植物细胞工程实验(1)

植物细胞工程

实验一 培养基母液的制备

一、实验目的与意义

学习和掌握培养基母液的配制方法。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

二、实验器材

电子天平（称量为0.0001g）、电子天平（称量为0.01g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、细口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、药勺、玻璃棒、电炉。

三、实验药品

NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、 H3BO3、 MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、 Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸。

四、实验步骤

每种母液均配制500ml，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制

表1 MS培养基大量元素母液制备

序号 1 2 3 4 5

各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到500ml的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液50ml。

药品名称

NH4NO3 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4

培养基浓度（mg/L）

1650 1900 440 370 170

扩大20称量(mg)

16500 19000 4400 3700 1700

蒸馏水定容至500ml 备注

注意：

①配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42、Mg 2和H2PO4等在一起可能

一

十

一

发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42、Mg 2和H2PO4等离子错开混合，速度宜慢，

一

十

一

边搅拌边混合。

②CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。 ２、微量元素母液的配制

MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O。按照表2配方，用称感量为0.0001g的电子天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1 L培养基，取微量母液5ml。

表2 MS培养基微量元素母液的配制

序号 1 2 3 4 5 6 7

注意：

使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。 3、铁盐母液的配制

铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液5ml。

表3 MS铁盐母液的配制

序号 1 2

注意：

在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。 4、有机母液的配制

MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子天平。 注意：

由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度

化合物名称 Na2-EDTA FeSO4·7H2O

培养基浓度（mg/L）

37.3 27.8

扩大200倍称量(mg)

3730 2780

化合物名称 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI

Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O

培养基浓度（mg/L）

22.3 8.6 6.2 0.84 0.25 0.025 0.025

扩大200倍称量(mg)

2230 860 620 84 25 2.5 2.5

降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是：配制母液时用无菌双蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。

表4 MS培养基有机物质母液的制备 序号

化合物名称

培养基浓度（mg/L）

1 2 3 4 5

5、激素母液配制

植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：

①配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

②细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。

③配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。 注意：

所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。

甘氨酸 肌醇 盐酸硫胺素(VB1) 盐酸吡哆素(VB6)

烟酸

2 100 0.1 0.5 0.5

扩大200倍称量(mg) 200 10000 10 50 50

五、思考题：

1、配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl2·2H2O时，为什么要将蒸馏水加热？ 2、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。

培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。

表5 按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表

药品名称 大量元素 微量元素 铁盐 有机物质 6-BA KT NAA 蔗糖 母液浓度 1L培养基母液吸取量 0.3L培养基母液吸取量 20倍液 200倍液 200倍液 200倍液 0.5mg/ml 0.5mg/ml 0.5mg/ml 琼脂 PH值 5.8

实验二 培养基的配制与灭菌

一、实验目的与意义

学习培养基配制与灭菌的操作方法。

对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。

二、实验器材

电子天平、烧杯（1000ml）、医用搪瓷量杯（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。

三、实验药品

蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。

四、实验步骤

（一）、培养基配制（以1L MS培养基为例） 1、计量

根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000 ml/母液浓度（mg/L）。 2、移液

取医用瓷一只，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷缸中备用。 注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。

③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错；

④移液管不能混用。 3、称取

称取7g琼脂，30g蔗糖备用 4、融化

用搪瓷杯量取600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。 注意：

在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。 5、混合

将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。 6、调pH

用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。 注意：

调配时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。 7、分装

溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基，可分装25～30瓶。 8、包扎

用封口膜封口，扎好绳子，用记号笔做好标记 注意：

培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。 （二）培养基的灭菌

培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。

1、高压蒸汽灭菌法

把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指针移至1.1～1.2kg/cm时，即121℃时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。取出培养基，待培养基自然冷却凝固。放置1 d后再使用。

表1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间

容器的体积(ml)

20~50 75~150 250~500 1000

在121℃下最少灭菌时间(min)

15 20 25 30

2

2

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/i3md.html