新实验指导2 - 图文

实验室规则

医学遗传学是高等医学院校本科生的重要生物医学课程，医学遗传学实验是现代医学研究的基础之一，它正在渗透到基础医学和临床医学的各个领域之中。医学科学的发展与实验技术的不断提高和创新密不可分，现代医学的发展要求医学生具有扎实的生物学基础和基本的实验操作能力。为此，在医学遗传学实验中，同学们应该掌握基本操作技能，勤于动手，培养自己认识问题和解决问题的能力。为了保证实验课的学习效果，特制订以下规则，请同学们共同遵守。

1. 不迟到、不早退。一定要穿白大衣准时进入实验室，上课期间保持安静，不做与实验无关的事情。

2. 课前认真预习，了解实验目的、原理和方法，准备好实验用品（实验指导、绘图本、绘图笔、尺子、橡皮等）。

3. 实验时认真操作，仔细观察，做好实验记录，认真书写作业与思考，按时完成作业。

4. 操作时注意安全，不要擅自离开。爱护各种仪器、设备、标本，如有损坏应及时向老师报告，主动登记，必要时按价赔偿。

5. 保持实验室整洁，实验完毕，主动清理好实验用品，放回原处。 6. 显微镜使用完毕后认真填写使用登记卡。

7. 值日生要清理实验用具，打扫卫生，并关好门、窗、水、电。

目录

实验一 人类的皮纹分析 ................................................... - 1 - 实验二 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 .... - 7 - 实验三 人类染色体G显带技术 ...................................... - 12 - 实验四 人类染色体C显带技术 .................................... - 15 - 实验五 人类染色体的核型分析 ....................................... - 18 - 实验六 人类X染色质的制备与观察 ............................. - 21 - 实验七 微核检测技术 ..................................................... - 25 - 实验八 ABO血型的测定及其基因频率的计算 ............. - 27 - 实验九 人类单基因性状遗传 ......................................... - 29 - 实验十 苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算 .......... - 34 - 实验十一 遗传咨询 ......................................................... - 37 - 实验十二 人类基因组DNA的提取 ................................. - 40 - 实验十三 聚合酶链式反应（PCR） ............................... - 44 - 实验十四 DNA的琼脂糖凝胶电泳 .................................. - 46 - 实验十五 PCR-RFLP技术 ................................................ - 48 - 实验十六 人类遗传病 ..................................................... - 51 -

实验一 人类的皮纹分析

一 实验原理

皮纹学是一门起源于西方的应用科学，目前广泛应用于人类学、遗传学、法医学以及作为临床某些疾病的辅助诊断。皮纹学（Dermatoglyphics）系指手指、手掌、脚掌等处皮纹的呈现形态。皮纹包括指纹、掌纹和足纹。人类的皮肤由表皮和真皮构成。真皮乳头向表皮突起，形成许多排列整齐、平行的乳头线，此线称为嵴纹，嵴纹上有许多汗腺的开口。突起的嵴纹相互又形成凹陷的沟。这些凹凸的纹理就构成了人体的指（趾）纹和掌纹。人体的皮纹既有个体的特异性，又有高度的稳定性。

手指末端腹面的皮纹称为指纹。指纹是在三个月的胎儿时期形成的，形成后终生不变。根据纹理的走向和三叉点的数目，可将指纹分为三种基本类型：弓形纹、箕形纹和斗形纹。弓形纹（Arch，A）：特点是嵴线由一侧至另一侧，呈弓形，无中心点和三叉点。根据弓形的弯度分为简单弓形纹和篷帐式弓形纹。箕形纹（loop，L）：箕形纹俗称簸箕，在箕头的下方，纹线从一侧起始，斜向上弯曲，再回转到起始侧，形状似簸箕。此处有一呈三方向走行的纹线，该中心点称三叉点。根据箕口朝向的方位不同，可分为两种：箕口朝向手的尺侧者（朝向小指）称正箕或尺箕；箕口朝向手的桡侧者（朝向拇指），称反箕或桡箕。斗形纹（whorl，W）：是一种复杂、多形态的指纹。特点是具有两个或两个以上的三叉点。斗形纹可分双箕斗、环形纹、螺形纹和囊形纹等。根据统计，指纹的分布频率因人种而异，存在种族、性别的差异。东方人尺箕和斗形纹出现频率高，而弓形纹和桡箕较少；女性弓形纹多于男性，而斗形纹较男性略少。

指纹中的箕形纹和斗形纹具有3组纹线交叉在一起，这3组纹线的交叉点称为三叉点，计算三叉点与指纹中心的连线上的纹嵴数即得一个手指的纹嵴数。弓型纹没有三叉点，纹嵴数为0。将十指的纹嵴数相加，即得总指嵴数。

指纹上携带者大量的信息，体内环境失衡的变化，各种疾病的征兆，情绪心里变异带来的能量物质代谢变化，以及遗传作用等因素，都可以完整地反映在手上，并留下暂时或长久的纹线。观察纹线变异、颜色和部位等变化，有助于诊断各种疾病。 二 实验目的

1 掌握人类的指纹纹型及各种纹型的特征 2 学习和掌握建立各自的指纹图 3 掌握atd角的计算方法

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4 了解染色体病患者指纹的分布特点 5 了解皮纹分析在遗传学中的应用 三 实验材料和器具

材料：白纸、直尺、铅笔、透明胶带、2B以上铅笔。 器具：放大镜、量角器。 四 实验步骤

1 无油墨法采集皮纹样本

实验前将双手洗净、擦干，用铅笔在白纸片上涂黑5cm见方的一小块。将要取指印的手指在涂黑的区域中涂抹，直至将整个指尖涂黑。剪一条宽度与相应手指节长度相当的透明胶带，从指尖的一侧裹至另一侧，轻压，再接下来，上面即附着有你相应的手指指纹。将富有你指纹的透明胶带接下来，之后将其贴在表1中相应的位置。 2 指纹观察

利用放大镜或肉眼直接进行自己手部皮纹的观察和分析，结果写在表1中的相应位置。

手指末端腹面的皮纹称为指纹。根据纹理的走向和三叉点的数目，可将指纹分为三种类型：弓形纹、箕形纹、斗形纹。

1、弓形纹：特点是嵴线由一侧至另一侧，呈弓形，无中心点和三叉点。根据弓形的弯度分为简单弓形纹和篷帐式弓形纹。

2、箕形纹：箕形纹俗称簸箕。在箕头的下方，纹线从一侧起始，斜向上弯曲，再回转到起始侧，形状似簸箕。此处有一呈三方向走行的纹线，该中心点称三叉点。根据箕口朝向的方位不同，可分为两种：箕口朝向手的尺侧者(朝向小指)称正箕或尺箕；箕口朝向手的桡侧者(朝向拇指)，称反箕或桡箕。

3、斗形纹：是一种复杂、多形态的指纹。特点是具有两个或两个以上的三叉点。斗形纹可分绞形纹(双箕斗)、环形纹、螺形纹和囊形纹等。

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根据统计，指纹的分布频率，存在种族、性别的差异。东方人尺箕和斗形纹出现频率高，而弓形纹和桡箕较少；女性弓形纹多于男性，而斗形纹较男性略少。

3 不同指纹类型指纹嵴数计算

弓形纹由于没有圆心和三叉点，之纹嵴数计数为零。箕形纹和斗形纹，则可从中心到三叉点中心绘一直线，计算直线通过的嵴纹数。斗形纹因有两个三叉点，可得到两个数值，只计多的一侧数值。双箕斗分别先计算两圆心与各自三叉点连线所通过的嵴纹数，再计算两圆心连线所通过的嵴纹数，然后将三个数相加起来的总数除以2，即为该指纹的嵴纹数。 4 指纹纹嵴总数（TFRC）的计算

指纹总数为10个手指嵴纹计数的总和。正常男性（46，XY）嵴纹总数的平均数为145；正常女性（46，XX）嵴纹总数的平均数为127；核型为48，XXYY的患者嵴纹总数的平均数为106；核型为47，XXY的患者嵴纹总数的平均数为114；核型为49，XXXYY的患者嵴纹总数的平均数为93；核型为49，XXXXY的患者嵴纹总数的平均数为49。

5 掌纹中atd角的测量

手掌分为六个区：大鱼际区、小鱼际区和四个指间区。大鱼际区位于拇指下方。小鱼际区位于小指下方。在食指、中指、无名指和小指的根部，都有由三个方向来的纹线集成的三叉点，分别标为a、b、c、d点。正常人手掌靠腕部的大、小鱼际之间，具有一个三叉点，称轴三叉或t三叉。从三叉点a和三叉点d分别画直线与t三叉点相连，即构成atd角。可用量角器测量atd角度的大小，并确定三叉点t的具体位置。三叉点t的位置离掌心越远，也就离远侧腕关节褶线越近，atd角度数越小；而三叉点t的位置离掌心越近，离腕关节褶线越远，atd角就越大。我国正常人atd角的平均值为41o；先天愚型儿atd达70 o 。

6 指褶纹和掌褶纹

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褶纹是手掌和手指屈面各关节弯曲活动处所显示的褶纹。实际上褶纹不是皮肤纹理，但由于染色体病患者的指褶纹和掌褶纹有改变，所以列入皮纹，进行观察讨论。

1、指褶纹：正常人除拇指只有一条指褶纹外，其余四指都有2条指褶纹与各指关节相对应。

2、掌褶纹：

(1)普通型：正常人手掌褶纹主要有三条，分别是：远侧横褶纹、近侧横褶纹、大鱼际纵褶纹。

(2)通贯掌：又称猿线。由远侧横褶纹与近侧横褶纹连成一条直线横贯全掌而形成。

(3)变异I型：也称桥贯掌。表现为远侧和近侧横褶纹借助一条短的褶纹连接。

(4)变异Ⅱ型：又称叉贯掌。为一横贯全掌的褶纹，在其上下各方伸出一个小叉。

(5)悉尼掌：表现为近侧横褶纹通贯全掌，远侧横褶纹仍呈正常走向。这种掌褶纹多见于澳大利亚正常悉尼人群中，故称悉尼掌。

五 [作业与思考]

1 请简述人类指纹的纹型有哪些类型，各有哪些特点？

2 将自己指纹纹型的类型及纹嵴数填入下表中，并计算指嵴纹总数（TFRC）。

3 分别计算全班男同学和女同学指纹纹嵴总数的平均值。

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附图和表

图1 指纹的各种类型

图2 指纹的嵴纹计数

图3 atd角、t位置变化及t距百分比示意图

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表1 我的指纹图形及纹嵴数 姓名 左手 贴指纹处 指纹类型 纹嵴数 右手 贴指纹处 指纹类型 纹嵴数 拇指 拇指 食指 中指 环指 小指 性别 食指 中指 民族 环指 小指 - 6 -

实验三 人类染色体G显带技术

一、实验目的

1、了解人类染色体G显带技术方法 2、掌握镜下各号染色体G带带型。

二、实验原理

人们利用不同的方法和染料处理染色体标本后，可使每条染色体上出现

明暗相间，或深浅不同的带纹，称为显带技术。这一技术的应用，可以准确识别23对不同类型的染色体，并能识别同一号染色体上的不同区带。从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊断提供了有效的手段。上世纪70年代以来，显带技术得到很大发展，人染色体经胰蛋白酶或EDTA（乙二胺四乙酸二钠）等试剂处理后，再用Giemsa染料染色，染色体上出现深浅交替的横纹，即染色体的G带。在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带、N带），G带是应用得最广泛的一种技术。因为G显带技术具有设备要求低、试剂便宜、G显带标本稳定而易于保存及观察方便等优点。

关于G带的形成机理，迄今尚不十分清楚。有人认为，在胰酶的作用下，蛋白质不均匀丢失是G带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后，这些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域，由于蛋白质丢失少而呈现深染(深带)。还有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋白破坏，这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为，染色体上T—A和C—G碱基的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。A—T碱基对较多的区域，易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；而G—C碱基对较多的区域则相反，染成浅染区带。总之，目前说法较多，但主要概括了三种观点，即显带是由于:①DNA的作用；②蛋白质的作用；③DNA、染料和蛋

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白质三者之间相互作用的结果。这些都有待于进一步研究探讨。可以肯定，G显带具有很多优点，如制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清晰，成本低廉，制备周期短，普通光学显微镜即可观察。故已成为当今细胞遗传学与分子细胞遗传学领域中应用广泛的一种技术，并成为研究分析染色体的主要常

规方法之一。

三、实验用品

1、器械：恒温水浴锅、温度计、60ml立式染色缸、吸管、滴头、电吹风。 2、试剂： 0．02％胰酶溶液、0．4％酚红溶液、1NNaHCO3 、10%Giemsa 染液、 pH6．8磷酸缓冲液、 0．85％NaCl溶液。

3、标本：外周血培养按常规法制作染色体标本（白片）。

四、实验内容

（一）、G显带标本制备

1、外周血培养按常规法制作染色体标本，置75℃烘箱烘2~8小时或置室温自然老化3~7天左右。

2、将0.02％胰蛋白酶溶液倒入染色缸中，加入0．4％酚红溶液2滴，并以1NNaHCO3调节PH 7.0 左右，使颜色为橙色。混匀后，置于37℃水浴锅恒温。

3、将经过老化的标本片投入0.02％胰蛋白酶溶液中消化30～60秒。 4、取出已消化的标本片，立即投入磷酸缓冲液中，冲洗残留的胰酶。 5、用10%Giemsa染液染色10分钟。 6、自来水冲洗，凉干或电吹风吹干后镜检。

（二）、镜检

先在低倍镜下选择分散良好、长度适中的中期分裂相，然后转至油镜下观察G带带型。选择带纹清晰的分裂相进行分析，并在作业与思考纸上绘出快速线条分裂相，标明各条染色体序号。

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五、注意事项

1、G显带的好坏，首先取决于染色体本身制片的质量，染色体长度要适中，以早中期为宜，且中期相丰富、分散好，无胞浆背景。若染色体边缘发毛，为显带过头，若染色体上未出现带纹，则为显带不足，根据具体情况调整显带时间。

2、标本片龄不宜太长，片龄越长，细胞对胰酶处理的抵抗性越强，片龄过长的标本染色后会导致斑点状而非带纹。

3、酶温度和处理时间需控制好，一般胰酶处理时间不少于30秒。

[作业与思考]

1、

什么是G带？为什么说G显带是应用最广泛的一种技术？

2、镜下观察并绘出一G带染色体核型图，在每个染色体旁标明其序号。

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实验四 人类染色体C显带技术

一、实验目的

1、学习C显带标本制作方法、了解C显带技术原理。 2、掌握C显带染色体的基本特征。

二、实验原理

用强碱溶液加热处理染色体标本使其DNA变性后，再以温热的盐溶液处理使其复性时，由高度重复DNA序列组成的染色体结构性异染色质区域的DNA复性速度要明显快于其它区域，因而易被Giemsa染液深染，在染色体上呈现出特有的着丝粒和次缢痕深染区，即所谓的C带，也称为着丝粒异染色质带。而常染色质只能显示较淡的轮廓。由于人类的第1号、9号、16号染色体长臂近着丝粒处为次缢痕区（结构异染色质区），Y染色体长臂远端也为异染色质部分，因此这些区域均可显示出非常明显C带，故此法可以准确鉴别第1号、9号、16号和Y染色体，还用于确定着丝粒的位置和数目，配合其它显带技术可鉴别部分染色体的结构异常，如双着丝粒染色体、环状染色体等。不同个体的染色体，其C带的大小和染色强度不同，可呈现出多态性，因此，C带技术在多态性研究和分析染色体来源等方面均有较大的价值。

三、实验用品

1、器材：玻璃染缸、滴管、烧杯、水浴锅。

2、试剂：0．2 N HCl、5％Ba（OH）2溶液、2×SSC缓冲液、Giemsa染液。

3、材料：按常规法制作的染色体标本。

四、实验内容 （一）、方法1

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1、将标本放入已预温至60℃的5％Ba（OH）2 溶液中处理5分钟。 2、用预热到60 oC的自来水冲洗，以除去钡垢。

3、将标本投入预温到60 oC的2×SSC溶液中温育30~60分钟。 4、取出后用自来水冲洗干净。

5、用Giemsa染液染色10分钟，水洗，空气干燥，镜检。

（二）方法2

1、将制好的玻片放入 0.2 N HCl中15~30分钟后用自来水冲洗。 2、浸入预温至56 oC 的5％Ba（OH）2 溶液中处理10~30秒。 3、用预热到56 oC的自来水冲洗，以除去钡垢。

4、将标本投入预温到60 oC的2×SSC溶液中温育30~60分钟。 5、水洗后用Giemsa染液染色30～60分钟。 6、流水冲洗，晾干，镜检。

将干燥后的标本置显微镜低倍镜下观察，找到分散好的、染色体长度适宜的分裂相，换油镜观察。注意观察各染色体的着丝粒区深染，尤其是第1号、9号、16号染色体着丝粒区及次缢痕区深染，两者合在一起形成明显大的C带，Y染色体长臂远侧段约1/2～2/3区段深染，C带明显。第1、9、16号染色体和Y染色体长臂的C带具有多态性。

五、镜检

由低倍镜找到合适的细胞分裂相，然后换油镜观察。注意1、9、16号染色体的C带和Y染色体长臂的远端带有明显的形态变异性。C带标本的带型特征：

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2）卡宝品红染液（最好在使用前两周配制出来，效果会更好）： 储存液：3g碱性品红溶于100ml70%酒精中。（此溶液可放置几个月） 染液：5%苯酚 90ml

储存液 10ml 福尔马林 10ml 冰醋酸 10ml

将上述几种物质混匀，静置24小时，过滤，即可使用。

四 实验步骤

1 刮取口腔粘膜上皮细胞

受检者用清水漱口数次，用洁净牙签从口腔两侧刮取粘膜，原位刮2～3次，第一次舍去，第2，3次分别涂于干净载玻片（载玻片要非常干净，这样材料才能粘的比较牢，这一点在用口腔粘膜上皮细胞制备X染色质小体时尤其重要）上。 2 固定

不要让玻片上的材料干燥，迅速滴固定液1滴于载玻片上，固定20min。如果让材料在空气中干燥，会使细胞变形。 3 冲洗

固定结束后，蒸馏水洗2～3min，注意一定使用小水流，以免将细胞冲洗掉。 4 解离

冲洗完后，用盐酸37℃水浴（或室温条件）解离20min，晾干。盐酸解离的目的是水解核中的RNA，除去可着色的富RNA小体，防止它们与富DNA性染色质混淆。如果过度水解，会破坏DNA，而水解不够则不能除去紧邻核仁的富RNA小体。 5 染色

在晒干的载玻片上滴加1～2滴卡宝品红染液，染色20～30min（勿干），

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细水洗去染液，晾干。 6）镜检观察X染色质。 五 结果辨析

在光学显微镜下可见到X染色质为一紧密结构，轮廓清晰染色较深的小体（如下图）。一般说来，在动物细胞中，X染色质可以处于三种不同的位置，如可以处在靠近核仁位置、也可以靠近核膜边缘，或者自由的处于核区内。但对于每一特定的物种来说，这种位置是相对恒定的，如人类X染色质往往紧贴核膜内缘，约1μm大小。

处于核膜内缘的X染色质在进行压片时，也有可能被压在核的中央。在这种情况下，X染色质很可能与细胞核中其他着色的物质相混。为了保险起见，在进行X染色质计数时，我们通常只计数靠近核膜边缘的浓染小体。

图1 X染色质示意图

六 [作业与思考]

1 我们是否可以用X染色质的制备方法把“先生”和“女士”分开呢？ 2 是否在所有的正常女性细胞中都能看到X染色质？ 4 X染色质的制备中，盐酸解离的目的是什么？ 5 在下表中填入相应的内容

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编号 X小体数 表型 性别

性染色体配比

核 型

1 2 3 4 5 6 7 8

0 0 1 1 2 2 3 3

正常男性 不正常女性 不正常男性 正常女性 不正常男性 不正常女性 不正常男性 不正常女性

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实验七 微核检测技术

【目的要求】

1、掌握人体外周血淋巴细胞微核检测技术(有丝分裂阻断法微核检测技术)。

2、熟悉微核的形态特征。

3、了解微核检测的实际意义和应用范围。

【实验原理】

微核是游离于细胞质中的核物质小体。其大小一般是主核的1/3～1/4。微核是染色体畸变的一种特殊表现形式，是由细胞分裂后期滞留的染色体断片或整条染色体在子代细胞分裂间期的细胞质中形成的游离团块物。由于染色体受化学诱变剂和辐射损伤而断裂成一些无着丝粒的染色体断片或受到纺锤体的毒物作用，纺锤体受到损伤，当细胞进入分裂后期时，不受纺锤丝牵引而滞留在赤道板附近，在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，由于比主核小得多，故称微核。微核同主核一样，是由DNA物质所组成。现已证实，微核率同外界作用因子的剂量呈线性正比关系。因此，微核检测技术已广泛应用在辐射防护、损伤，化学诱变剂研究和新药、保健食品的毒理实验中。

微核的形成需要经过一次细胞分裂。有丝分裂阻断法微核检测技术是利用一定浓度的细胞松弛素B阻断淋巴细胞细胞质的分裂而不影响细胞核的分裂，故在淋巴细胞培养过程中加入细胞松弛素B，使经过一次分裂的淋巴细胞呈双核，选择这部分细胞进行微核计数而提高了实验的敏感性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。

【实验准备】

1、试剂：已配好的营养液(20％小牛血清+80％RPMI—1640+PHA)、100μg／mL浓度的细胞松弛素B、0.075moL／L KCl、甲醇—冰醋酸固定液(3:1)、Gierma染液、香柏油、二甲苯。

2、器材：超净工作台、光学显微镜(附照相设备)、隔水式恒温培养箱、离心机、冰箱、高压蒸汽消毒锅、鼓风干燥箱、无菌正压滤器、分析天平(感量1／10毫克)、架盘天平、链霉素培养瓶及瓶塞、肝素小瓶及瓶塞(取血用)、10mL吸管、直头小吸管、5mL刻度离心管、2mL或5mL一次性注射器、量筒、烧杯、搪瓷盆、搪瓷盘、试管架、片盘、片盒、止血带、棉签、大吸球、小

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吸头、pH试纸、废液缸、解剖剪刀、镊子、记号笔、4C预冷的载玻片、酒精灯、火柴、染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等。

【实验材料】

肝素抗凝的正常人静脉血。

【实验内容、方法】 一、血培养

1、取静脉血0.5mL～lmL注入两个含5mL培养液的培养瓶中，置370C温箱培养。为了增加微核率便于实验观察，在血培养前正常人静脉血可经60Co照射。

2、细胞培养至40～42小时，培养瓶中加入100μg／mL的细胞松弛素B 0.3mL/瓶(终浓度：6μg/mL)，继续培养30小时。即培养至70～72小时收获细胞。

二、制片

1、将培养物移至5mL离心管，以1000r／min离心10分钟，弃上清液，留底物，加入3mL预温(370C)的0.075mol／L KCl和2mL固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)混匀。

2、混匀后，以1000r／min离心10分钟，弃上清液，加4Ll固定液吹匀，室温固定10分钟，离心。再重复一次。

3、弃上清液，留底物，加0.5mL固定液，吹打均匀，滴片，空气干燥。 4、Giemsa染液扣染20分钟，自来水冲片，空气干燥，显微镜观察。 三、微核观察、分析及计数

首先用低倍镜观察选择染色和细胞分散好的区域，换高倍镜或油镜观察计数。一般情况下，计数1000个胞浆完整的双核淋巴细胞(每瓶计数500个)，经60Co照射过的淋巴细胞微核率明显高于未照射过的细胞。所计数的微核要求与主核完全脱离，多呈圆形，边缘光滑，着色与主核一致，小于主核的1/3。一个细胞中，不论出现几个微核，均按一个细胞计数。

【注意事项】

在微核标本的制备过程中，动作要轻，离心速度要准确，以免细胞破碎，微核丢失。

【作业与思考】

1、随机观察500～1000个细胞并计算微核细胞率。 2、简单叙述微核的形成机理及微核检测的实用价值。

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实验八 ABO血型的测定及其基因频率的计算

【目的要求】

了解ABO血型的测定方法，熟悉ABO血型基因频率的计算方法。

【实验原理】

根据红细胞抗原的有无和血清中抗体的存在情况，是否发生凝集反应来确定血型。

血 型 红细胞抗原 血清中的凝集素 A型 A 抗B B型 B 抗A AB型 A、B 无 O型 无 抗A抗B

【实验准备】

载玻片、一次性采血针、酒精棉球、干棉球、A、B标准血清、显微镜。 【实验材料】 耳垂血或手指血

【实验内容、方法】 (一)ABO血型的测定：

1、一张清洁的载玻片，于左半部加一滴A型标准血清(含抗B凝集素)，于右半部加一滴B型标准血清(含抗A凝集素)。

2、用酒精棉球消毒耳垂，用一次性采血针刺耳垂。待出血后用一次性采血针的一端沾血少许，搅拌在A型标准血清中，拌匀后再用一次性采血针的另一端沾血少许，搅拌在B型标准血清中。切记不能使A、B血清相混。

静置1分钟后，观察凝集现象。凡红细胞分散者为不凝集，而红细胞成群且有粘连者为凝集。不明显的用显微镜观察。按下表判定血型。

A型血清 B型血清 血型

- - O型 + - B型 - + A型 + + AB型

(凝集者画“+”，不凝集者记“-”)

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(二)ABO血型基因频率的计算法：

根据检查血型的结果，计算出各血型(表现型)的频率，假设其为遗传平衡群体，根据下列公式算出基因频率。

表现型 A型 B型 O型 AB型 基因型 IAIA+IAi IBIB+IBi ii IAIB

频 率 p2+2pr(或A) q2+2qr(或B) r2(或O) 2pq(或AB)

i的频率r=√O IA的频率p=1-√B+A IB的频率q=1-√A+O

【作业与思考】

计算出本班或本年级ABO血型的基因频率。

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实验九 人类单基因性状遗传

一 实验原理

人类性状遗传有些受单基因控制（由1对基因決定），表现为质量性状遗传；有些受多基因控制（由2对或2对以上基因所決定），表现为数量性状遗传；某些遗传性状与遗传病密切相关，因此，掌握遗传性状的基本特征，可为遗传病的诊断提供参考。 二 实验目的

1 了解人类常见的单基因遗传性状 2 区分数量性状和质量性状

3 掌握对单基因遗传性状家系的分析方法 三 实验材料、器具和试剂

材料：参试人员的外貌特征。 器材：放大镜、量角器等。 四 实验步骤

1 耳垂遗传

人群中在耳廓下方有半圆稍隆起的耳壳称耳垂，有些人有耳垂，有些人则无耳垂。该性状是受一对等位基因所控制的，有耳垂为显性性状，无耳垂为隐性性状。

与脸颊分离，有耳垂； 紧贴脸颊，无耳垂

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2 卷舌和翻舌遗传

在人群中，有的人能够卷舌（tongue rolling），即舌的两侧能在口腔中向上卷成筒状，称为卷舌者（tongue roller），受显性基因（T）控制，有的人则不能。大家可相互观察，或对镜观察自己是否具有卷舌能力。或对自己的家族进行调查，绘系谱图，确定该性状的遗传特性。

卷舌 不能卷舌

3 前额发突遗传

在人群中，有些人前额发际（hair line of the forebead）基本上属于平线，有些人在前额正中发际向下延伸呈峰形，即明显地向前突出，形成V字形发，称寡妇尖（widows' peak），属显性遗传。调查班级中有些同学前额发际呈峰形，记为“V”，平线者为“一”。

额前平线者 额前V形发尖

4 头发的直卷性状遗传

东方人多为直发，为隐性性状，卷发则为显性性状。在人群中大多数人的头发是顺直的，基因型是TT；有些人在自然状态头发是卷曲的，卷发其横

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截面是椭圆形，基因型是tt；有些人的头发则成波浪式，波发的基因型为Tt。

头发的形状

a、硬直发 b、平直发 c、浅波发 d、宽波发 e、窄波发 f、卷波发

5 眼睑遗传

人群中的眼睑（eyelid）可分为单重睑（俗称单眼皮，又叫上睑赘皮）和双重睑（俗称双眼皮）两种性状。一些人认为双眼皮受显性基因控制，为显性性状；单眼皮为隐性性状。关于这类性状的性质和遗传方式，目前尚有争论，还有待进一步研究；可以调查一下自己家族中有关成员的眼睑情况，并绘制成系谱图，分析其遗传方式。

单重睑 双重睑

6 拇指关节远端超伸展遗传

在从群中有的人拇指的最后一节能弯向挠侧与拇指垂直轴线呈60度角，性状呈隐性遗传即该性状的纯合性个体的拇指端可向后卷曲60°。调查班级中哪些同学有此性状，统计该性状出现的频率。

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远端不能超伸展 远端超伸展

7 左利与右利遗传

系指人们用手的习惯，左利（隐性性状）与右利（显性性状）俗称左撇子和右撇子。有资料表明双亲惯用右手，孩子惯用左手频率为6%；双亲之一惯用左手，孩子惯用左手频率为17%；双亲惯用左手，孩子惯用左手频率为50%；杂合体惯用右手或左手取决于环境变异。 8 手指嵌合时左拇指在上与右拇指在上

自然将两只手的手指交叉握在一起，有的人左手的拇指在上，有的人右手的拇指在上。调查显示左手拇指在上为显性。右手拇指在上为隐性。 9 食指与无名指的长度比例

这一性状与性别有关，具有从性遗传的特点，杂合子只在一种性别中表达。有的人食指相对长，而有的人无名指相对长。具有 DD基因型的个体在男性和女性中均表现为食指较长；具有dd 基因型的个体在男性和女性中均表现为无名指较长；而具有Dd基因型的个体在男性和女性中表现不同，男性中表现为无名指较长,女性中表现为食指较长。

五 [作业与思考]

1 针对其中的一种遗传性状，绘出相应的系谱图，并进行系谱特征分析？

2 请将你的上述实验的结果填入下表。

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实验内容 耳垂遗传 卷舌和翻舌遗传 前额发突遗传 头发的直卷性状遗传 眼睑遗传 拇指关节远端超伸展遗传 左利与右利遗传 手指嵌合时左拇指在上或右拇指在上 无名指和食指长度比 性状 显性/隐性/基因型 - 33 -

实验十 苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算

一 实验原理

群体（popualtion）是指同物生活于某一地区并能相互杂交的体群群体中的遗传基因和基因型需要保持平衡，才能保证人种的世代繁殖。而一个群体所具有的全部遗传信息，亦即含有在特定位点的全部等位基因称为基因库（gene pool）。个体的基因型只代表基因库的一小部分。在研究群体变化、群体中遗传病的变化时，需要了解遗传的发病率及其遗传性状，就要了解某一基因的存在，分析并计算基因频率。

基因频率（gene frequency）是指群体中某一基因的量。基因频率也就是等位基因的频率。群体中某一特定基因的频率可以从基因型频率（genotype frequency）来推算。基因型频率指某一基因型占所有基因型的比例。 二 实验目的

1.1 掌握基因频率和基因型频率的计算方法 1.2 掌握遗传平衡群体的判定方法 1.3 掌握尝味能力的测定方法 三 实验试剂

苯硫脲（phenylthiocarbamide, PTC）1～14溶液；血清 四 实验步骤 1 PTC尝味测试

PTC是一种白色结晶状药物，由于含有N-C=S基因，所以有苦涩味。有的人能尝出1/750,000～1/50,000 PTC浓度溶液的味道(苦味、苦涩、少数人感到甜味)，这些人称为尝味者；有的人只能尝出PTC浓度大于1/24,000溶液的

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味道，这些人均称为PTC味盲者。尝味者为AD，味盲者为 AR。我国汉族人群中，PTC味盲约占9％。已知味盲者易患结节性甲状腺肿，因此可以把PTC的尝味能力作为一种辅助性诊断指标。

PTC尝味者决定于显性基因T的存在，味盲决定于纯合的隐性基因tt的存在，这对基因位于人类第七号染色体上。显性纯合TT者在溶液浓度在1/750000时即可尝出苦味，隐性纯合tt必须在溶液大于1/24000时才能尝出其苦味，有人甚至连药物粉末亦尝不出来。杂合子Tt的尝味能力介于显性纯合与隐性纯合之间，也是尝味者，但不敏感，因为T对t是不完全显性的。人类对PTC的尝味能力属不完全显性或半显性遗传。不同民族和个体的尝味能力不同，汉族味盲率约占10%，而广西壮族仅约为4%。

方法：检测全班同学的PTC味觉感受结果。用滴管向受测者舌根部滴5~6滴溶液，然后记录受测者第一次尝到苦味时的溶液等级号。对尝味结果报告不确切或模棱两可者，重复进行测试，直至认为可靠后才记录其溶液等级号。

尝味域值≥11号为纯合尝味者，基因型为TT

尝味域值10~5号为杂合尝味者，基因型为Tt

尝味域值≤4号为味盲，基因型为tt

注意：测试时一定要从低浓度到高浓度，每换不同号溶液时要用蒸馏水漱口；另外，在测试时带用蒸馏水和PTC溶液交替测试，以避免受测者的臆想和猜测。

有调查表明：纯合味盲（tt）者易患结节性甲状腺肿，原发性青光眼患者味盲率占26%，先天愚型中味盲者亦较多。

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溶液 溶 液 配 置 基因型 称取1.3克的苯硫脲定溶于1升蒸馏水 (20℃ 2天可完全溶解，或加热溶解亦可)。1 该溶液浓度定为1号，然后依次等量对半稀释至 l4号 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

取1号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取2号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取3号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取4号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取5号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取6号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取7号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取8号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取9号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取10号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取11号溶液50ml， 蒸馏水稀释一倍 取12号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 取13号溶液50ml，蒸馏水稀释一倍 tt tt tt tt tt tt Tt Tt Tt Tt TT TT TT TT 五 [作业与思考]

1将全部同学尝味性状的基因型做统计分析，计算显性基因和隐性基因的频率，并判断该群体是否为平衡群体？

2将全部同学血型的分布情况，统计各血型的分布频率，计算显性基因IA、IB

和隐性基因i的基因频率，并判断该群体是否为平衡群体？

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实验十一 遗传咨询

【目的要求】

1、通过对单基因病(或性状)的系谱分析，熟练掌握系谱分析的一般方法。 2、熟练掌握遗传病再发风险的估计方法。 3、熟悉遗传咨询的一般过程。

【实验原理】

遗传咨询是医师或从事医学遗传学的工作人员用遗传学和临床医学的基本原理，确定某病是否为遗传病、遗传方式、再发风险、如何防治等一系列问题，然后回答患者及家属提出的有关疾病的各种遗传学问题，并提出建议和指导。所以，从事遗传咨询的工作人员除具备临床医学的知识外，还必须具备医学遗传学的基本知识，了解遗传病与其它临床疾病的鉴别诊断，掌握系谱分析的原理和方法，熟悉遗传病再发风险估计等等。遗传咨询一般包括下列几个步骤：①询问、查体、实验室检查、收集家族史，绘出系谱图；②依据第一步获得的资料以及实验室的检查结果，判断某病是否为遗传病；③根据系谱分析判断遗传病的传递方式或可能的传递方式；④回答患者及有关人员所提出的各种遗传学问题，例如该遗传病的产生原因、诊断、预防、治疗及再发风险的估计等问题；⑤与患者及家属商谈，并帮助他们做出恰当的选择和确定最佳措施。遗传咨询是减少遗传病患儿出生的有效方法，对降低遗传病的群体发病率，提高人类的遗传素质具有重要意义，因此它是医学遗传学的一项重要研究内容。

【实验内容、方法】

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1、分析下列系谱，判断各系谱中单基因遗传病的遗传方式，并写出患者及其他各成员的基因型(图1～图5)。

2、某女曾生育过一先天愚型患儿，现再次妊娠，惧怕再生同病患儿前来咨询。应该怎样计算再发风险？

3、某种遗传病男女发病机会均等，而且发病的患者可出现在父母均正常的家庭中。现有一对表现都正常的姨表兄妹，准备结婚，虽然双方父母正常，但他们的舅表兄患有此病，所以前来咨询。

请问此病的遗传方式如何？

这对姨表兄妹都是携带者的可能性有多大? (3)他们婚后出生此病患儿的概率是多大?

(4)如果他们均为携带者，那么他们婚后生出此病患者的可能性有多大? 4、某男性，38岁，两次结婚，第—妻妊娠8次均于妊娠2个月左右流产，故离婚，与第二妻婚后，女方受孕3次亦均在3个月内流产。请分析流产的原因以及能否再次妊娠。

5、一对夫妇生有苯丙酮尿症(PKU)的患儿，他们听说是遗传病后，前来咨询，问题是：

(1)他们二人及家庭各成员中全无这种病的患者，这怎么能算遗传病呢? (2)是谁的问题?能不能治疗?他们再生一个孩子患PKU的可能性是多大?如何预防患儿的出生?

6、一对新婚夫妇，由于女方的弟弟患有白化病，害怕今后会生育白化病患儿前来咨询。

7、有一对外表正常的夫妇，怀孕4胎中，有两次流产，存活的长女表型正常，但其染色体数目为45条，存活的男孩是一个具有46条染色体的先天愚型患者。

(1)请解释男孩的发病原因。

(2)长女将来会发病吗？婚后会生出先天愚型患儿吗?如果能，是否能防

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止患儿的出生?

8、一对夫妇婚后，怀孕5次，其中4胎流产，1胎多发畸形。经细胞遗传学检查丈夫为倒位携带者，他们还能否生出正常的孩子?如果能，表型正常的孩子的核型如何?

9、一位青年准备与他的姑表妹结婚，他们认为在他们的家系中从来没有过遗传病的患者，他们结婚对后代不会有影响。请你从我国人群的遗传负荷是每人平均携带5个有害基因的角度说明他俩不宜结婚的原因。

10、如果苯丙酮尿症的群体发病率为0.0001，表兄妹婚后后代患苯丙酮尿症的概率有多大?是随机婚配的多少倍?

11、黑尿病(AR)的群体发病率为百万分之一，请问下列情况产生有病后代的概率是多大?

(1)两个正常的无亲缘关系的人结婚。

(2)一个患黑尿病的人与一个正常的无亲缘关系的人结婚。

(3)一个正常的人，其弟弟患黑尿病，他（她）与一正常的无亲缘关系的人结婚。

12、一位女性表型正常，父母和两个哥哥表型也正常，但因她的两个舅舅患有假肥大型肌营养不良症(XR)前来咨询。

(1)她是携带者的可能性有多大?

(2)如她与正常男性结婚，婚后生男孩的复发风险是多大?生女孩的复发风险是多大?

(3)如果她婚后生了一个患者，如再生育，则生一个正常孩子的可能性是多少?

13、Huntington舞蹈症为常染色体显性遗传病，25岁以前发病的占10％，40岁以后发病的占60％。一位25岁的男性，表型正常，其外祖父患有该病，他的母亲现已45岁，表型也正常，请问他是携带者的可能性是多少?他将来的子女获得致病基因的风险是多少?

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实验十二 人类基因组DNA的提取

【实验目的】

1、了解DNA提取的原理；

2、学会实验室常用的提取DNA的方法。

【实验原理】

从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行分子遗传学各项研究的先决条件。制备高质量DNA的原则是：尽可能保持DNA分子的完整；将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。哺乳动物DNA的提取通常是在有EDTA-Na2及SDS一类的去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚、氯仿抽提实现的。在Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）作用下，DNA被释放到上清液中，经过氯仿去蛋白、去酚（因为可有10%的酚溶于水）作用后，乙醇可使DNA分子聚合形成白色或无色絮状沉淀，从而获得粗提DNA。用这一方法获得的基因组DNA大小约有100～150 kb，适用于Southern分析、用λ噬菌体构建基因组DNA文库和PCR反应等。

【试剂与材料】

枸橼酸钠溶液（ACD）、生理盐水、细胞裂解液、蛋白酶K（10 mg/ml）、10% SDS，STE缓冲液（pH 8.0）、Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）、氯仿（CHCl3）、乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液（pH 7.5）。

【实验内容、方法】 一、外周静脉血DNA的提取

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1、采集外周静脉血3～4 ml于7 ml管内，加0.5 ml ACD抗凝。 2、加等体积生理盐水，轻轻振荡混匀；1 500 g离心20 min。

3、弃上清液；每管加5 ml细胞裂解液，轻轻上下振荡至透明；1 500 g离心20 min。

4、弃上清液；每管加入STE（pH 8.0）2 ml，蛋白酶K（10 mg/ml）20 ml，10% SDS 200 ml，置37℃恒温水浴箱内，消化过夜。

5、加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀；5 000 g离心20 min。 6、吸取上清液，重新抽提1～2次。 7、加等体积CHCl3抽提2次。

8、吸取上清液至一小锥形瓶中，加入3 mol/L乙酸钠至终浓度为0.3 mol/L。

9、加入2.5倍体积的无水乙醇，可见有白色絮状沉淀物，即为所提取的DNA。轻轻旋转锥形瓶，慢慢将DNA聚到一起。

10、吸出DNA沉淀，放入加有1 ml 75%乙醇的Eppendorf管内；12 000 g离心10 min。

11、弃上清液，室温干燥。

12、加适量（200～500 ml）TE缓冲液，置4℃保存，约2～4天DNA才能完全溶解。

13、用DNA/RNA Calcultor检测DNA的含量和纯度。 二、绒毛细胞DNA的提取

1、绒毛滋养层细胞及羊水细胞的获得：将绒毛细胞放入Hank’s液中，立即在显微镜下分离绒毛枝状物，用生理盐水洗去血污，然后冻存于液氮中或立即提取DNA。

2、绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆，加STE至500 ml，加SDS至终浓度为0.5%，加蛋白酶K至100 mg/ml。37℃水浴过夜，期间振荡2～3次。

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3、加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀，8 000 g离心10 min。 4、吸取上清液，加等体积CHCl3，轻轻振荡混匀，5 000 g离心20 min。 5、重复步骤4一次。

6、以下步骤同“外周静脉血DNA的提取”。 三、羊水细胞DNA的提取

1、取羊水20 ml，于4℃、3 000 g离心15～20 min，除去上清液，用生理盐水洗涤沉淀的羊水细胞2～3次，冻存于液氮中或立即提取DNA。

2、绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆；向羊水细胞中加STE至500 ml，加SDS至终浓度为0.5%，加蛋白酶K至100 mg/ml。37℃水浴过夜，期间振荡2～3次。

3、加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀，8 000 g离心10 min。 4、吸取上清液，加等体积CHCl3，轻轻振荡混匀，5 000 g离心20 min。 5、重复步骤4一次。

6、以下步骤同“外周静脉血DNA的提取”。

【应用】

遗传病的诊断、遗传病的家系系谱分析、人类基因组资源的保存、以及一些具体研究领域的前期工作。

【注意事项】

1、外周静脉血一般用医用ACD抗凝，也可用EDTA抗凝。因肝素能抑制限制性内切酶活性，故一般不采用肝素抗凝。

2、因Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）、氯仿（CHCl3）有较强的毒性作用，在操作过程中应注意防护，防止液体溅到皮肤上，有条件的可以戴乳胶手套以及口罩，保持良好通风。

3、在酚以及氯仿的混合过程中，注意轻轻混匀，切忌剧烈震荡，防止

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DNA因机械剪切而发生断裂。

4、无水乙醇沉淀DNA的过程中，注意使用室温的无水乙醇，不需要预冷，否则RNA容易析出。

5、不要使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解。可以将其置于摇床平台上慢慢摇动至DNA完全溶解。

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实验十三 聚合酶链式反应（PCR）

【实验目的】

1、了解PCR技术的原理；

2、掌握PCR技术的程序和步骤。 实验原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在体外模拟DNA的复制过程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发聚合反应，短时间内可将要研究的目的DNA扩增数百万倍。

PCR技术操作简单，灵敏度高，对模板DNA的质量和数量要求较低，常规方法提取的DNA和RNA都能满足PCR扩增需要，可在普通实验室完成，结果较为可靠。

试剂与材料

1、样本DNA、上下游PCR引物、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/ml）。

2、微量加样器、PCR自动热循环仪。

【实验步骤】

一、样品的收集及处理

用于PCR反应的样品可以是已提取的各种来源的DNA分子，也可以选取经处理后的全血、羊水、绒毛。

（一）全血

1、取全血200 ml用EDTA抗凝。 2、5 000 g离心10 min。

3、弃掉上清液，沉淀重悬于200 ml无菌三蒸水中，煮沸5 min裂解细胞和细胞核。

4、5 000 g离心10 min。

5、取上清液30 ml，直接进行PCR扩增。 （二）绒毛

1、取绒毛样本，8 000～10 000 g离心2 min，使样本沉降到管底。 2、用STE缓冲液洗两次。

3、重悬于50 ml裂解液中振荡裂解。 4、煮沸2～3 min，5 000 g离心10 min。 5、取上清液2.5 ml，进行PCR扩增。

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（三）羊水

1、取1.5 ml羊水，8 000～10 000 g离心5 min。 2、弃上清液，沉淀用TE缓冲液洗一次。 3、在细胞沉淀中加50 ml裂解液振荡裂解。

4、煮沸2 min，再次震荡；5 000 g离心10 min。 5、取上清2.5 ml，进行PCR扩增。 二、PCR扩增

1、25 ml标准PCR反应体系各成分终浓度如下： 模板DNA50～100 ng

Taq DNA聚合酶0.5～1 U 4×dNTPs20～200 mmol/L Mg2+0.5～2.5 mmol/L 引物各0.1～0.5 mmol/L

2、标准PCR反应循环参数： 95℃ 5 min预变性； 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s（可根据扩增片段长度决定，一般为1 kb/ min），共30个循环；

72℃ 7 min。

【结果判断】

多采用琼脂糖凝胶电泳法，根据PCR产物的片段长度，选用1.5%～2%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间一般为30～60 min，检测PCR扩增产物。

【应用】

PCR反应在分子克隆和DNA分析中具有多种用途，例如，某些特异性探针的制备，突变的分析，生成大量DNA进行序列测定，遗传病的诊断分析等。

【注意事项】

1、Taq DNA聚合酶在使用时，要注意在冰上操作，并且可以将大包装分装成独立的小包装，减少污染机会。

2、PCR反应极其灵敏，痕量的DNA污染也可能会造成非特异性扩增，所以避免外部DNA污染是很重要的。

3、PCR反应中，DNA扩增片段的增加随着循环次数的增加会出现停滞效应，即平台期，30个左右的循环即可达到平台期，超过平台期的循环次数会引起非特异性扩增。

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实验十四 DNA的琼脂糖凝胶电泳

【实验目的】

1、了解琼脂糖凝胶电泳检测DNA的一般原理； 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测技术。

【实验原理】

DNA分子携带负电荷，在一定电解质缓冲液存在的条件下，它可以以不同孔径琼脂糖为支持物由电源负极向正极移动。琼脂糖电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常规方法。琼脂糖凝胶可以灌制成各种形状、大小和孔隙度。参数的选择主要取决于所分离片段的大小。

琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200 bp至近50 kb的DNA。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。少至1～10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。

【试剂与材料】 1、琼脂糖、5×TBE或TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙锭（储存液10 mg/ml）。

2、稳压电泳仪、水平凝胶电泳槽、紫外线检测摄像装置。

【实验步骤】

1、根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入一定体积的0.5×TBE或1×TBE或其它电泳缓冲液，如TAE。

2、加热溶解琼脂糖。 3、溶液冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5 mg/ml。 4、把制胶模具摆放好，插上梳子。

5、将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度一般约为0.5 cm。

6、室温下放置30～45 min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中。加样孔位置在负极。

7、加入电泳缓冲液（与琼脂糖凝胶的离子强度一致）至电泳槽中，让液面高于胶面1 mm。

8、在DNA样品中加入1/6的上样缓冲液，混匀后，用移液器将DNA样品加入样品孔中。同时将DNA Marker准加在两侧的空样品孔中。

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