裂解液滴入100ml冷乙醚中得到多肽沉淀，将沉淀冷冻离心分离。 (5) 成键反应：将上述沉淀溶解于10ml 25％的DMSO水溶液中，摇匀并在室温下静置24h形成二硫键，然后将溶液冻干得到粗品氧化产物。 2．精制

缩宫素粗品产物通过Sephadex G-15凝胶过滤层析，用25%的醋酸水溶液洗脱进行纯化。洗脱产物采用制备型高效液相，经反相键合C18柱进行梯度洗脱最终纯化。

色谱条件为：流动相由含0.1%TFA的10%-75%的乙腈溶液在35min内进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm。

3． 检测

粗品作为供试品溶液进行薄层层析检测，应只有一个清晰的斑点，薄层板采用G60-F254型硅胶板，溶剂展开系统取丁醇:醋酸:水=4:1:5的混合液的上清，或乙腈:水=5:1的混合溶剂。 取本品作为供试品溶液，另取合成缩宫素对照品，加0.9%氯化钠溶液制成每1ml中含5个单位或10个单位的对照品溶液。照高效液相色谱法，以辛基硅烷键合硅胶为填充剂，0.1mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈(82:18)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为220nm。取供试品溶液与相同浓度的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，供试品与对照品主峰的保留

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时间应一致。

4．效价测定（大白鼠离体子宫法）

本法系比较垂体后叶或合成缩宫素标准品(S)与供试品(T)引起离体大鼠子宫收缩的作用，以测定供试品的效价。 (1) 溶液的配制： ① 标准品溶液的配制：

迅速精密称取垂体后叶标准品适量，注意避免吸潮，先加少量0.25％醋酸溶液，仔细研磨，移至硬质大试管中，再精密加0.25％醋酸溶液使成每1ml中含缩宫素1单位的溶

液。管口轻放一玻璃塞，浸入沸腾的水中，持续振摇，加热煮沸5min取出，迅速冷却，

滤过，滤液分装于适宜的容器内，4～8℃贮存，如无沉淀析出，可在3个月内使用。 ② 标准品稀释液的配制：

实验当日，精密量取垂体后叶标准品溶液适量或取合成缩宫素标准品，按标示效价加入0.9%氯化钠溶液配成每1ml中含缩宫素1单位的溶液，按高低剂量组(ds<[2]>，ds<[1]>)加0.9％氯化钠溶液配成两种浓度的稀释液，一般高浓度稀释液可配成每1ml中含0.01～0.02单位，高低剂量的比值(r)一般不得大于1:0.7。调节剂量使低剂量能引起子宫收缩，一般在20～50mm；高剂量应不致使子宫收缩达到极限，一般为50～85mm，且高低剂量所致子宫的收缩应有明显差别。

③ 供试品溶液与稀释液的配制：

按供试品的标示量或估计效价(A<[T]>)，照标准品溶液与其稀释液的配制法配成，高低两种浓度的稀释液，其比值(r)应与标准品相等，供试品和标准品高低剂量所致的反应均值应相近。

④ 子宫肌蓄养液的配制：

试验当日，取氯化钠9g、氯化钾0.42g、氯化钙（按无水物计算）0.06g与葡萄糖0.5g，加水700ml使溶解，另取碳酸氢钠0.5g，加水约200ml溶解后，缓缓倾注于前一溶液中，边加边搅拌，最后补加蒸馏水至1 000ml。 (2) 供试用动物：

取健康合格的成年雌性大鼠，断乳后即与雄鼠隔离，出生后不超过 3个月，体重160～240g。试验当日，选择阴道涂片在动情前期的动物，也可用雌性激素处理使子宫涂片为动情前期或动情期的动物。

(3) 检定法：

取选定的大鼠迅速处死，剖腹取出子宫，仔细分离附在子宫肌上的结缔组织，注意避免因牵拉使子宫肌受损。在子宫分叉处剪下左右2条，取一条将其下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴杯底部，上端用线与记录装置相连，以描记子宫收缩；浴杯中加入一定量的子宫肌蓄养液(约30～50ml)，连续通入适量空气。蓄养液应调节至32～35℃之间并保持恒温(±0.5℃)，子宫放入浴杯后，静置约15min，按次序准确注入等体积的标准品或供试品两种浓度的稀释液(0.3～0.8ml)，待子宫肌收缩至最高点开始松驰时（约60～90s），放去蓄养液并用蓄养液洗涤一次，再加入等量蓄养液，静置；相邻两次给药的间隔时间应相等（约3～5min)，每次给药应在前一次反应恢复稳定以后进行。标准品稀释液和供试品稀释液各取高低两个剂量(ds<[2]>、ds<[1]>、d<[T]><[2]>、d<[T]><[1]>)为一组，按随机区组设计的次序轮流注入每组4个剂量，重复4～6组。

测量各剂量所致子宫收缩的高度，照生物检定统计法（附录ⅩⅣ）中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。本法的可信限率FL(％)不得大于10％。

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【思考题】

1．肽缩合反应中干扰最终产物分离纯化的原因是什么？解决上述问题可以从哪三方面来考虑？

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第三节 核酸类药物

实验二十六 酵母RNA的制备和单核苷酸的离子交换柱层析分析

注：此实验内容来自校企合作课题

【实验目的】

1．学习以酵母为原料采用稀碱法制备RNA的原理和方法 2．掌握离子交换法分离单核苷酸的原理和方法

【实验原理】

从微生物中提取RNA 是工业上最实际有效的方法。一些最常见的菌体，如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、面包酵母、百地霉等均含有丰富的核酸资源。工业上制备RNA一般选用成本较低，适于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用氢氧化钠溶液，使细胞壁变性裂解，浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。如用稀碱法，需用酸中和。然后除去菌体碎片，将pH调至RNA的等电点（pH 2.5），使RNA沉淀下来，该法的缺点是制备的RNA分子量较低。

核酸经酸、碱或酶水解可以产生各种核苷酸，核苷酸的可解离基团是第一磷酸基、含氮环上的-NH2 和第二个磷酸基等，它们的解离常数（pK）和由此得到的等电点差异是进行离子交换层析分离的基础。四种单核苷酸的解离常数和等电点见表1。

表1 四种单核苷酸的解离常数（pKa）和等电点（pI）

核苷酸 腺苷酸（AMP） 鸟苷酸（GMP） 胞苷酸（CMP） 尿苷酸（UMP）

第一磷酸基（pKa1）

0.9 0.7 0.8 1.0

含氮环(pKa2)

3.7 2.4 4.5 —

第二磷酸基(pKa3)

6.2 6.1 6.3 6.4

等电点(pI) 2.35 1.55 2.65 —

在一定条件下，离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类型

的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸。为了增加单核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要控制条件使单核苷酸带上大量相应电荷，这主要是通过调节pH值，使单核苷酸的一些可解离基团（磷酸基、氨基、烯醇基）解离，同时应减少上柱溶液中除单核苷酸外的其它离子强度。而洗脱时则相反，应使被吸附的单核苷酸的相应电荷降低，通常是增加洗脱液中竞争性的离子强度，必要时提高温度使离子交换树脂对单核苷酸的非极性吸附作用减弱。

RNA可被碱水解成2’-或3’-核苷酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯-二乙烯苯，磺酸型）或阳离子交换树脂（聚苯乙烯-二乙烯苯、季铵碱型）分离核苷酸。本实验利用强碱型阳离子交换树脂（强碱型201×8、强碱型201×7、国产717、Dowexl、Amberite IRA-400或Zerolit FF）将各类核苷酸分开，测定核苷酸的紫外吸收光谱的比值：O.D250/O.D260、O.D280/O.260、O.D290/O.D280对照标准比值表（表2），可以确定其为何种核苷酸。

【实验材料】

1．试剂：

（1）氢氧化钠（工业级）；

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（2）盐酸； （3）95%乙醇；

（4）1mol/L甲酸：取21.4 ml 88%甲酸定容至500 ml；

（5）1mol/L甲酸钠溶液：称32.15g甲酸钠用水溶液定容至500 ml； （6）0.02mol/L甲酸：取10 ml 1mol/L甲酸定容至500ml； （7）0.15 mol/L甲酸：取75 ml 1mol/L甲酸定容至500ml；

（8）0.01 mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液（pH 4.44）：取5ml 1mol/L 甲酸，25ml 1mol/L

甲酸钠溶液定容500ml；

（9） 0.01 mol/L甲酸-0.1 mol/L甲酸钠溶液（pH 3.74）：取50 ml 1 mol/L甲酸，50 ml 1

mol/L甲酸钠溶液定容至500 ml；

（10）0.3mol/L氢氧化钾溶液：取1.68g氢氧化钾用水溶液定容至100 ml； （11）2 mol/L过氯酸：取17 ml 70~72%过氯酸定容至100 ml； （12）1 mol/L盐酸；

（13）0.5mol/L氢氧化钠溶液； （14）新鲜啤酒酵母； 2．器材：

（1）烘箱 1台 （2）电动搅拌器 1台 （3）桶或缸 1个 （4）离心机 1台 （5）滤布 若干 （6）玻璃层析柱 1.1cm×20cm 1根 （7）部分收集器 1台 （8）紫外分光光度计 1台 （9）恒温水浴 1台

【实验方法】

1． RNA的制备

取啤酒酵母于2~3℃条件下每天用水洗一次，共洗3 ~ 4次，最后沉淀1 ~2d。倾去上清液，得酵母泥。取酵母泥10g，置培养皿内，于105℃烘箱内烤干，测定其含水量。这样的酵母泥一般含干酵母15%左右。

加水将酵母泥调成5~10%干重的菌悬液，再加入浓的氢氧化钠溶液，使氢氧化钠的最终浓度（即提取时的浓度）为1%。在20℃条件下电动搅拌30~45min（如室温在20℃以下，可以适当延长时间）。然后用6 mol/L盐酸中和至pH 7.0，再搅拌10 min，直火或用蒸汽迅速加热到90℃在该温度下保持10min，迅速下降到10℃以下，与低温处静置3～6d，沉出蛋白质和酵母残渣。虹吸取出上清液。向下层混浊液中加入1/3体积的水，搅匀，静置过夜。于3 000r/min离心20 min左右，取出上清液。将上述二次上清液（含RNA）合并。

用6 mol/L盐酸调至pH 2.5（RNA的等电点），低温放置过夜。离心收集RNA沉淀，用少量乙醇洗二次，干燥。所得的RNA制品，色微黄，产率为4～5% ，RNA含量可达60～70% 。

2．单核苷酸的分离 （1）样品处理

取20 mg上述RNA制品，溶于2ml 0.3 mol/L氢氧化钾溶液中，于37℃水解20h，RNA

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在碱作用下水解成单核苷酸，水解完成后，用2mol/L过氯酸溶液调至pH 2.0以下，以4 000r/min离心10min，取上清液，用2 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 8.0，并用紫外分光光度计准确测得含量后待用。

（2）离子交换柱的安装

取内径1.1～1.2cm 的层析柱，将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液一次倒入玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在树脂面上。缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上。（注意在整个操作过程中防止液面低于树脂，当液面低于树脂表面时空气将进入，在树脂内形成气泡，妨碍层析结果）。经沉积后离子交换树脂柱床高7～8 cm。 （3）加样

将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片内时，用50ml蒸馏水淋洗树脂柱。碱基、核苷及其它不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出。 （4）核苷酸混合物的洗脱

收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光光度计上测260nm处光密度，待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.02）时，可用甲酸及甲酸钠溶液进行洗脱。

依次用下列洗脱液分段洗脱，500ml 0.02mol/L甲酸；500ml 0.15mol/L甲酸；500ml 0.1mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液（pH4.44）；最后用500ml 0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠溶液（pH3.74）。用部分收集器收集流出液，控制流速8ml/10min，8ml/管。

（5）由层析柱所得各部分洗脱液的分析

以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液作为空白对照，用紫外分光光度计测各管溶液在260 nm 波长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）为横坐标，光密度值为纵坐标作图，分析各部分波峰位置。

根据各部分核苷酸在不同波长时光密度的比值（O.D250/O.D260、O.D280/O.260、O.D290/O.D280），对照标准比值（见表2）以及洗脱时的相应位置确定其为何种核苷酸。由洗脱液的体积和它们在紫外部分的光密度值，计算各种核苷酸的含量。

附：强碱型阴离子交换树脂201×8（聚丙乙烯-二乙烯苯，三甲胺季铵碱型，全交换量大于3毫克当量/克干树脂，100~200目）的处理方法：用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒，使用时先用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡1h，以除去碱性溶液杂质然后用无离子水洗至中性。再用1mol/L盐酸浸泡0.5h，除去酸溶性杂质，再用无离子水洗至中性。然后用1mol/L甲酸钠溶液浸泡，使树脂转变成甲酸型。将树脂装入柱内，继续用1mol/L甲酸钠溶液洗，直至流出液中不含氯离子（用1%硝酸银溶液检查）。最后用1mol/L甲酸洗，直至260 nm处光密度值低于0.02，并用蒸馏水洗至接近中性，即可使用。

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表2 部分核苷酸的物理常数

核苷酸

分子量

pH 异 构 体

AMP

紫外吸收广谱性质

克分子消光系数

光密度比值

ε260×10 2 14.5 14.5 14.5 12.3 12.3 11.6 6.9 6.9 6.3 9.9 9.9 9.9

7 15.5 15.3 15.3 12.0 12.0 11.7 7.75 7.6 7.4 9.9 9.9 9.9

-3

250／260 2 0.85 0.85 0.85 0.90 0.90 1.22 0.48 0.46 0.46 0.79 0.74 0.74

7 0.8 0.8 0.8 1.15 1.15 1.15 0.86 0.84 0,84 0.85 0.83 0.73

280／260 2 0.23 0.23 0.22 0.68 0.68 0.68 1.83 2.00 2.10 0.30 0.33 0.38

7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40

290／260 2

7

347.2 363.2

2’ 3’ 5’ 2’ 3’ 5’ 2’ 3’ 5’

0.038 0.009 0.038 0.009 0.03 0.009 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03

0.285 0.285 0.28 0.26 0.30 0.30 0.02 0.02 0.03

GMP

CMP

323.2

UMP

324.2 2’ 3’ 5’

【思考题】

1. 离子交换法分离单核苷酸的原理？

2. 离子交换时常用的洗脱方式有哪些？各有何特点？

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实验二十七 单核苷酸衍生物制备

注：此实验内容来自校企合作课题，部分成果已申请专利

【实验目的】

1．学习单核苷酸衍生物的生物制备方法。 2．了解单核苷酸衍生物制备的原理和一般方法。

【实验原理】

核苷类药物传统的制造方法一般采用化学合成,此方法缺点是步骤多、难度高、周期长且有异构体产生。例如要对天然核苷进行化学修饰，往往需要先对碱基或核糖基团进行保护，此后还要去除保护基团，这样合成反应总收率将会降低。用化学法将碱基与核糖缩合，还可能形成α-异构体,影响产率。

酶法合成的优点在于可合成复杂的生物分子，与特定基团选择性结合，无需基团的保护，酶反应效率高，其底物可以是天然底物的类似物。酶法合成核苷类药物的原理是：利用微生物中产生的核苷磷酸化酶催化核苷、碱基转换反应，即由廉价供应的天然核苷为原料将其核糖基进行化学修饰后作为核糖基供体，利用核苷磷酸化酶或脱氧核糖转移酶为酶源，天然或杂环碱基为核糖基受体酶法合成核苷及其类似物，反应式如下：

当核苷1为尿苷、碱基1为5-氟尿嘧啶时即可转化合成5-氟尿苷。

【实验材料】

1．器材

（1）高效液相色谱仪 Agilent 1100 1台

（2）摇床； 1台 （3）紫外可见分光光度计 1台 （4）台式水浴恒温振荡器 1台 （5）高压灭菌锅 1台 （6）台式高速离心机 1台 （7）电子分析天平 1台 （8）取液器 1 000μl、 200μl 各1支 2．试剂

（1）牛肉浸膏 （2）酵母浸出汁 （3）蛋白胨 （4）硼砂 （5）乙二醇 （6）甘氨酸 （7）环己胺 （8）EDTA

97

（9）尿苷 （10）尿嘧啶 （11）5-氟尿嘧啶

【实验方法】

1．菌体培养

经斜面活化的产气肠杆菌EMA-Z1先接种2环于摇瓶培养种子，在31℃、200r/min摇床中培养6~7h，以10％的接种量接种于摇瓶，于31oC、200r/min摇床培养13h。 2．菌体的制备

培养液于3 600r/min离心24min，所得菌体用10mmol/L的磷酸钠盐缓冲液（pH7.0）重悬，于12 000r/min离心5min，去除上清，用上述缓冲液重悬再以同样条件离心5min，洗去残余的培养基，去除上层黑色物质，所得湿菌体于4C冰箱保存备用。

3．微生物转化

10mmol/L尿苷（UR）、30mmol/L5-氟尿嘧啶（FU）、30mmol/L磷酸钠盐盐缓冲液(NaOH调pH7.8)和含10g/100ml产气肠杆菌湿菌体的酶反应混合物于恒温水浴振荡器中55oC、150r/min振荡反应9h后加入0.5倍体积的3mmol/L的HCl终止反应，12 000r/min离心5min，取上清液，HPLC分析产物浓度。

4．检测方法

Waters 1525高效液相色谱仪，Lichrospher C18 柱4.6 mm×250mm，260nm检测。 流动相：磷酸二氢钠:甲醇（90:10）；流速：1ml/min；进样量：10μl。

o

【思考题】

1．单核苷酸衍生物的生物制备方法有何特点? 2．实验中菌体的培养时间对转化反应有什么影响?

98

第四节 酶类药物

实验二十八 胰弹性蛋白酶的制备及活力测定

注：此实验来自项目超氧化物歧化酶的分离纯化（省课题）的成果

【实验目的】

1．学习弹性蛋白酶制备的方法。 2．掌握弹性蛋白酶活性测定的原理。

【实验原理】

弹性蛋白酶（Elastase E C3.4.4.7），又称胰肽酶E，是一种肽链内切酶，根据它水解弹性蛋白的专一性又称为弹性水解酶。弹性酶为白色针状结晶，是由240个氨基酸残基组成的单一肽链，分子量为25 900，等电点为9.5。其最适pH随缓冲体系而略异，通常为pH 7.4～10.3，在0.1mol/L碳酸缓冲液中为8.8。光吸收系数ε lcm 280 nm＝5.74×104，E1cm1(0 nm＝22.2（0.1mol/L氢氧化钠）；ε lcm 280 nm＝5.23×104，E1cm1(0nm＝20.2（0.05mol/L pH 8.0乙酸钠）。

结晶弹性酶难溶于水，电泳纯的弹性酶易溶于水和稀盐酸溶液（可达50 mg／ml），在pH 4.5以下溶解度较小，增加pH可以增加溶解度。弹性酶在pH 4.0～10.5，于20℃较稳定，pH＜6．0稳定性有所增加，冻干粉于5℃可保存6～12个月。在-10℃保存更为稳定。

弹性蛋白唯有弹性酶才能水解。弹性酶除能水解弹性蛋白外还可水解血红蛋白、血纤维蛋白等。许多抑制剂能使弹性酶活力降低或消失，如10mol/L硫酸铜，7×10mol/L氯化钠可抑制50％酶活力，氰化钠、硫酸铵、氯化钾、三氯化磷也有类似作用。上述抑制作用一般多为可逆。另外大豆胰蛋白酶抑制剂、血清或肠内非透析物等也有抑制作用。其它如硫代苹果酸、巯基琥珀酸、二异丙基氟代磷酸等均能强力抑制酶活力。

弹性酶广泛存在于哺乳动物胰脏，弹性酶原合成于胰脏的腺泡组织（Micin），经胰蛋白酶或肠激酶激活后才成为活性酶。本实验以新鲜猪胰脏为原料进行提取，然后再用离子交换层析法进行纯化，得到弹性酶。所得产品以刚果红弹性蛋白为底物采用比色法测其活力，。

－5

－2

【实验材料】

1． 器材：

(1) 组织捣碎机 1台

(2) 电动搅拌器 1台 (3) 布氏漏斗 10cm 1只 (4) 吸滤瓶 1 000ml 1只 (5) 抽气泵 1台 (6) 剪刀 1把 (7) 烧杯 800ml 1只 (8) 烧杯 400ml 1只 (9) 绸布 25cm×25cm 1块

(10) 量筒 500ml 1只

100ml 1只

(11) 玻璃棒（大） 2根 (12) 玻璃棒（小） 6根 (13) 试管 10 ml 18支

99

(14) 吸量管 5ml 18支

1ml 2支

(15) 721型分光光度计 1台 (16) 乳钵 10 cm l只 (17) 真空干燥器及真空泵 1套

2．试剂：

(1) 0.1mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：NaAc·3H2O 5.85克与36％醋酸溶液9.51ml（冰醋酸3.42ml）溶于水，稀释至1 000ml，pH计校正。

(2) 1.0mol/L pH 9.3氯化铵缓冲液：26.8克氯化铵溶于500ml水中，用浓氯水调整至pH 9.3。

(3) pH 8.8 硼酸缓冲液：取3.72克硼酸和13.43克硼砂溶于水中，稀释至1 000ml，pH计校正。

(4) pH 6.0 磷酸缓冲液：取KH2PO4 6.071克，NaOH 0.215克溶于1 000ml水，pH计校正。

(5) 2mol/L醋酸。 (6) 丙酮。

(7) 刚果红弹性蛋白。 (8) 弹性酶纯品。

(9) Amberlite CG50树脂。

【实验方法】

1．预处理及细胞破碎

取冻胰脏，剪去脂肪，切成小块。称取100g加入50ml醋酸缓冲液（内含0.05 mol/L CaC12），用组织捣碎机搅碎，静置活化。

2．提取

再加入200ml pH 4.5 0.1mol/L醋酸缓冲液，25℃搅拌（机械搅拌）提取1.5h。离心（3 000r/min，15min）除去上层油脂及沉淀。用绸布挤滤，保留滤液。 3．树脂吸附

滤液中加100ml蒸馏水及40g（抽干重）经过处理的Amberlite CG50树脂，于20～25℃搅拌吸附2.5h。倾去上层液体，树脂用蒸馏水洗涤。重复洗涤5～6次。 4．解析

树脂中加50ml l mol/L pH 9.3 NH4C1液，搅拌洗脱lh。洗脱过程中每隔10min测一次pH，整个过程须保证5.2＜pH＜6.0，否则用氨水调节。经布氏漏斗滤过的洗脱液调节至pH7.0，置冰箱或冰盐浴预冷15min。 5．成品收集

在-5℃条件下边搅拌边加入3倍体积冷丙酮，继续搅2min。低温静置20min。离心 （3 000 r/min，15min）收集沉淀，将沉淀移入离心试管中，用10倍量冷丙酮分两次洗涤离心，再用5倍量乙醚洗一次，离心。置真空干燥器内用P2O5干燥得弹性酶粉，称重。 6．活力测定

活力单位定义：在pH 8.8，37℃条件下作用20min，水解1.0mg刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。

100

(1) 标准曲线的制作：取6支试管按下表操作：

管号

刚果红弹性蛋白（mg）

弹性酶液（ml） PH 8.8硼酸缓冲液（ml）

1 5 5 —

2 10 5 —

3 15 5 —

4 20 5 —

5 25 5 —

0 10 0 5

37℃水解60min（间歇搅拌30次）

PH 6.6磷酸缓冲液（ml）

5

5

5

5

5

5

3 000r/min×10min 离心后取上清

A(495nm)

注意：（1）刚果红弹性蛋白称量须准确。

（2）标准液中酶量是过量的，以保证水解完全。

(2)样品测定

精确称取样品5 mg左右（如效价高可适当减少）置乳钵中，加5ml（先加少量）pH 8.8硼酸缓冲液研磨至完全溶解。吸取lml于大试管中，用上述缓冲液配制约每毫升5～10单位的待测液，取3支试管接下表操作：

管号

刚果红弹性蛋白（mg） PH 8.8硼酸缓冲液（ml）

待测酶液（ml）

1 6 4 1

2 6 4 1

0 3 5 0

37℃水解20min（间歇搅拌20次以上）

磷酸缓冲液（ml）

5

5

5

3 000r/min×10min 离心后取上清

A(495nm)

取平均吸收值由标准曲线查得单位数，再由稀释倍数加以换算出弹性酶比活，并折算总

收率。

附：树脂处理：取干Amoerlite CG50树脂，水漂洗后加5倍体积l mol/LNaOH搅拌2h，水洗至中性。加5倍体积lmol/L HC1处理2h，水洗至中性，再用pH 4.5 0.1mol/L醋酸缓冲液平衡过夜。

【思考题】

1． 弹性蛋白酶制备的原理？

2． 影响弹性蛋白酶收率的因素有哪些？

101

实验二十九 超氧化物歧化酶的分离纯化

注：此实验内容来自校企合作课题，成果已经产业化应用

【目的要求】

1．通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。

2．掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。

【实验原理】

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）简称SOD，它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和铁超氧化物歧化酶（Fe- SOD）。SOD催化如下反应：

O2十O2-·＋2H＋ → H2O2＋O2

在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种炎症、放射病及自身免疫性疾病，并具有抗衰老作用，对生物体有保护作用。

在血液里Cu·Zn-SOD与血红蛋白等共存于红血球中，当红血球破裂溶血后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，而Cu·Zn-SOD则留在水-乙醇均相溶液中。磷酸氢二钾极易溶于水，在乙醇中的溶解度甚低，将磷酸氢二钾加人水-乙醇均相溶液中时，溶液明显分层，上层是具有Cu·Zn-SOD活性的含水乙醇相，下层是溶解大部分磷酸氢二钾的水相（比重大）。用分液漏斗处理，收集上层具有SOD活性的含水乙醇相，再加入有机溶剂丙酮，使

SOD沉淀。极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并且需要尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。

Cu·Zn-SOD的pI为4.95。将收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.6的条件下，Cu·Zn-SOD带负电，过DE-32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。目前常用的活性测定方法为邻苯三酚自氧化法，该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感,因此测定时要严格控制这些因素。

本实验以新鲜猪血为原料，通过氯仿-乙醇除去杂蛋白，采用DE-32纤维素进行纯化，并用邻苯三酚法测定SOD的活力。

【实验材料】

1．材料

新鲜猪血。 2．器材

（1）离心机 1台 （2）G3漏斗 1只 （3）抽滤瓶 1只 （4）751型分光光度计 1台 （5）梯度混合器 1台 （6）玻璃柱 1.0cm×10 cm 1根 （7）试管 100支

102

（8）自动收集器 1台 （9）紫外检测仪 1台 （10）移液管 5ml 、1ml 各2支 （11）量筒 1 000ml 、100ml 各1只 （12）烧杯 1 000ml 、500ml、200ml 各2只 （13）分液漏斗 1只 3．试剂

（1）0.9％NaC1；

（2）95％乙醇，氯仿，K2HPO4·3H2O，丙酮； （3）pH7.6，2.5mmol/L磷酸钾缓冲液； （4）pH7.6，200 mmo1/L磷酸钾缓冲液； （5）10 mmo1／L HCl；

（6）6mmol/L邻苯三酚（用10mmol／L HCl作溶剂配制），4℃下保存； （7）2.5％草酸钾，DE-32纤维素；

（8）pH8.2，100mmol/L Tris-二甲胂酸钠缓冲液（内含2mmol/L二乙基三氨基五乙酸）：以200 mmol/L Tris二甲胂酸钠溶液（内含4m mol/L二乙基三氨基五乙酸）50 ml加200m mol/L HC1 22.38 ml，然后用重蒸水稀释至100ml。

【实验方法】

1．酶的制备

（l）分离血球：取新鲜猪血500ml（加人抗凝剂2.5％草酸钾50ml），3 000r/min离心20 min除去血浆，收集红细胞约250 ml，加人等体积0.9％NaC1溶液，用玻璃棒搅起充分洗涤，3 000r/min，离心20 min，弃去上清液（如此反复3次），收集洗净的红细胞放入800ml烧杯中，加250 ml重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40 min以上，得溶血液500ml。 （2）向溶血液缓慢加入在4℃下预冷过的95％乙醇125ml（0.25倍体积），然后再缓慢加入在4℃下预冷过的氯仿75 ml（0．15倍体积），搅拌15 min，室温下3 000r/min离心20 min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330 ml（留样2ml测酶活和蛋白含量）。此即酶的粗提液。

（3）向酶粗提液加入K2HPO4·3H2O（按43gK2HPO4·3H2O／100 ml粗提液的比例），转移到分液漏斗，振摇后静置15 min，见分层明显。收集上层乙醇-氯仿相（微混浊），室 温下离心（3 500r/min）25 min，弃去沉淀，得上清液约150 ml（留样1.5ml测酶活和蛋白含量）。

（4）向上一步得到的上清液加入0.75倍体积在4℃下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3 500r/min离心20 min，收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5ml重蒸水中（呈悬浮状），在4℃下，对250 ml pH7.6，2.5mmol/L的磷酸钾缓冲液透析，每隔0.5h以上，换透析外液l次，共换4次~5次。透析内液如出现沉淀，需在室温下3 500r/min离心25min~30 min，弃去沉淀，收集上清液约7ml（留样0.5ml）。 （5）DE-32纤维素柱层析

DE-32纤维素的处理：称量DE-32纤维素干品5g~6g，用自来水浮选除去1min~2 min不下沉的细小颗粒，用G3烧结漏斗抽干，滤饼放入烧杯中，加适量1mol/L NaOH溶液，搅匀后放置15 min，用G3烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼悬浮于1mol/L HC1溶液中，搅匀后放置10 min后用G3烧结漏斗抽滤。水洗至中性，滤饼再悬浮于1 mo1/L NaOH溶液中，抽滤，水洗至中性，最后将滤饼悬浮于层析性平衡缓冲液中待用。

103

DE-32纤维素使用后的回收处理与上述步骤相同，只是不用HC1，所用NaOH浓度改为0.5 mol/L。将上一步所得离心上清液过DE-32纤维素柱。柱体l.0cm×6cm，用pH7.6，2.5mmol／L磷酸钾缓冲液作层析柱平衡液，用pH7.6，2.5mmol／L（100 ml）~200mmol／L（100 ml）的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。流速30 ml/h，每管收集3ml。 2．酶蛋白浓度的测定

采用紫外吸收法，先测定不同已知浓度标准酪蛋白在280 nm波长处的光吸收值。绘出标准曲线作定量的依据，再测定样品在280 nm波长处的光吸收值，从标准曲线上查出待测样品的蛋白浓度。

3．酶活性的测定

本实验采用邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，它在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2，生成带色的中间产物。反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30s~45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4 min的范围内。中间物在420 nm波长处有强烈光吸收，当有SOD存在时，由于它能催化O2－与H十结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间物的积累，因此，通过计算就可求出SOD的酶活性。

邻苯三酚自氧化速率受pH、浓度和温度的影响，其中pH影响尤甚，因此，测定时要求对pH严格掌握。

（1）邻苯二酚自氧化速率的测定

在试管中按下表1加入缓冲液和重蒸水，25℃下保温20 min，然后加入25℃预热过的邻苯三酚（对照管用10 mmol／L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在420 nm波长处测定A值，每隔30s读数一次，要求自氧化速率控制在0.060A／min（可增减邻苯三酚的加入量，使速率正好是0.060A/min）。 （2）酶活性的测定

酶活性的测定按表2加样，操作与测定邻苯三酚自氧化速率相同。根据酶活性情况可适当增减酶样品的加入量。

酶活性单位的定义：在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶量定义为一个活性单位，即在420 nm波长处测定时，0.030A／min为一个活性单位。若每分中抑制邻苯三酚自氧化速率在35%~65％范围，通常可按比例计算，若数值不在此范围时，应增减酶样品加入量。

邻苯三酚自氧化速率测定加样表

试剂

PH8.2 100mmol/L Tris-二甲胂酸纳缓冲液（内含2 mmol/L二

乙基三氨基五乙酸）

重蒸水 10 mmol/L HCl 6 mmol/L 邻苯三酚

总体积

4.2 0.3 _ 9

4.2 _ 0.3 9

0.2

对照管/ml

4.5

样品管/ml

4.5

最终浓度mmol/L 50

－

104

酶活性测定加样表

试剂

PH8.2 100mmol/L Tris-二甲胂酸纳缓冲液（内含2 mmol/L二乙基三

氨基五乙酸）

酶溶液 重蒸水 6 mmol/L 邻苯三酚 10 mmol/L HCl

总体积

（3）活性和比活的计算公式

总活性单位＝每毫升酶液活性单位（U/ml）×酶原液总体积

每毫升酶液活性单位（U/ml）比活＝ ＝

每毫升蛋白浓度（mg/ml） 总活性单位（U） 总蛋白（mg） — 4.2 — 0.3 9 0.1 4.1 0.3 — 9 0.2 对照管/ml

4.5

样品管/ml

4.5

最终浓度mmol/L

【思考题】 1．SOD对人体有何生物学意义？

2．有机溶剂沉淀SOD根据的原理是什么？

105

实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析

注：此实验来自项目重组E.coli L-门冬酰胺酶制备研究（科技部）的成果

【目的要求】

1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。

2．掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。

【实验原理】

L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，EC3.5.1.1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。

用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。国内目前用药全靠进口。1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌， 重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。

本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。 rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。取1 ml0.04 mol/L L-门冬酰胺，1 ml 0.1 mol/L pH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液，0.2 ml细胞悬液或酶液于37℃保温15 min，速加1 ml 50%三氯乙酸终止反应，4 000 r/min离心沉淀细胞。取上清液1 ml，加奈氏试剂2 ml和双蒸水7 ml，放置15 min后，于500 nm波长比色。在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=0.07时为1 U）。

比活力测定方法为：精称纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。

【实验材料】

1．器材

（1) 基因工程菌菌种：E.coli/pANS2为本实验室保存；

（2) 其他同前实验二十三器材。

2．试剂

106

重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备和酶活力测定： （1) 培养基：

种子培养基（LB 液体培养基）；

发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L， pH7.0，高压灭菌。接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素。 （2) 氨苄青霉素(Amp)；

（3) 破壁液：45%蔗糖，10 mmol/L EDTA，200mg/L溶菌酶，pH 7.5；

（4) 奈氏试剂：称碘化钾5g加入5ml蒸馏水中，边搅拌边滴加25％氯化汞饱和液至稍有红色沉淀出现。再加40ml 50％氢氧化钠溶液，最后用蒸馏水稀释至100ml，混匀入棕色试剂瓶中置暗处保存；

（5) 1 mol/L氯化锰（MnCl2）； （6) 5 mol/L 磷酸缓冲液(pH6.4)；

（7) pH8.4硼酸缓冲液：0.858g硼砂(MW=381.37)， 0.680g硼酸(MW=61.83)，用蒸馏水稀释至100 ml； （8) 溶菌酶； （9) 蔗糖； （10) 氯化钠；

（11) 三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）； （12) 乙醇； （13) 氢氧化钠； （14) 硫酸铵；

（15) 谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）； （16) 四甲基乙二胺（EDTA）； （17) 盐酸；

（18) 玉米浆；

（19) 低分子量标准蛋白(14. 4 ～94 K Da)； 12%SDS-PAGE电泳分析： 同实验九。

【实验方法】

1．工程菌发酵培养

（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为100 μg/ml )的LB液体培养基中，37℃，摇床转速220 r/min，培养至OD600为0.48～0.6h。

（2）摇瓶培养：再按2%接种量转接于发酵培养基(三角瓶20%装液量)中，37℃，250r/min，20h，12 000r/min离心收集细胞。

（3） 批式发酵培养：20L的发酵罐装入14L发酵培养基, 初始pH值为7.0，121℃下灭菌20 min，待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为100μg/ml ，接入种子液700ml，37℃培养12～14h， 罐压力0.05Mpa。 2．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ分离纯化制备

（1）蔗糖溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶

将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中，在30℃温和振荡70 min后搅拌下倾入大量水中，4 ℃，边搅拌边加入1 mol/L MnCl2 (7.5%，V/V) ，沉淀核酸和菌体碎片， 8 000r/min，离心30min，收集上清液即得酶提取液。采用Lowry法和Peterson修订法分

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别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。

（2）硫酸铵分级沉淀

在酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度，调pH到7.0，冰水浴磁力搅拌60 min，4 ℃静置过夜，12 000r/min离心10min除去沉淀。再在上清液中加入硫酸铵至90%饱和度，调pH至等电点附近（约pH5.0）， 搅拌60 min，4 ℃静置过夜，12 000r/min离心10min，收集沉淀。采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。

（3）透析脱盐

上述沉淀物用5 mol/L 磷酸缓冲液(pH6.4)溶解，透析脱盐。 （4) DEAE-52阴离子交换柱层析

DEAE-纤维素柱经5 mmol/L磷酸缓冲液 (pH6.4)平衡后，上样品脱盐酶液，用相同缓冲液洗涤至基线平稳，改用50 mmol/L磷酸缓冲液(pH6.4)洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min,每管收集6ml，测定每管的A280值和酶活性。绘制洗脱曲线。收集显示酶活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶冻干粉。采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。

3．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ酶活性测定

吸取1ml菌液入Ep管，12 000 r/min离心5min，收集菌体弃去上清，加入蒸馏水1ml洗涤，混悬，12 000r/min离心5min，弃上清。重复上述操作2～3次，加入pH8.4硼酸缓冲液1ml混悬。

准备一组(2支)蒸馏水准备管：取10ml的洁净试管2只，每管加3.5ml蒸馏水。 另取2支10ml的洁净试管，分别加入0.04 mol/L天冬酰胺底物，0.1 mol/L pH8.4硼酸缓冲液各1ml，37℃水浴5min，其中一只加入细胞悬液20μl，另一支为对照管。反应15min后分别加入50%三氯乙酸1ml终止反应。再从终止反应管中各支取500μl进蒸馏水准备管，每管分别加入与25%NaOH以1:1配好的奈氏液1ml显色，500nm处测OD值。

计算： 酶活力(U)=[(OD×1000)/(0.07×15x)]×(3+x/1000)

x为取样体积(本实验为20μl)

4．比活力测定方法

精确称取纯化产物10mg，溶解于1 mlH2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。

5．12%SDS-PAGE电泳分析样品纯度

电泳方法同实验九。

（1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度12％。

（2) 将发酵收获的细胞、酶提取液、硫酸铵分级沉淀和离子交换洗脱液样品处理后，进行电泳分析。

（3) 电泳2～3h后，取出凝胶，用0.15%考马斯亮蓝-R250进行染色。过夜后倾出染液，不断脱色，起初每20min换液1次，1h后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区带图谱。 6．结果处理

（1）用箭头图表示重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备的操作流程。 （2）绘制洗脱曲线。

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（3）重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析

重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析

纯化步骤 总蛋白(mg) 总活力(U) 比活(U/mg) 纯化倍数 收率(%) A.粗提酶液

B.硫酸铵沉淀 C.DEAE-52 纤维素柱层析

（4) 电泳图谱分析

【思考题】

1．试说明电泳图谱，并用电泳图谱判断所制得的重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯度。 2．影响重组L-门冬酰胺酶Ⅱ纯度和收率的因素有哪些？如何加以控制？ 3．硫酸铵分级沉淀的机理？

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