核酸的分离与纯化_百替生物

第六章 核酸的分离与纯化

第一节 核酸分离与纯化的设计与原则

细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3.0×109个碱基对（base pair, bp）组成，与5 243bp

相对来讲，RNA的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其长度约为后者的5.7×105倍。

分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类、大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。

一、材料与方法的选择

（一）材料与方法的选择

临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。

（二）选择的原则

核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排

除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。

（三）核酸完整性的保持

为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。

其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏； DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶（RNase或RNAase）的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。

二、技术路线的设计

（一）核酸的释放

正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。

（二）核酸的分离与纯化

细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的、符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特

性。应该去除的污染物主要包括三个部分：即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质、多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。

（三）核酸质量与提取步骤的关系

一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。

（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤

随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。

三、鉴定、保存与应用

（一）核酸的鉴定

1．浓度鉴定 核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。

（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度

大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。

（2）荧光光度法：荧光光度法以核酸的荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1ng～5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。

2．纯度鉴定 紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。

（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染，需结合其它方法加以鉴定。A260/A280的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，2.0是高质量RNA的标志。但要注意，由于受RNA二级结构不同的影响，其读数可能会有一些波动，一般在1.8～2.1之间都是可以接受的。另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH 7.5）中的读数低0.2～0.3。

（2）荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%～85%，tRNA及核内小分子RNA占15%～20%，mRNA占1%～5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的相对有些扩散的快迁移条带。在真核生物为28S、18S的rRNA及由5S、

5.8S的rRNA和tRNA构成的条带（图6-1）。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，我们可以鉴定DNA制品

中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。

3．完整性鉴定 常规使用凝胶电泳法。

（1）凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在电泳图上可以显著地表现出来。而完整的无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性的三条带外，三条带的荧光强度积分应为一特定的比值。沉降系数大的核酸条带，分子量大，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。一般28S（或23S）RNA的荧光强度约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。如果在加样槽附近有着色条带，则说明有DNA的污染。

（2）其它方法：必要时，还可以通过一些特殊的试验来分析RNA的完整性，如小规模的第一链cDNA合成反应、以放射性标记的寡脱氧胸苷酸oligo(dT)为探针的Northern杂交以及对已知大小的mRNA的Northern杂交。另外，随着毛细管电泳与生物芯片技术的飞速发展，有关核酸的分离、纯化、鉴定与回收的手段日益丰富。

（二）核酸的保存

核酸的结构与性质相对稳定，无需每次制备新鲜的核酸样品，且一次性制备的核酸样品往往可以满足多次实验研究的需要，因此有必要探讨核酸的贮存环境与条件。与分离纯化一样，DNA与RNA的保存条件也因性质不同而相异。

1．DNA的保存 对于DNA来讲，溶于TE缓冲液在-70℃可以储存数年。其中TE的pH值为8，可以减少DNA 的脱氨反应而pH低于7.0时DNA容易变性；EDTA作为二价金属离子的螯合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子以抑制DNA酶的活性；低温条件则有利于减少DNA分子的各种反应；双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，常规4℃亦可保存较长时间；在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。

2．RNA的保存 RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，-70℃至-80℃保存。若以焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白（RNasin）或氧钒核糖核苷复合物（vanadyl-ribonucleoside complex，VRC），则可通过抑制RNA酶对RNA的降解而延长保存时间。另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可于-20℃长期保存。其中，甲酰胺溶液能避免

RNase对RNA的降解，而且RNA极易溶于甲酰胺溶液，其浓度可高达4mg/ml。需要注意的是，这些所谓RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入，只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实验研究与应用有影响，则必须予以去除。

由于反复冻融产生的机械剪切力对DNA与RNA核酸样品均有破坏作用，在实际操作中，核酸的小量分装是十分必要的。

（三）核酸的应用

分离纯化的核酸样品，既可用于核酸本身功能与性质的研究，亦可利用其功能与性质进行广泛的应用，如基因工程与蛋白质工程均以核酸分子作为原始材料。可以说，目前包括聚合酶链反应，核酸的分子杂交与DNA重组与表达技术在内的绝大多数分子生物学技术，都是以核酸分子为处理对象，利用核酸分子的碱基配对原理与核酸的一种或多种酶修饰性进行的。绝大多数分子生物学技术，实质上是对DNA和RNA的分析。没有核酸的分离与纯化，分子生物学技术就没有研究与应用的基础。

第二节 基因组DNA的分离与纯化

一、分离与纯化的方法

双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子，可用于重现犯罪现场和进行古生物学分析。但由于是很长的线性分子（如人的染色体DNA平均长度为100～150Mb）而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。在溶液中，由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很难溶解，而且也增加了它对剪切力的敏感性。即便是最轻柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力发生横向的断裂。常规方法分离基因组DNA时，大于150kb的DNA分子很容易发生断裂。

（一）酚抽提法

本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改进，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。

其中，EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性；SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，其非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变

性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用；无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。

多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。

运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100kb～150kb的很少，但这种大小的DNA足以作为PCR反应的模板和进行Southern blotting分析以及构建以λ噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5×107个培养的非整倍体哺乳动物细胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在100kb～150kb的DNA 200mg，自20ml血液可得250mg。

（二）甲酰胺解聚法

为构建高容量载体的DNA文库和进行分子量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制备分子量大于200kb的DNA。该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。

（三）玻棒缠绕法

缠绕法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。与前两个方案不同，它有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面；二是要将沉淀的DNA缠绕于带钩玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段与RNA不能有效形成凝胶状线卷。该方案以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只有大约80kb，不能有效构建基因组DNA文库，但用于Southern

杂交和PCR反应可以获得很好的结果。

（四）DNA样品的进一步纯化

纯化的方法包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。其中电泳法简单、快速、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收，在DNA的进一步纯化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）与琼脂糖凝胶（agarose gel）可以制成各种形状、大小和孔径不一的支持体，并可以在多种装置中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与琼脂糖凝胶电泳（AGE）广泛用于核酸的分离、纯化与鉴定。

二、DNA片段的回收

通过凝胶电泳，我们可以对各种大小与来源的DNA片段进行分离、纯化与鉴定。目前，琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶是最常使用的电泳支持体，电泳分离的DNA处于凝胶的三维网状结构中。下面介绍从琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的主要方法。

（一）总的原则与要求

无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA样品中的污染。

回收的DNA样品往往因支持介质的不纯、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，这些污染可能严重影响后继的实验。根据实验要求，应对回收的DNA样品进行纯化，以除去污染物。常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。其中柱层析法采用阴离子交换层析的原理，主要是利用带负电荷的DNA在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换树脂结合，洗去杂质，然后再用高离子强度的缓冲液洗脱下来。上述两种纯化方法以及其它回收DNA片段的方法，最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐。

（二）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要包括二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。

1．DEAE纤维素膜插片电泳法 DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，

继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜，低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出DNA分子。该法操作比较简单，可同时回收多个DNA片段，对500bp～5kb的DNA片段回收率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。但DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时，其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收单链DNA。

2．电泳洗脱法 电泳洗脱法包括两个主要步骤，一是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小容积溶液中；二是分离纯化出DNA片段。按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。其中，透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳，使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收DNA分子。该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段，但可有效回收从200bp至大于50kb的DNA，尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率。

3．低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 该法是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝胶块，利用其纯度高、熔点低（65℃）及凝固温度低（30℃）的特点，在室温大于30℃，琼脂糖仍为液态的情况下，对DNA片段进行回收的方法。根据不同的提取纯化方案，又可分为有机试剂提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法和琼脂水解酶（agarase）法。有机试剂法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb～5kb的DNA片段。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠（NaI）溶液或高氯酸钠溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下来。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法较有机试剂提取法快，但回收率略低。琼脂水解酶法对切下的含DNA的凝胶块进行消化，将琼脂糖水解为二糖，释放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。

目前，有许多能从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法与改良方案，但至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效去除凝胶中酶促反应抑制剂（如多糖类）。每种方法各有其特点，各有其适用范围，应根据不同的要求选择不同的方法并对某些步骤做出相应的调整。

（三）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段

从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该法能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中，再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱，可以缩短双链DNA的回收时间。

三、基因组DNA分离纯化的方法学评价与质量保证

有关基因组DNA分离纯化的方法很多，每一种方法下又可衍生出许多具体的实验方案。对每一个具体的实验方案，大体上我们可以从方法的可行性与可靠性两个方面来加以考察。可行性方面包括方法是否简便、快速、安全及成本如何。可靠性则包括了方法的稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量及最小样品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蚀性，需要采取特别的安全防护措施。

第三节 质粒DNA的提取与纯化

大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCC plasmid）DNA，简称闭环质粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。

一、提取与纯化的方法

质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml～2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml～50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。

（一）碱裂解法

碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。尽管碱液能破坏核酸的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠结紧密而不会解链。只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复其天然状态。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清中。直接通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤，其纯度可满足DNA测序与PCR等实验的要求。

碱裂解法是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。

（二）煮沸裂解法

煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。

煮沸裂解法是一种条件比较剧烈的方法，对于大质粒（>15kb）有明显的剪切作用，故只能用于小质粒DNA（<15kb）的制备。该法能用于小质粒DNA的小量与大量制备，并且适用于大多数的E.coli菌株。由于糖类很难去除，而且糖抑制限制性酶和聚合酶的活性，故该法不适用于在去污剂、溶菌酶和加热情况下可释放大量糖类的E.coli菌株，如HB101及其衍生菌株（TG1）。另外，煮沸不能完全灭活核酸内切酶A（endonuclease A，endA）的活性，故表达endA的菌株亦不适用于本法。在细菌培养过程中，加入氯霉素可抑制细菌的蛋白合成和细菌分裂，有利于质粒DNA的选择性扩增。

（三）SDS裂解法

大于15kb的质粒DNA容易因细胞裂解和后继操作而遭到破坏，因此需要温和的裂解方法。SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯

仿抽提。

由于条件温和，SDS裂解法有利于大质粒DNA的提取。但该法在处理过程中，有一部分质粒DNA因缠结在细胞碎片上而丢失，故产率不高。

（四）其它方法

其它方法如小量一步提取法、牙签少量制备法及Triton-溶菌酶法等，各有特点与适用范围。小量一步提取法，直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后从上清中回收质粒DNA。该法简单快速、经济可行，可用于内切酶图谱分析。

（五）质粒DNA的纯化

目前，关于纯化的方法与方案非常多，都利用了质粒相对较小和共价闭环的结构特点。其中，纯化效果好而且适用范围广的方法主要有氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（简称CsCl-EB法）、聚乙二醇沉淀法和柱层析法。

1．CsCl-EB法 CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以

，浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），分开。其中蛋白质密度小（1.3 g/cm3～1.4g/cm3）

沉于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部。过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。其中，闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入，结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3；而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多，约为1.54 g/cm3，从而能与闭环质粒DNA分开。回收的闭环质粒DNA含有嵌入的EB，可采用有机溶剂抽提法或离子交换层析加以去除。经典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、纯化效果好，至今仍是质粒DNA纯化的标准方法。但该法很费时并需要昂贵的设备与试剂。

2．聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法是一种分级沉淀法。质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；然后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。该法简单、经济、适用广，尤其对碱裂解法提取的质粒纯化效果好，

适用于分子克隆中所有常规的酶学反应，也能用于高效的哺乳动物细胞的转染。但PEG法不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA。

3．柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。大体上，树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化。以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合来进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架的脱水，通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通过离心洗脱出来。DNA与硅基质的吸附作用与DNA的碱基组成和拓扑结构无关，因此可用于环型质粒DNA和线性DNA的纯化。小于100bp～200bp的DNA分子由于与硅基质的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的纯化。但在纯化大分子DNA时，可有效去除小分子DNA的污染。

第四节 RNA的分离与纯化

包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。

RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。

一、RNA制备的条件与环境

为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。

从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的

二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。

二、总RNA的分离与纯化

由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。尽管对剪切力不敏感，但RNA具有碱易变性，需要严格控制pH值。另外，在DNA与RNA的提取过程中，酚与氯仿经常结合、交替使用，主要在于两者合用时去除蛋白的效果更好，而且氯仿还能有效抑制RNase的活性，通过使酚脱水防止mRNA的丢失，加速有机相与水相的分层，去除植物色素和蔗糖以及核酸样品中的痕量酚。少量异戊醇的加入，其目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。由于高浓度胍类的使用，为防止SDS的沉淀，常改用十二烷基肌氨酸钠。对含量较低的样品，加入糖原可以提高RNA的回收率。

总RNA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是，目前常用的一步法均以异丙醇沉淀RNA，由于其选择性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的总RNA中含有的小分子量RNA较少，rRNA和mRNA所占的比例相应增高。当然，目前的研究重点不是小分子量RNA，而是分子量较高的mRNA，不必苛求真正的总RNA。

（一）(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法

(异)硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法，由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在

pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。该法与以前的(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法相比，具有简便、经济和高效的特点，能同时迅速地处理多个标本，且RNA的完整性与纯度均很高。目前仍用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。总RNA的产量取决于标本的起始量，每毫克组织总RNA的产量大约为4～7mg，每106个细胞大约为5～10mg。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA，而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染，这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解，同时抑制RT-PCR反应，并通过结合到膜上而影响RNA杂交

中的印迹步骤。脂肪组织RNA的提取可换用(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法。当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时，可下一个方法，通过增加一个有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。

（二）可同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步法

该法是(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改进方法。它是以(异)硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞，然后加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。其中RNA沉淀溶液的成分为1.2mmol/L的NaCl与0.8mmol/L的柠檬酸二钠。由于RNA沉淀溶液的使用，该法制备的RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染，可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分别分级沉淀出来。该法制备的DNA，大小约为20kb，可作PCR反应的模板，蛋白质样品则主要用于免疫印迹。目前，该法已有多种商品化的单相裂解试剂供选择，是最常用的总RNA提取法，其产率与(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相当。

（三）其它方法

RNA的分离纯化方法与方案还有许多，如(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、LiCl-尿素法、热酚法等，因各种原因目前已较少使用。

三、mRNA的分离与纯化

与大小和序列明确的rRNA、tRNA及核内小分子RNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、分子量大小不一。除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3'末端带有一个长短不一的多聚腺苷酸（polyadenylic acid）的结构，即poly(A)尾巴。以总RNA制品为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体。理论上，它们可编码细胞内所有的蛋白质与多肽分子。

（一）oligo(dT)-纤维素柱层析法

oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标准方法。它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中poly(A)+RNA在高盐条件下，通过碱基互补，

与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂交体，洗去未结合的其它RNA，然后在低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)+RNA。从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA 时，oligo(dT)-纤维素柱层析法是首选方法，回收的poly(A)+RNA量可达总RNA的1%～10%。但该法分离速度慢，易阻塞，不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的poly(A)+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。

（二）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法

为适应同时对多个标本进行处理的要求，应选用批量的层析法。oligo(dT)-纤维素液相结合离心法不经填柱，而是直接将oligo(dT)-纤维素加入到一系列的含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有poly(A)+RNA的oligo(dT)-纤维素，经漂洗后，用含70%的乙醇洗脱液将吸附的poly(A)+RNA从oligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出poly(A)+RNA。用本法分离poly(A)+RNA时，应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素，如oligo(dT)18-30纤维素，而一般的柱层析填充的是oligo(dT)12-18纤维素。

（三）其它方法

磁珠分离法则联合利用了oligo(dT)与poly(A)的互补配对特性、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的特异性结合以及磁性分离原理，对poly(A)+RNA进行高效、灵敏、快速的分离（图6-4）。其产量甚至比常规的oligo(dT)-纤维素柱层析法还高，且分离的poly(A)+RNA能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1克，而且磁珠很贵并需要专门的磁性分离架。

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