6、多肽蛋白

第6章 多肽蛋白类药物的纳米载药系统

6.1 前言

1982年，美国Lilly公司首先将重组人胰岛素投放市场，标志着世界上第一个基因工程药物的诞生。基因工程药物是指通过DNA克隆和转化技术获得的工程菌株（主要是大肠杆菌工程菌株和酵母工程菌株）或细胞株生产的医用蛋白或多肽。从上世纪90年代起基因工程等生物技术快速发展，各种多肽蛋白类药物如：干扰素、白细胞介素、生长因子、生长激素、基因治疗药物、抑制素、调节因子、疫苗和酶类等逐渐被生产出来或上市销售。据统计，2003年在美国基因工程药物的产值已超过200亿美元，其中仅红细胞生成素（EPO）一种产品，年销售值就达24亿美元。此外有370多种生物药物和疫苗进入临床研究阶段，其中20%可能在今后5-10年上市。还有约3000种生物药物处于临床阶段。这些药物中多数是基因工程蛋白多肽类药物。

随着基因重组、蛋白质分离提纯等生物技术的快速发展，蛋白多肽类药物已成为当今药物发展的三大分支之一（另外两大类药物分别是合成药物与天然药物）。但是多肽蛋白类药物通常具有较强的亲水性，很难直接跨过亲脂性的生物膜，药物的生物利用度较低；其次这类药物在体内易被胃肠道内的酸性物质及蛋白酶水解酶等破坏，且生物半衰期短、因此需要频繁注射给药，给病人带来了许多痛苦与不便。

通过选用适当的聚合物、脂质体、分子凝胶或微乳等载体材料，可以制备获得各种多肽蛋白类药物的纳米载药系统。根据中华人民共和国药典二部（2000年版），通常把粒径介于10-1000nm的粒子称为纳米粒。它又可以分为纳米球及纳米囊两大类。纳米球有一定的基质结构，多肽类药物或吸附在其表面上，或被溶解在基质中。纳米囊由聚合物外壳及惰性的内核组成，多肽类药物通常溶解于内核，但也可同时吸附在聚合物的表面上。由于纳米球及纳米囊的保护作用，在一定程度上避免了多肽蛋白类药物直接受到物理的、化学的或酶的降解作用的破坏，提高了药物的稳定性，同时由于聚合物的包封作用，使药物可以缓慢释放。此外，由于纳米药物粒径小，分散性高、亲脂性好，具有很强的黏膜吸附性，因此可以延长给药时间，提高药物的生物利用度，改变药物的药代动力学特性，达到缓释给药、靶向给药及非注射给药的各种目的。

与传统剂型相比，多肽蛋白类药物的纳米载药系统具有以下优点：(1)给药剂量和频率大大下降，患者的顺应性好；(2)缓释时间长，半衰期较短的药物作用时间可延长，体内血药浓度稳定；(3)毒副作用小；(4)具有靶向性；(5)药物稳定性较好。随着新技术、新工艺、

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新材料的发展，多肽蛋白类药物的纳米载药系统已成为新型药物制剂的重要研究领域之一。

本章首先介绍多肽蛋白类药物的结构、性质、应用分类及分析方法，接下来对纳米载药系统的制备过程中，载体材料的选择、制备工艺、制剂处方等各种因素对多肽蛋白类药物的稳定性、粒径大小、释药特性等性质的影响进行讨论，同时对多肽蛋白类药物纳米载药系统的体外释药特点及体内的吸收代谢情况进行分析，最后对一些重要的多肽蛋白类药物的纳米给药系统的研究进展进行综述。 6.2 多肽蛋白类药物的应用分类、结构特点

目前有治疗作用的多肽蛋白质可以分为五大类即抗原 、酶、激素、细胞分裂素（cytokine）及其他蛋白质等（见表6.1）[1]。

多肽蛋白类药物就其化学结构来说，是由20种L-型α氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键连接而成的长链分子，多肽类药物分子的相对分子质量较小，而蛋白质类药物的分子相对分子质量较大。一条多肽链内或几条多肽链间通常会形成若干二硫键。通常把蛋白质分子的氨基酸排列顺序（蛋白质一级结构）、二硫键连接方式及辅基的结合统称为蛋白质分子的化学结构。

肽链中局部肽段的氨基酸残基通过氢键等相互作用形成一些有规则的重复构象就是蛋白质的二级结构，如α- 螺旋、β- 折叠、β- 转角、Ω-环行及无规卷曲等都是常见的蛋白质的二级结构单元，可以说蛋白质二级结构是肽链中局部肽段的构象。在蛋白质中，特别是球状蛋白中，若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上可分辨的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称之为超二级结构，或简称为Mortif。各种二级结构、结构模体及相关联的各种环肽链在空间中进一步协同盘曲、折叠，即可形成蛋白质的三级结构，它通常包含一个或几个结构域，所谓结构域是指蛋白质分子中明显分开的球状部分。寡聚蛋白质中几个亚基间的相互作用及其空间排列构成了蛋白质的四级结构。亚基一般是一条多肽链，但有的亚基由两条或多条肽链组成，这些多肽链相互间以二硫键相连，这些亚基也被称为单体。

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表6-1 多肽蛋白类药物的应用分类[1]

蛋白质分类 蛋白质 治疗作用 抗原 白喉类毒素 疫苗 E.Coli 肠毒素B 亚基 疫苗

乙肝病毒 疫苗 葡萄球菌肠毒素

B 类毒素 疫苗 破伤风类毒素 疫苗

酶 天门冬酰胺酶 抗肿瘤剂 胰凝乳蛋白酶 蛋白水解酶 胰蛋白酶 蛋白水解酶

蛋白质 C 抗凝血剂 溶菌酶 抗病毒剂

激素 降钙素 血钙调节剂

生长激素 生长激素 甲状旁腺激素 血钙调节剂 胰岛素 降低血糖 促黄体生成激素 调节睾丸酮 释放激素(LHRH) 的合成与分泌

细胞分裂因子 红细胞生成素 红细胞增殖及分化调节剂

类胰岛素生长因子-1 骨生长促进剂 白细胞介素 抗肿瘤剂 干扰素 抗肿瘤剂 肿瘤坏死因子 抗肿瘤剂 血管内皮生长因子 细胞分裂因子

其它 神经生长因子 神经营养因子

环胞腺素A 免疫抑制剂

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抗菌肽 抑菌剂

蛋白质的二级结构、三级结构及四级结构等构成了蛋白质的空间结构，它是多肽蛋白质发生各种生理作用的基础。稳定蛋白质空间结构的力有氢键、疏水相互作用、盐键和二硫键等。蛋白质在水溶液中的空间构象特别是蛋白质的二级结构通常受到蛋白质所处环境的影响，如蛋白质浓度、溶液的pH值、表面活性剂的种类及浓度，有机溶剂的加入等都会使蛋白质的构象发生变化，从而影响蛋白质的稳定性。例如降钙素在酸性溶液中没有α- 螺旋存在，而且性质稳定，但在碱性溶液中，降钙素α- 螺旋比例增加，同时稳定性下降

[2]

。

在理想的情况下，人们期望作为药物的多肽蛋白质在生产、制剂、储存及体内释放的

一系列过程中，都能保持其结构的完整性和稳定性。但是由于一系列因素的影响，蛋白质会发生降解作用，从而部分或全部丧失生理活性。主要包括下列三种降解作用：

（1）化学降解作用对蛋白质一级结构的破坏。蛋白质的脱氨基、异构化、水解、消旋化、氧化、二硫键的形成和β-消除等是常见的蛋白质的化学降解反应。

（2）物理降解作用对蛋白质空间结构的破环。主要指由于化学降解作用、聚集或沉淀等引起的蛋白质二级结构、三级结构的变化，从而导致蛋白质可逆或不可逆的变性。

（3）蛋白水解酶对蛋白质的降解。多肽蛋白类药物在制剂、贮存及口服等过程中，微生物蛋白水解酶、动物及人体内水解酶对蛋白质的水解，使蛋白质一级结构遭到破坏，蛋白质失去生理活性。 6.3 多肽蛋白类药物的分析方法

已经被降解的多肽蛋白质不仅没有生理活性，而且还有可能具有各种副作用如潜在的毒性和免疫原性等。因此必须通过恰当的分析测试方法，精确确定纳米粒中及体内外释药过程中，蛋白质结构的完整性、生理活性和含量的变化。

HPLC是定性定量分析多肽蛋白质的重要工具。它具有简便快捷、选择性高、分离效

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率高及检测灵敏度高等优点。根据分离机理，蛋白质的HPLC可以分成尺寸排阻色谱（SEC）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）和凝胶渗透色谱（GPC）三大类。由于GPC分离模式局限性较大，在蛋白质分析中应用较少。SEC不仅可用于蛋白质的分离提纯，还可以用来测定蛋白质的相对分子质量，此外SEC还可以监测到蛋白质构象的变化引起的蛋白质分子半径的改变，已成为研究蛋白质折叠的重要手段。RP-HPLC一般使用弱极性ODS固定相和极性比ODS固定相要强的流动相，它在蛋白多肽药物的分析中应用最为广泛。在蛋白质分析过程中，流动相的pH值通常较低、柱温较高、选用乙腈或异丙醇作流动相的有机部分，并以三氟乙酸做添加剂等，这些措施可以提高RP-HPLC的分析、分离效果。作者所在研究室就用RP-HPLC精确测定了胰岛素口腔喷雾剂中胰岛素的含量，并研究了该制剂的稳定性。胰岛素口腔喷雾剂是一种纳米载药体系，体系中的大豆卵磷脂（吸收促进剂）和苯酚（防腐剂）会极大干扰胰岛素的定量，但是通过选用恰当的萃取剂如正戊醇，预先萃取除去绝大部分大豆卵磷脂和苯酚，就可较好地使胰岛素的峰与杂质峰分开，该方法的线性范围为1.05 - 73u/ml胰岛素，相关系数达到0.99936，回收率为98.1-102.5%，结果表明RP-HPLC测定制剂中胰岛素的含量，灵敏度高，准确度及精确度均较好[3 ]。

但在某些情况下，由于蛋白质容易吸附在ODS柱上，这使得HPLC测定结果的相关性有时较差，因此与其它蛋白质分析技术联合运用可以改善RP-HPLC在这方面的缺陷。

目前毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）已成为分析化学中HPLC的互补技术，在蛋白质、多肽的分析中有重要应用。CE是指离子或带电粒子以毛细管为分离室，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。CE具有分离效率高，分析速度快，样品及试剂用量少，清洁无污染等特点，特别是在分析复杂的混合生物样品体系中有非常重要的应用价值。

单纯的HPLC及CE技术有时还不能够完全、详细地阐明多肽蛋白类药物在纳米粒中及体内外释药过程中发生的聚集、降解或变性作用，但它们与各种质谱技术的联用可实现高效分离、高灵敏度及富含信息的检测，能够得到各种蛋白质聚集、降解或与其它分子相互作用结构信息。其中HPLC及CE与电喷雾质谱（ESI-MS）的联用技术研究得较多。

电喷雾电离源(ESI)是近年来出现的一种新的电离方式。其工作原理如图6-1所示。ESI既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置，同时又是电离装置。电喷雾电离源是一种软电

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离方式，即便是相对分子质量大、稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个相对分子质量为10000的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量相对分子质量在300000以上的蛋白质。因此可以用电喷雾质谱（ESI-MS）研究蛋白质聚集、降解或与其它分子间的相互作用，作者所在研究小组就应用了具有离子阱检测器的ESI-MS技术研究了胰岛素与苯酚及卵磷脂的相互作用，有关结果已发表在国际刊物Analytica Chimica Acta上[3]。

图6-1 电喷雾工作原理示意图[3] (⊕: multiple charged ion; +: charge)

最近一种新的基质辅助-激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术已被用来测定蛋白质一级结构的完整性。这种方法只需要用到很少的样品，而且只要在分析测试前简单地把载体溶解即可。激光解吸源是利用一定波长的脉冲式激光照射样品使样品电离的一种电离方式。被分析的样品置于涂有基质的样品靶上，用激光照射它，基质分子吸收激光能量，与样品分子一起蒸发到气相并使样品分子电离。激光电离源需要有合适的基质才能得到较好的离子产率。因此，这种电离源通常称为基质辅助激光解吸电离(Matrix Assisted Laser Description Ionization, 简称MALDI)。MALDI特别适合于飞行时间质谱仪(TOF),组成MALDI-TOF。MALDI属于软电离技术，它比较适合于分析生物大分子，如肽、蛋白质、核酸等。得到的质谱主要是分子离子，准分子离子。碎片离子和多电荷离子较少。MALDI常用的基质有2，5二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸等。MALDI-TOF质谱技术不仅可以定性地检测出一级结构发生改变的蛋白质，而且还可

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以对其定量，因此质谱方法将成为分析测试纳米粒中蛋白质变化的最吸引人的方法之一

[1]

。

高效液相色谱（HPLC）可以分离变性蛋白质与非变性蛋白质，同时还可以提供很多

定量数据，但是HPLC对活性抗原不能够进行定量测定，这时就需要用到酶联免疫(ELISA)技术。ELISA的基本原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。多肽蛋白质纳米粒在体内释药的药代动力学研究通常采用ELISA技术，例如血液中胰岛素或降钙素含量的测定分别采用相应的胰岛素或降钙素的酶联免疫试剂盒进行。

近年来用傅立叶变换红外光谱（FTIR）测定纳米粒中蛋白质二级结构的变化的工作也变得普遍起来。其工作原理是通过FTIR测定蛋白质的酰胺Ⅰ带在1600-1700cm-1的特征吸收，并通过对谱图作求导、去卷积处理、洛仑兹或高斯曲线拟合等计算机处理，最后计算出蛋白质中各种二级结构如α- 螺旋、β- 折叠、β- 转角、及无规卷曲含量的变化，从而揭示药物与载体间的相互作用规律，说明蛋白质在纳米粒中的稳定性情况。例如降钙素在不同pH值的缓冲溶液中的二级结构的变化，就是用衰减全反射FTIR来测定的，测定分析结果与用圆二色散（CD）测定的结果相一致[2]。FTIR不仅可测定固相蛋白质结构的变化，还可以研究溶液状态的蛋白质。所需样品量少，而且对样品中的蛋白质没有任何损伤，操作简便快速，是测定蛋白质空间结构变化的重要方法。 6.4 多肽蛋白类纳米药物的制备 6.4.1 载体材料的分类

用于制备多肽蛋白类纳米载药系统的载体材料可以分为生物降解型和非生物降解型两大类。

1. 生物可降解载体材料

用于制备脂质体的天然材料，如大豆磷脂、卵磷脂等都是生物可降解的。一些合成的聚合物也可以被生物降解，其中各种聚酯研究得最多，如聚D、L丙交酯（也称聚乳酸，

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PLA）、聚乙交酯（聚乙醇酸，PLG）、乙交酯与丙交酯共聚物（PLGA）、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚（ε-己内酯）及聚氰基丙烯酸烷基酯、聚碳酸酯等；其次还有各种聚酸酐如聚富马酸葵二酸等、以及聚氨基酸等也可被生物降解。由于聚酯都是疏水性的，因此可用亲水性聚合物如聚乙二醇（PEG）和聚氧乙烯（PEO）等对其进行改性，如聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物（PELA），聚乙二醇单甲醚-聚丙交酯嵌段共聚物（MPEG-PLA）等的亲水性能大大提高，使多肽蛋白质药物纳米粒的释药性能得到了改善。

此外一些天然的高聚物如壳聚糖、改性淀粉、明胶、海藻酸钠等也是生物可降解的，有较好的生物相容性，但由于来源上的差异，质量往往难以控制，不适合规模化生产，且这些聚合物亲水性强，药物释放速率快，因此其载药性能往往不及合成聚合物。

由于多肽与蛋白质的扩散速度非常慢，给药系统释放药物主要依赖载体聚合物材料的溶蚀。生物可降解型载体在体内水解酶的作用下可以水解成单体，最终转化成水及二氧化碳。对于植入体内的纳米材料而言，这样可以避免药物释放完后再通过手术取出载体材料的麻烦，因此，研究生物可降解型载体材料已成为大势所趋。 2. 非生物降解型载体材料

对于一些非生物降解型高聚物如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚酰胺等，有在体内毒性大，不宜排出体外等缺点，因此关于这方面的研究工作已逐渐减少。 3. 功能性高聚物载体材料

目前，具有pH敏感性、温敏性的载体材料也已经被开发出来，这些特殊材料在一定程度上可以更好地满足多肽药物定点释放、靶向给药的要求[4]。

人体胃肠道系统的pH值是有差异的，一般胃内pH低，易引起多肽蛋白质药物的降解，而小肠及结肠的pH较高，药物在此处释放稳定。一些pH敏感的聚合物在较低pH下不溶解，而在较高pH下溶解，因此用它们包裹多肽蛋白质药物用于口服给药时，可以使药物在小肠或结肠定点释放，提高药物的生物利用度。研究得较多的pH敏感的聚合物有甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的共聚物，这种聚合物在商业上被称为EudragitR树脂，它们在pH6-7以下的不溶性取决于甲酯的含量，而在pH6-7以上迅速溶解的性质取决于羧基的去质子化。

此外疏水基团改性的pH敏感凝胶由于对环境刺激的强烈响应，在口服给药系统有着广泛的应用，并且有些已商业化了（如Eudragit S 和Eudragit L两种树脂）。这些凝胶一般是通过分子链间的非共价键作用（如氢键作用、疏水作用和静电作用等）来实现药物的控释。由于凝胶分子的非共价键受凝胶分子的组成、结构和疏水基的长度以及环境的pH

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值等因素的影响，所以通过调节凝胶分子的组成或改变疏水基的长度就可以达到控释药物的目的。

本研究所的杨亚江等在设计药物结肠传递载药系统时，设计合成了四类疏水改性的偶氮苯交联凝胶。该凝胶的结构特点是：兼备pH、电场双重敏感的特征基团即羧基；含有可被盲肠菌分解的偶氮苯交联基团；带有可控制凝胶溶胀性能的疏水侧基。因此该载体在较低pH的胃中不分解，当其到达小肠后由于pH的改变，有一定的溶胀，但药物还不会从载体中释放出来，当其到达结肠部位时，载体中的偶氮交联基团被盲肠菌酶部分分解，此时溶胀和分解共同作用使药物完全释放在结肠部位[ 5]。

以甲基丙烯酸为基础共聚的阴离子型水凝胶、阳离子型水凝胶和两性水凝胶都具有pH敏感性，两性水凝胶在整个pH范围内都有一定的溶胀比，且在pH中性时，其溶胀速度要高于相应的阴离子型和阳离子型水凝胶。聚(丙烯酸)-CO-(丙烯腈)和聚(丙烯酸)-CO-(N一异丙基丙烯酰胺聚合物)两种水凝胶都具有温度及pH双重敏感特性。这种特性对于水凝胶在药物控制释放领域中的应用具有较大的意义。

此外，Markland等合成的新型交联聚(L-谷氨酸)和聚乙二醇聚合物的多肽水凝胶，具有生物降解性、高亲水性和对pH敏感的溶胀性。采用溶解酵素做水凝胶的药物控释试验表明有很好的效果[6]。

上述聚合物都是聚酸类pH敏感高分子，而壳聚糖类聚合物与N，N-二烷基氨烷基丙烯酸酯聚合物都是聚碱类pH敏感高分子。其中N，N一二烷基氨烷基丙烯酸酯类聚合物由于含有氨基，可质子化而产生碱性基团。其pH敏感响应范围与丙烯酸类高分子相反，在碱性范围内。

Hong等合成了聚N，N一二甲氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA )一OO-丙烯酰胺(AAm)、聚N，N一二甲氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)一CO-乙基丙烯酰胺(EAAm)两种共聚物，都具有pH、温度双重敏感性。把P(DMAEMA-CO-EAAm)体系应用于响应葡萄糖浓度变化来控释胰岛素的研究中，取得了较好的效果[ 7

，8]

。

自1984年Tanaka等人发现聚-N-异丙基丙烯酰(poly-N-isopropylacrylamide，PNIPAM)水凝胶具有温度敏感特性以来，对N-异丙基丙烯酰胺NIPAM的研究引起了人们极大的兴趣．目前，PNIPAM水凝胶的这种特殊的溶胀性能已应用于药物控制释放等领域．但PNIPAM水凝胶的缺点是在溶胀状态下过于柔软，难以定型，同时凝胶的体积变化较慢，因而使其应用领域受到限制．为了克服以上缺点，加强其机械强度，提高其响应性，与其它单体合成共聚或互穿网络共聚物(IPN)水凝胶等就成了一个较理想的途径[ 9]。一些综述性文章对此有

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较详细地介绍，在此不赘述。 6.4.2 纳米载药系统的制备方法

徐辉碧与杨祥良主编的《纳米医药》及前述各章节中，已详细介绍了有关纳米载药系统的制备方法，在此不作赘述。本节仅针对多肽、蛋白质类药物常用的脂质体和纳米粒制备中需要注意的一些特殊问题以及一些新的制备工艺做一介绍。 1. 脂质体纳米粒的制备

脂质体的制备方法多种多样，其中，逆相蒸发法、冻融法、注入法等常用于多肽类药物脂质体的制备[10]。脂质体作为多肽类药物载体的应用尚存在两个方面的重要问题：1）包封率问题。脂质体对脂溶性药物的包封率可以达到80～90%以上，但是对水溶性药物的包封率一般较低，对水溶性大分子药物的包封率则更低；2）药物稳定性问题。脂质体包封的生物大分子面临着胃肠环境因素的灭活。张磊[11]等在传统的胰岛素（Insulin，INS）脂质体制备方法基础上，一方面采用与水比重接近的有机溶剂乙醚以利于乳剂的形成，另一方面调整油水相比例以获得较均一的乳剂，从而最终得到了包封率为78.5%，粒径较小的（83.8±7.5nm）INS纳米脂质体。大鼠的小肠直接给药实验结果表明，该纳米脂质体可以保护INS在小肠中的活性并促进INS的吸收，但给小鼠直接灌胃给药无降血糖的效果。为此，他们认为该纳米脂质体可能仍然面临被胃酸及胃肠道内酶降解的问题。

脂质体的结构示意图如图6-2所示，研究表明带有长的、分枝少的、不饱和程度小的碳链的磷脂可形成紧密脂双层结构，该类脂质体稳定性较高，药物渗漏少。也可以在脂分子的极性头引入特征官能基团，该基团可在脂质体表面产生聚合作用，形成一个网眼状的网络结构，从而把脂质体埋于内部。这大大减少了脂质体在外部环境中的暴露，从而提高了脂质体的稳定性[10]，这种脂质体被称为聚合脂质体（polymerized liposome）。此外一些两亲性聚合物也可形成类似于脂质体的结构，称为聚合物囊（polymerosomes）。如图6-3所示，聚环氧乙烷-聚乙烯嵌段共聚物，相对分子质量比一般磷脂大几倍，可以用来制成聚合物囊，这种聚合物囊的膜比脂质体膜更硬，药物不易泄露出来。

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图6-2 两种类型的脂质体的结构示意图。上图为大的多层囊泡，下图为小的单层囊泡。中图为脂双层模型[10] 2. 复乳法制备聚合物纳米粒

与脂质体相比，聚合物纳米粒的贮存稳定性和体内稳定性都要强于脂质体[12-13]。因此，聚合物纳米粒表现出明显的优势。它的制备方法也很多，其中 w/o/w 复乳法是目前较常用的一种方法。首先将聚合物溶解在二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂中，再加入含有多肽蛋白质药物的水溶液，搅拌或超声乳化，得到w/o型初乳液，将该乳液分散到含表面活性剂的外水相中形成w/o/w型复乳。最后，加热搅拌下除去有机溶剂，得到固化的纳米粒或微球。形成稳定的初乳是使复乳稳定和获得高载药量的关键。牛血清白蛋白(BSA)PLA微球的研究表明，内相中加入适量聚乙烯醇(PVA)可显著提高w/o型初乳的稳定性；外相中加入表面活性剂(Pluronic F68、PVA等)也可提高初乳的稳定性。PLA溶液中加入Pluronic F68后可使粘度大大增加，有利于乳液的稳定[14]。

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图6-3 由聚环氧乙烷-聚乙烯嵌段共聚物制成的聚合物囊。（a）两亲性嵌段共聚物形成的双层结构示意图（左），（右）图为普通卵磷脂形成的脂质体的双层结构示意图。（b）分散在水中的聚合物囊与胶束共存的低温透射电子显微镜图片：黑箭头表示棒状的胶束，灰箭头表示球状的胶束[10]

外水相中PVA浓度的增大，可使微球粒径逐渐减小。此外，粒径的影响因素还有乳化时的搅拌速度、油相体积、聚合物浓度等。为提高载药量、减小突释效应，可在外水相中加入适量氯化钠。制备卵白蛋白PLA微球的实验表明，随氯化钠浓度的增大，微球的载药量和收率也相应增大[8]。 3. 相分离法制备聚合物纳米粒

相分离方法又称凝聚作用（Phase seperation /co-acervation）也是制备聚合物纳米粒的一般方法。其一般过程为：聚合物首先溶解在有机溶剂Ｏ1中，水溶性多肽蛋白药物溶解在水中并与有机相形成油包水(Ｗ/Ｏ1)乳液，然后将一种与Ｏ1互溶的有机非溶剂Ｏ2(即不能溶解该聚合物的有机溶剂)加到Ｗ/Ｏ1乳液系统中，搅拌使得聚合物相分离，并沉淀到水滴表面，凝聚成壳，得到非常柔软的包裹有药物的颗粒；最后将颗粒转移到另一种非溶剂Ｏ3中硬化形成最终的纳米粒。

常用作Ｏ1的有机溶剂有：二氯甲烷、乙腈、醋酸乙酯和甲苯。非溶剂Ｏ2对凝聚和硬

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化过程都有影响，不能溶解聚合物或药物，一般粘度较大，非溶剂Ｏ3相对更易挥发,通过洗涤能容易地除去非溶剂Ｏ2。通常采用聚硅酮油(siliconeoil)、植物油、液态的轻石蜡油、液态相对分子质量低的聚丁二烯以及液态相对分子质量低的聚甲基丙烯酸来作为Ｏ2，而使用正己烷、正庚烷、石油醚等脂肪族烃作为Ｏ3[15]。 4. 复乳法和相分离法对蛋白质稳定性的影响

无论是复乳法还是相分离法，在制备纳米粒的过程中都要用到有机溶剂及超声乳化或搅拌乳化的方法。而乳化过程中水与有机溶剂的界面是使蛋白质失活变性的重要因素。因为蛋白质在从水相中迁移出来并吸附在油水界面上时，它们会通过去折叠作用，把通常埋藏于大分子内的疏水区域暴露有机相中上，从而引起蛋白质的聚集，最终导致蛋白质失活。例如葡萄糖氧化酶（GOD）在第一步乳化的过程中，损失28%的活性，在第二步乳化过程中损失20%的活性，而在后续的洗涤、固化、离心及冷冻干燥过程中只损失不到4%的活性[10]。此外溶剂的种类对蛋白质的活性也有较大影响，例如与二氯甲烷相比，乙酸乙酯引起的蛋白质变性要少一些，当这两种溶剂的比例为1：1时，GOD的包封率及活性残留率都得到了提高[16]，有时使用丙酮与二氯甲烷的混合溶剂比单独使用二氯甲烷好，这有可能是因为丙酮具有降低界面表面张力的作用。

为了避免油水界面对蛋白质活性的影响，有人采用了直接把蛋白质分散在有机相中，形成S/O/W乳液的方法。如果在干燥的状态下，把蛋白质直接分散在有机溶剂中是不会引起蛋白质空间结构的改变的，因为从理论上来说，干燥的蛋白质在纯的有机溶剂中构象的变化比它们在油水界面上时小得多，因此更不易变性[17]。此外S/O/O方法可以进一步防止蛋白质在外水相中的泄漏，提高药物的包封率，避免油水界面的干扰[18]。

机械剪切力和超声处理也会使蛋白质降解。剪切力使蛋白质吸附至空气-水界面或油水界面上的几率增大，从而使疏水相互作用导致的蛋白质聚集程度增加。超声会产生气穴效应，小气泡迅速地膨胀与破裂使局部温度与压力增大，产生所谓的“热点”，并导致自由基的形成。当然可以通过减少搅拌或超声的时间及强度的方法，也可采用添加剂或选用恰当的有机溶剂的方法，来降低剪切力和超声对蛋白质的破坏程度。Zambaux[19]等研究表明，超声时间的缩短或者涡旋的应用，可以提高蛋白质C残留的活性。 5. 喷雾干燥法制备蛋白质聚合物纳米粒

与复乳法及相分离法相比，喷雾干燥法可以避免乳化过程中的高速搅拌及药物与有机溶剂的长时间接触，因此可有效保护蛋白质的活性，为制备性质不稳定药物的纳米粒增加了一条新途径。其具体过程是首先将多肽药物和聚合物用适当的溶剂溶解，制成乳液或混

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悬液后以雾滴形式喷出，溶剂在热空气的作用下快速挥发，形成纳米球。本法工艺简单、重现性好、易扩大生产，所得粒子表面光滑、包封率较高，但收率较低。此外，干燥过程中因溶剂的快速挥发可保持液滴温度低于干燥空气温度，因此有利于对温度敏感的药物的制备。在含药水相里加入适量PVA可保护多肽蛋白类药物的生物活性，这是由于PVA可隔离药物与外相中有机溶剂的接触[20]。

Cleland[21] 等采用低温技术对喷雾干燥法进行了改进，这种技术不需要表面活性剂和水，避免了溶剂界面，和较高的喷雾温度对蛋白质的破坏。他们首先把蛋白质溶解在PLGA的有机溶剂中，然后通过喷嘴喷雾到一个管道中，在这个管道中有冰冻的乙醇，其表面覆盖有液氮，当管道中的温度升到-70℃时，乙醇开始融化，并萃取喷雾液滴中的有机溶剂，就可得到固化的微球。这种方法可以有效保护化学修饰的生长激素（GH）的包裹稳定性，而且与GH的水溶液注射剂相比，该制剂在体内的血浆浓度水平延长了20倍。 6. 超临界流体（CO2）相分离技术制备蛋白质聚合物纳米粒

上述的复乳化法、相分离法及喷雾干燥法中均要使用大量有机溶剂，并需进行洗涤、干燥等后处理，易造成有机溶剂的残留，影响产品质量。目前，基于超临界流体（CO2）的相分离技术—雾化溶剂萃取系统(aerosol solvent extractionsystem)已用于蛋白多肽药物纳米粒的制备。该系统主要包括超临界溶液快速膨胀法(rapid expansion of supercriticalsolution, RESS)、气体抗溶剂重结晶法(gas anti-solvent recrystallization, GAS)和压缩流体抗溶剂析出法(precipitation with a compressed fluid anti-solvent，PCA)。本工艺可达到避光、隔绝空气、防水、无菌等要求，且可扩大生产[14]。

RESS法是将药物溶解在超临界流体中，然后通过一个小孔喷出，超临界溶液快速膨胀减压，溶解能力降低从而形成均一的颗粒。RESS过程主要适用于能溶解于超临界流体的物质，因而不太适用于制备蛋白质缓释微球。

GAS法首先把药物和聚合物溶于有机溶剂中，再利用与有机溶剂互溶但对药物和聚合物溶解能力差的超临界流体(抗溶剂)，使药物和聚合物析出形成纳米球。本法适用于微溶或不溶于超临界流体的化合物。增加体系中超临界流体的含量，有利于有机溶剂膨胀，使其在纳米球中的残留量较低，粒径分布也较窄。利用GAS技术，PEG/PLA共混聚合物纳米粒可以成功地包埋胰岛素，而且该胰岛素纳米粒在体内的活性非常高[22]，其中GAS的工艺流程图如图6-4所示

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图6-4 半连续GAS工作原理示意图[16]：F, 流入口；P, 活塞泵；S, 加热器；TG, 温度调节器；VM1, VM2, VM3, 仪表阀；VT, 三通阀；K, 有窗的小池（runs 1-3），200cm3, 圆柱形导管(runs 5-18); RH, 电阻；PI, 压力指示剂；TI, 温度指示剂；PL, 泵注射仪；S1, S2, S3, 溶液导管；PE, 膨胀导管；R, 旋转式流量计；W, 通风孔

PCA法与喷雾干燥法类似，先将含药聚合物溶液喷射到超临界流体蒸气相中形成雾滴，超临界流体在高压下会渗入雾滴使溶剂的溶解力下降，从而使药物和聚合物析出形成纳米粒。

7. 直接聚合法制备蛋白质聚合物纳米粒

此外还可以采用直接聚合的方法合成负载多肽蛋白药物的纳米粒。例如通过热引发聚合反应，直接合成负载胰岛素的温敏型丙烯酸酯-聚乙二醇共聚物纳米粒已获成功，该胰岛素聚合物纳米粒的热稳定性大大提高[23]。用锌做引发剂，通过简单的交联反应可以得到负载胰岛素的聚乙烯亚胺和右旋糖苷硫酸盐的纳米粒，该纳米粒可以延长胰岛素在体内的降血糖效应[24]。

经常用于负载多肽蛋白药物的纳米粒—聚氰基丙烯酸酯纳米粒也可采用直接聚合的方法得到。常用的单体是氰基丙烯酸丁酯（n-butylcyanoacrylate，BCA），BCA聚合方法主要有两种：乳液聚合和界面聚合。乳液聚合法是将表面活性剂（或/和多肽药物等）溶于水中，调pH至酸性，搅拌下滴加BCA，继续搅拌，BCA即在亲核基团OH-或葡聚糖基（dextran基）的催化下聚合成球，最后调节pH至中性终止反应。此法操作简便，条件易于控制，所以用得较多。那些在酸性介质中溶解度较大且较稳定的药物适合用乳液聚合如胰岛素、降钙素等。界面聚合是将羧酸酯、BCA(或/和多肽药物等)溶于无水乙醇中构成有

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机相，水相由水和表面活性剂组成，磁力搅拌下将有机相缓慢滴加入水相中，旋转蒸发除去乙醇即得。与乳液聚合法相比，界面聚合法适合包封脂溶性药物[25]。 8. 不同制备方法对多肽蛋白质纳米粒性质的影响

不同的制备方法制备得到的多肽蛋白类纳米粒的性质往往有较大的差别。Kawashima[26]等以促甲状腺激素释放的激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）（Mw=363.4）作为模型药物，考察了油相中乳化溶剂扩散法（emulsion solvent diffusion method in oil，OSD）、水相中乳化溶剂扩散法（emulsion solvent diffusion method in water，WSD）以及相分离法，这三种制备方法对PLGA纳米球粒度、释放特性、包封率等的影响。

在WSD方法中，首先把PLGA和药物溶解在丙酮及乙醇的混合溶剂中，然后把混合溶液倒入含有PVA的水溶液中，由于有机相迅速扩散进入水相，使表面张力减小，O/W乳液就会自发形成。在有机溶剂的扩散过程中，随着溶解度减少，药物与聚合物共沉淀形成纳米粒，PVA作为表面活性剂吸附在液滴表面防止纳米粒进一步的聚集。这种方法的优点是简单，粒径分布窄，纳米粒容易分散(见图6-5)，缺点是在溶剂扩散过程中，水溶性药物易从乳滴中扩散泄漏出来，导致水溶性药物包裹率低。因此为了提高包裹率，可以采用在油相中扩散的方法即OSD法。OSD法通常在聚合物有机相中加入一些表面活性剂如司盘80等，然后把溶有聚合物PLGA及药物倾入油相即可得纳米粒。

图6-5 WSD方法制备的PLGA的扫描电镜图[12]

Kawashima的实验结果与上述分析基本一致：WSD法制备的纳米球平均粒径为250nm，远远小于OSD法（700nm）和PS法（800nm）所得的纳米球粒径。三者的多分散系数分别为0.02-0.06、0.2-0.3、0.3-0.5之间；而包封率以OSD法的最高，TRH的包封率为43.5％；OSD法制备的纳米球可持续释放药物长达14天，PS法制备的纳米球表现出三

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相释放模型，包括起始突释期、诱导期和药物扩散期。在PS法中，包封率是依赖于药物分子与聚合物载体之间的相互作用的。通过差热扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）检测仅发现TRH与PLGA之间存在弱的相互作用，因此其包封率为14.5％左右。PS法与OSD法及WSD法制备的纳米球的结构示意图如图6-6所示。

图6-6 不同制备方法得到的纳米球的结构示意图：左图表示WSD与OSD制备

的纳米球，右图表示PS法制备的纳米球。小黑点表示药物，网孔状区域表示聚合物基质[26]

不仅制备方法及工艺对多肽蛋白类纳米粒的粒径、包封率、稳定性及释药特性等有重要影响，纳米粒处方中各种组成因素对多肽蛋白质的体内外稳定性及释药特性也有较大影响，下面将对这一问题进行详细讨论。

6.4.3 载药体系中各种因素对蛋白质稳定性的影响

对于纳米粒载药系统中各种组成因素对多肽蛋白质稳定性的影响， Doelker[1]等作了较详细的综述。 1. 多肽蛋白质的性质

首先纳米粒中蛋白质的来源与纯度对蛋白质的稳定性有较大影响。蛋白质生产过程中，某些污染物的引入可能是蛋白质不稳定的关键因素。为了避免蛋白质在生产与制剂过程中的失活或变性，常需要对蛋白质进行改性修饰以提高其稳定性。其中用聚乙二醇（PEG）修饰蛋白质的pegylation技术具有非常大的发展前景，经PEG修饰的蛋白质不仅稳定性大大提高，生物半衰期也会延长。例如通过共价键与甲氧基-PEG连接的溶菌酶在制剂过程中比天然溶菌酶表现出更好的稳定性。经PEG修饰的α-干扰素能更好地抵抗油水界面引起的降解作用，而且生物半衰期也比天然α-干扰素增长。此外一些蛋白质如GH和NGF与锌络合后稳定性也大大提高。由于未被修饰的蛋白质具有―自我保护‖行为，因此在用乳化法制备纳米粒过程中，提高蛋白质的浓度有利于提高被包裹药物的稳定性。这可能是一部分蛋白质吸附在油水界面上后可以聚集起来阻止未被吸附的蛋白质进一步的聚集。 2. 聚合物的性质

如何选用一个恰当的聚合物来包裹蛋白质主要依赖于药剂学家希望赋予该载体的释药特性所决定。通常亲水性聚合物有利于水的渗透，因此也有利于药物的连续的释放。使用

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亲水性聚合物和疏水性聚合物的共混物，或者使用两亲性共聚物都有可能达到连续释药的目的，同时还可以提高被包裹蛋白质的稳定性。

Jiang 和Schwendeman[27]用疏水性的PLA及亲水性的PEG的共混物来包裹BSA，可以有效地避免药物释放过程中，PLGA降解产生的酸性物质对BSA的破坏。当PEG在共混物中的含量低于20%时，BSA的释放是不完全的，而且可以观察到BSA非共价聚集物在聚合物中的残留；当PEG在共混物中的含量介于20%-30%时，连续释放率大幅度提高，BSA也能保持结构上的稳定性。这种现象可以用两种聚合物的协同效应来解释：与PLGA相比，PLA的降解速度要慢一些，这样可以避免降解的酸性物质在纳米粒中的快速累积，同时PEG亲水性强，有利于水分子的渗透，因此有利于降解物扩散出聚合物，这样就可以使药物释放过程中，保持接近中性的状态，避免了酸性物质引起BSA的降解。

PLA/PEG共混物也可以用于胰岛素的包裹，与PLGA/PEG共混物相比，体外结果表明，胰岛素在PLA/PEG共混物中降解得要少一些，在动物体内还可以保留天然胰岛素降血糖活性的80%。

两亲性双嵌段共聚物单甲氧基聚氧乙烯-聚乳酸（MPEO-PLA），通过w/o/w复乳法及选用恰当的有机溶剂和超声时间来包裹蛋白质C，纳米粒中几乎所有蛋白质C在释药过程中都有活性[19]。但有时使用两亲性共聚物得到的结果与预期的相反，例如PLA-PEG共聚物在药物的释放过程中不能避免降钙素的乙酰化[28]。对于像红细胞生成素（EPO）这样活泼的蛋白质来说，有时单独使用PLGA比使用PEO-PLGA两亲性嵌段共聚物更不易使蛋白质失活[29]。

被包裹蛋白质与PLGA的相互作用是蛋白质聚集、体外缓慢的、不完全释放的主要原因，这些相互作用可能是蛋白质与PLGA的疏水相互作用，也有可能是离子相互作用使蛋白质吸附在PLGA上。聚合物羧基末端是否被封闭对蛋白质的释放也有较大影响。一般来说，游离的羧基越多，蛋白质与PLGA的离子相互作用越强。正是因为这个原因，与聚合物羧基末端被封闭的PLGA纳米粒相比，L-天门冬胺酰酶的PLGA纳米粒在羧基末端未封闭时，不仅对蛋白质的载药量大大提高，而且可以获得活性酶的长期连续释放[30]。

与上述常见的PLGA或PLA纳米粒相比，其他聚合物有时对蛋白质也有较好的保护作用。例如胰蛋白酶在聚酸酐中有很好的释放活性。海藻酸盐载体对BSA有很好的保护作用。

3. 稳定剂的作用

为了防止聚合物包裹过程中蛋白质的变性与失活，常加入一些稳定剂。对于某一种蛋

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白质应该加入何种稳定剂通常需要大量而繁琐的筛选实验来确定。添加剂稳定水溶液中蛋白质的机理一般被认为是所谓的―优先水化作用‖。蛋白质在水溶液中通常存在天然状态与变性态的平衡，因为添加剂与蛋白质的直接结合被认为是热力学不稳定的，因此蛋白质有排斥添加剂，优先水化回到天然状态的趋势。常用的稳定剂如糖、某些盐、氨基酸和多羟基化合物等都会被蛋白质排斥。还有其他的机理如一些添加剂有表面活性作用或有静电相互作用等[1]。

在w/o/w复乳化过程中，常把糖加入到内水相中。海藻糖可以提高PLGA纳米球中BSA的活性，同时有助于BSA以单体形式释放。海藻糖和甘露醇还可以有效地保护乳化与超声过程中γ-干扰素和生长激素的活性，但对类胰岛素生长因子-Ⅰ没有保护作用。甘露糖能够减少纳米粒中α-胰凝乳蛋白酶的聚集。海藻糖还可以保护喷雾干燥过程中，破伤风类毒素的抗原活性。环糊精（CD）也可用来作稳定剂。CD具有一个亲水性的外环和一个疏水性的环状孔洞，这个疏水性孔洞可与蛋白质中的芳香型氨基酸残基相互作用，从而达到稳定蛋白质的构象，防止蛋白质失活的目的。例如在复乳化制备纳米球的过程中，内水相中加入CD，红细胞生成素（EPO）的共价聚集程度大大下降，溶菌酶的稳定性也大幅度提高，但CD对IGF-Ⅰ没有保护作用，而且高浓度的CD会使过氧化物岐化酶（SOD）的活性大大下降[1]。

表面活性剂具有降低溶液表面张力，阻止蛋白质在疏水性界面吸附或聚集的作用。一般使用非离子型表面活性剂如吐温20或吐温80等。具有凝胶性质的两亲性表面活性剂poloxamer 407在包裹脲酶的过程中，对脲酶有很好的保护作用，这是因为它的亲水性聚氧乙烯链有水化凝胶结构。poloxamer 188可以成功地延长PLGA中α-干扰素（INF-α）的释放活性，但与单独的PLGA相比，poloxamer 188不能有效地保护PLGA中BSA的二级结构。SDS能够大大降低胰岛素在二氯甲烷和水界面上的聚集程度，但十二烷基麦芽糖苷不能。在此要强调的是，表面活性剂是蛋白质包裹过程中最常用的添加剂[1]。

一些蛋白质如白蛋白及明胶等常作为药物蛋白包裹过程中的稳定剂。白蛋白可以防止药物蛋白的去折叠或聚集作用已被广泛研究，其原因可能是白蛋白有良好的表面活性，它们占据了界面位置，因此阻止了药物蛋白与有机溶剂或疏水界面的接触。例如白蛋白加到内水相中，可以保护乳化及超声过程中80%以上的IGF-Ⅰ的活性不受损失。由于BSA自身在界面上聚集，因此可以提高溶菌酶的活性，同时可以大大降低EPO的共价聚集的生成。但白蛋白并不是总有效的，例如白蛋白不能降低复乳过程中，胰蛋白酶和NGF的活性的损失。此外，白蛋白还能清除蛋白质降解过程中产生的氢离子，可以避免酸性物质对药物蛋

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白的破坏[1]。

聚合物PEG也可以作为稳定剂。例如内水相中加入PEG 400，可以有效地保护NGF与天门冬酰胺酶在复乳过程中的活性。此外为了减少聚合物降解产生的酸性物质对蛋白质的破坏，常在聚合物中包埋一些碱性的盐如碳酸氢钙、碳酸钙、碳酸锌及氢氧化镁等中和降解过程中产生的酸性物质。例如碳酸钙的加入能有效地提高胰岛素体外释放效率，并能大大减小纳米球中未释放胰岛素的共价二聚集体的形成[1]。 6.5纳米载药体系中多肽蛋白类药物的体外释放 6.5.1 药物释放的可能机制

张强[31]等认为纳米载药系统中多肽蛋白类药物的体外释放可能有以下几种机制：1）聚合物材料的溶蚀或降解而引起的药物释放；2）多肽与蛋白质类药物经孔洞自发的扩散释放；3）药物从聚合材料表面的释放；4）由于波动磁场或声场的诱导而产生的脉冲式释放。

在通常情况下，以上机制可以同时起作用。相对而言，在上述几种释放机制中，药物经孔洞自发扩散释放机制显得不太重要。这是因为多肽与蛋白质类药物如能轻易从由于相分离及药物溶解而造成的水性通道扩散出来，那么纳米粒系统的药物包封率就可能很低。实际上，聚合物表面的药物释放及聚合物材料的降解所造成的药物释放是最重要的，这就是常观察到―爆释效应‖（burst effect）的主要原因。 6.5.2 药物释放的三相

纳米粒中多肽与蛋白质类药物释放的典型曲线可分为三相：起始突释相、扩散控释相和降解控释相。起始突释相是位于粒子表面或近表面的蛋白质、多肽溶解进入水相的快速释放过程。这一过程有可能会导致短时间内多肽、蛋白质的大量损失，进而使得药物无法持续性释放，甚至还会产生局部毒性。研究发现，在乳化过程中，表面活性剂如吐温20的加入可以去除表面的多肽、蛋白质，从而使纳米粒表面的结构变得比较致密，起始突释过程就会变得不太明显。此外如果药物与聚合物之间存在很强的离子相互作用力，也会导致体外释药过程中，观察不到明显的药物起始突释过程。扩散控释相是指随着水分子渗入基质，孔隙间的蛋白质通过粒子表面孔道扩散释放的过程。降解控释相是指聚合物由于水解作用而降解，其中包裹的药物随之慢慢释出的过程。为了获得药物的连续释放，扩散控释相应与降解控释相互相最好能重叠，这时聚合物降解形成的孔隙可以促使包裹的蛋白质进行连续释放。

6.5.3 影响药物释放特性的因素及实例说明

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理想的多肽与蛋白质纳米载药系统应该具有非常低的起始爆释率，连续稳定的药物释放速度。而实际上影响药物释放性能的因素是非常多的。聚合物的结构、组成、相对分子质量大小、亲水性强弱、聚合物与药物相互作用的方式与强度、纳米粒的制备方法及工艺、各种添加剂如表面活性剂等的加入等都会影响蛋白质的释放。这些情况在6.4.2及6.4.3中已有一些说明。

Blanco[32]等以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白，考察了PLGA不同共聚物组成、Poloxamer188的掺入以及不同的溶剂去除手段对BSA-PLGA这一纳米球体系的体外释药特性的影响。结果显示，所有剂型均表现出典型的释放特性：起始的快速释放（第一天）和随后缓慢的、持续释放，如图6-7所示。

图 6-7 不同处方组成的PLGA对BSA体外释药曲线的影响

但是与以往BSA微球不同的是，纳米球的起始突释与球的粒径大小无太大相关性，而主要受聚合物亲水性的影响。爆释效应最小的是粒径尺寸为398nm、共聚物为Resomer?RG 503H的制剂I（20%），最显著的是粒径尺寸为323nm、共聚物为Resomer?RG 502的制剂B（60%）。由此可见，对BSA包裹最有效的是亲水性聚合物Resomer?RG 503H。这一聚合物链具有游离的羧基末段，可以很好地和BSA发生离子相互作用，因此也就表现出较低的爆释效应。另一方面，羧基末段经酯化的Resomer?RG 502和Resomer?RG 503组成的BSA-PLGA纳米球因所采取的溶剂去除手段不同，也表现出不同的爆释效应。这是因为与溶剂挥发手段相比，当溶剂被萃取时，聚合物被快速地沉淀下来，阻止了BSA分子从内部水相向外部水相的迁移，从而更有效地包埋BSA。这些BSA-PLGA纳米球的释放曲线第二相的差异可以从共聚物亲水性、聚合物降解速率的不同以及BSA和聚合物的相互作用来解释。无论是聚合物残留相对分子质量（%）的改变，还是BSA的释放速率并不依赖于共聚物最初的相对分子质量，而是很大程度上依赖于聚合物的

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亲水性。聚合物链游离羧基的存在显著提高聚合物的降解速率，而依旧降低BSA的释放。但是当添加Poloxamer 188到制剂中时，则促进BSA从亲水性纳米球中的释放，这主要是因为该表面活性剂的存在减弱了BSA和PLGA之间的相互作用。此外，他们还制备了L-天冬酰氨酶（L-Asparaginase）-PLGA纳米粒，用同样的方法证实了上述的结论。

然而在环孢菌素A (cyclosporin，CyA)-PLA、CyA-PEG-PLA纳米粒（或微球）中，CyA却以经典的扩散方式释放。在起始突释过程中，大量的CyA释放出来，释放量甚至超过了表面吸附的CyA量；作用15天后，几乎未发现任何聚合物相对分子质量的变化和平均粒度、Zeta电位的改变。这些结果都说明了CyA从粒子中的释放并不是由于聚合物骨架的不断融蚀引起的，而是因为扩散释放造成的。因此，各载药体系对水的吸收不同和多孔性的差异是影响CyA扩散释放的主要因素。结果表明，水很容易扩散进入PLA、PEG-PLA基质中。聚合物基质中亲水的PEG链的存在可进一步促进水的吸收。其中PEG-PLA微球又比PEG-PLA纳米粒吸收的水要多，这主要是因为微球内部具有多孔性。尽管如此，由于纳米粒的表面积更大，表面吸附的CyA更多，所以其表现出更强的爆释现象。另外，作者还针对CyA在PEG-PLA系统中的释放提出一种假设：认为PEG亲水的外壳，可以充当CyA从疏水内核扩散到外界释放介质之间的一个贮水相或静止层。这一假设已经由以下结果被证实。PLA粒子经15天的处理，在其表面基本上检测不到CyA的存在，说明原先存在于表面的CyA已经被移走，而PEG-PLA粒子经同样地处理后，尽管已经有50%左右的CyA被释放出来，其表面上却还保持有一定量的CyA[33]。 6.5.4 影响脉冲式释药系统的因素

某些多肽与蛋白质类药物，如胰岛素（INS）的给药需要根据体内血糖的变化作出周期性的改变，因此需要一种脉冲式释药系统。据报道，利用波动磁场可以实现脉冲式释药。其基本原理为：在磁场的存在下，由于磁场作用使聚合物链分离，导致大量的水渗透进入体系中溶解部分包封INS，并使聚合物骨架膨胀，增大了INS的被动扩散；撤去磁场，在膨胀骨架中部分溶解的INS，只能以经典的扩散方式释放，从而达到控制药物释放的目的。另外，改变粒子表面孔洞的大小也可以调节药物的释放[31]。 6.5.5 药物与载体的相互作用方式的研究

为了更好地了解纳米载药系统体外释放过程，有必要对药物和载体之间的相互作用以及药物在纳米载药系统中的定位进行探讨。张强等[34]根据INS内源性酪氨酸残基的荧光特点，通过测定脂质体被破坏前后在302nm处是否有吸收峰来表征INS在脂质体中的存在方式。结果表明，INS脂质体在302nm处无发射峰，而经氯仿提取破坏类脂质后有发射峰。

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由此可以推测，INS在脂质体中可能有两种存在方式：（1）INS被包裹在脂质体内部；（2）INS以表面吸附或部分插入脂质体中，但其荧光发射基团未暴露在脂质体的表面。胰蛋白酶降解实验表明，90％的INS都能受到保护。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离结果显示，INS脂质体中无游离的或表面吸附的胰岛素分子。这进一步证实了INS是被包裹在脂质体的内部，这种结合方式不仅可避免表面吸附所导致的药物突释效应，并且在给药过程中不易被破坏。

国外有学者利用聚合法制备了聚氰基丙烯酸异丁酯INS(胰岛素)的纳米囊体系和不加INS的空白纳米囊，发现二者具有相同的粒径[35]。那么INS与聚合物单体在制备过程中是否存在相互作用呢？Damge等针对这个问题进行了探讨。INS纳米囊经分子凝胶色谱分离纯化后，用红外光谱进行表征，并将其与同等条件下制得的空白纳米囊进行比较。含药与不含药的纳米囊经过凝胶色譜的保留时间均为12.02min，相对分子质量为149000，这说明在形成纳米囊时，INS并未参与IBCA的聚合反应。虽然红外光谱显示了O—H和C—N的特征波数（3600和2250cm1），但由于体系中有乙醇，所以不足以说明INS在制备过程

－

中与聚合物有相互作用，这有利于INS在体内的释放和吸收。将含药与不含药的纳米囊进行表面zeta电势的测定。结果表明，这两种纳米囊的zeta电势均为－19mv，这说明INS是被包裹在纳米囊内，而不是简单地吸附于纳米囊表面，如果将500μmol/L的INS加入到不含药的纳米囊分散体系中，zeta电势将从－19mV升高到－10mV，因为在这种情况下，INS只是简单的吸附于纳米囊表面，这进一步证实了上述实验结论。

马利敏[36]等还利用INS抗体与抗原的特异性反应，通过放射免疫法（radioimmunoassay, RIA）测定γ计数，计算出INS-PCLA纳米粒表面吸附的INS占被包封的INS的53.66％，只有46.34％的药物被包埋在纳米粒中，表明该纳米载药体系的主要载药方式为表面吸附。

6.5.6 药物释放介质对体外释药的影响

不仅药物与载体之间的相互作用的方式对多肽蛋白质的释药有重要影响，释放介质的性质如离子强度、pH、缓冲体系，温度和搅拌速度等也都会影响纳米粒中药物的释放。在磷酸盐缓冲液中，若介质温度高于聚合物的玻璃化温度，则聚合物的平均相对分子质量有明显下降，聚合物基质的通透性增加，导致药物可快速扩散出来；反之则聚合物相对分子质量下降缓慢，药物的释出也较慢。常将纳米粒或微球置于37℃、含释放介质的透析袋或离心管中测定释放度。由于整个释放过程需较长时间，该法对于缓释时间长的产品有一定局限性。为在短期内考察药物的释放情况，Shameem[37]等在研究多肽PLGA微球时设计了

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一套加速试验方法。首先，升高介质温度，一般高于聚合物的玻璃化温度，此时聚合物松软，通透性增强，药物的分子运动也相对加剧。第二，选择合适的表面活性剂，防止微球的聚集。第三，选择合适的缓冲液浓度，增大释放介质的离子强度可减少多肽与聚合物的相互作用，有利于药物释放。尽管Shameem等的实验方案是对微球体系而言的，但对纳米球或纳米囊同样具有重要的参考价值。

体外试验的目的是为了预测药物在体内的释放情况，但试验表明体内和体外的释放总有一定的差异。如重组人生长激素(rhGH)的PLGA微球在体内的降解速度比体外快，从而使药物在体内的释放也加快。原因可能是体内的脂质或其它生物活性成分充当增塑剂，有利于水渗入聚合物内，另外机体的排异反应导致的局部温度、pH改变也可能使体内降解加快。

6.6 纳米载药体系中多肽蛋白类药物的体内吸收

纳米粒由于粒径小，进入体循环后主要被网状内皮系统（RES）中的白细胞、单核细胞以及巨噬细胞所吞噬，而内皮系统（RES）主要包括肝、脾和骨髓。由于RES的吞噬作用，当载药纳米粒通过注射给药进入血管后，就会靶向作用于RES系统，这对于治疗RES系统疾病如内脏利什曼病，细胞内感染等有特殊意义，但多数疾病并不处在RES系统中，吞噬作用反而会降低纳米粒在体内循环的时间，使药物的疗效降低[31]。

由于多肽蛋白类药物的特殊理化性质，多肽蛋白类药物的纳米载药粒子经口服给药后，其生物利用度还远未达到人们所期望的那样，原因主要有（1）胃中酸的催化降解；（2）胃肠道中的各种消化酶；（3）胃肠道粘膜的低通性；（4）通过吸收屏障后肝的首过作用等，几个方面都影响了纳米粒及药物的吸收。纳米粒经口服给药主要通过小肠的Peyer ,S结中的M细胞摄取进入体循环。同时由于纳米粒的粒径较小，可通过肠系膜的细胞间通路进入循环。但很多研究表明这样的粒子通常不到5%，而且还与粒子的粒径、亲脂性、电荷及聚合物的组成有关。此外还有很多影响粒子吸收的因素还不太清楚，小粒子通过粘膜的机制有待于进一步证实，这些都有碍于纳米粒口服给药的应用[31]。 6.7 几种重要的多肽蛋白类纳米药的研究进展

在本节中我们将分类介绍近年来，一些重要的多肽蛋白类纳米载药系统的研究进展，并将分别从制备方法、理化特性（如粒径大小、包裹率等）、体外释药特点、给药途径及动物体内的给药试验结果如生物利用度、生物效应（如胰岛素的降血糖效应）等方面对多肽蛋白类纳米药物进行评价。 6.7.1

胰岛素纳米载药系统

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胰岛素（INSULIN，简称INS）是脊椎动物胰脏β细胞分泌的一种含有51个氨基酸残基的多肽类激素，具有降血糖作用。其用于糖尿病的治疗已有70余年的历史，至今仍为治疗INS依赖型糖尿病的首选药物。对于一般口服降糖药已经疗效欠佳的Ⅱ型糖尿病患者，同时选用胰岛素进行治疗也非常重要。但是，一直以来，临床上给药途径通常以注射给药为主。普通的INS注射剂半衰期较短，需要一天一次或一天三次给药，这给病人带来很大的痛苦与不便，且伴有多种不良反应，为此，国内外研究者一直致力于INS的缓释注射剂和其它非注射给药途径的研究。胰岛素的纳米球或纳米囊可以在一定程度上可以达到这些目的。

胰岛素的来源较多，可以从猪或牛的胰脏中分离提纯得到大量的猪或牛胰岛素，因这些动物胰岛素对人体有一定的抗原性，因此临床上已开始大量应用基因工程生产的人胰岛素注射剂。人胰岛素与动物胰岛素只有一个氨基酸残基的差别，因此在理化性质上差别不大，都在水中溶解度不大，而且几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂，但在酸性或碱性溶液中有较大的溶解度，这是因为它有两性，可与弱酸或弱碱形成可溶性的盐。胰岛素的这些理化特性对于制备胰岛素纳米粒来说并不是十分理想。但是采用恰当的材料和制备工艺，利用纳米粒包裹胰岛素得到的胰岛素纳米注射剂具有非常好的缓释效果。 1. 缓释胰岛素纳米注射给药

Mesiha[38]等对Couvreur的方法进行了改进，即采用不用油的聚合方法合成了包裹INS的聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒。他们把2mL胰岛素溶液（200U）加到含有不同浓度的Pluronic 酸的柠檬酸溶液中，然后在搅拌下逐滴加入氰基丙烯酸异丁酯单体，室温下搅拌4h聚合完全，最后用NaOH将pH调至7.4，即可得到INS纳米粒。体外试验结果表明，INS纳米粒的粒径随着Pluronic 酸的浓度增加而减小，当Pluronic 酸的浓度为2.5%时，纳米粒的平均粒径最小为85nm，对胰岛素的包裹率为59%。给链脲佐霉素诱导的糖尿病大鼠皮下注射该纳米粒，其降血糖效应可持续72h，而普通注射剂仅能持续6h。该制剂口服给药的降血糖效应与对照组相比也非常显著。

以氰基丙烯酸丁酯（BCA）为单体材料，采用乳化聚合法得到平均粒径为101nm的INS纳米囊，给糖尿病大鼠单次皮下注射后，降糖作用明显，且随剂量增加作用增强，具有明显的剂量依赖性，药效最长可持续7天，而普通的INS注射液降糖作用仅持续8小时。纳米缓释注射剂3天给药一次的降糖作用可接近普通注射剂1天3次常规的用药疗效，表明INS纳米囊可以明显延长INS的降糖作用时间，药效优于相同剂量的INS注射液

[39]

。

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Pluronic F-127（PF127）凝胶是一种嵌段共聚物，由聚氧乙烯（polyoxyethylene）和聚氧丙烯（polyoxypropylene）组成。相对分子质量大约12500，PF127在20-30%的浓度范围内有可逆的热凝胶性质。PF127与纳米粒的结合可进一步提高药物的缓释效果。Barichello等将PF127凝胶和INS-PLGA纳米粒（po结合获得PF127-INS-PLGA制剂[40]。分别将INS溶液、INS-PLGA、INS-PF127以及PF127-INS-PLGA这四种制剂给正常大鼠皮下注射，INS溶液于注射后1个小时即达最低血糖值，随后迅速恢复正常，而其它几种制剂则均表现出较明显的持续降血糖作用，其中又以PF127-INS-PLGA降血糖作用维持最久。PF127凝胶在这种情况下可能起到延缓粒子释放、防止INS聚集和保护INS免受局部蛋白酶酶解的作用。

前已述及多肽蛋白质用PEG修饰后可以提高其稳定性。Hinds[41]等用相对分子质量为5000Da的PEG修饰了人胰岛素B链氨基末端，并进一步用乳化法使PLGA微球包裹PEG-胰岛素，结果表明胰岛素的构象和生理活性在PEG化及被PLGA包裹后都得到了较好的保留。体外释药过程说明该微球的爆释效应非常小，这对胰岛素在体内连续稳定的释放非常重要。在动物实验中，PEG-胰岛素微球单次皮下注射后，在第一天只有不到1%的胰岛素释放，但它能使糖尿病大鼠血糖在大约9天内都低于200mg/dL，每间隔7天给药一次，就可以使体内血药浓度维持恒定。PEG-胰岛素PLGA微球很有希望成为一个星期给药一次，能连续释放恒定胰岛素的新制剂。 2. 胰岛素鼻腔给药纳米制剂

胰岛素不仅可以通过注射给药，还可以通过鼻腔粘膜给药。鼻粘膜下有丰富的毛细血管和淋巴管，鼻粘膜上皮细胞与血管壁紧密相连，厚度小，上皮细胞间隙较大，有较高的渗透性，且能避免肝脏的首过效应，此外鼻粘膜中蛋白酶含量也比胃肠中少得多。因此低相对分子质量的多肽蛋白类药物可经鼻腔上皮细胞吸收进入血液循环。许多动物实验结果表明，在各种吸收促进剂（其含量通常低于5%）的作用下，胰岛素可经鼻粘膜直接吸收进入血液循环，降低动物血糖水平，其绝对生物利用度最高可达30%以上，其药代动力学参数与注射组相比无显著性差异[42]。

与只含促进剂的普通胰岛素滴鼻剂相比，胰岛素纳米粒鼻腔给药系统具有黏附时间长，清除率低，降血糖作用持续时间长，生物利用度高等特点。

Fernandez-Urrusuno等以壳聚糖（CS）为载体材料，制备了平均粒径为300~400 nm之间，包封率为55% （w/w）的INS-CS纳米粒[43]。以家兔为研究对象，经鼻腔给药，监测血糖水平的变化。与INS醋酸缓冲溶液相比，INS-CS纳米粒大大促进了INS的整体吸收。给药

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后1个小时，血糖浓度即降到了起始血糖的60%， 降血糖作用可以持续2个小时。这一结果与以往的报道结果是一致的，说明CS的确具有较强的黏膜吸附作用，还可以暂时开放细胞间的紧密连接，促进药物的透过吸收。但是，比较含有相同剂量INS的CS溶液和CS纳米粒，发现后者降血糖作用更明显。由此他们提出，INS-CS纳米粒或许能够进一步加强INS与上皮细胞之间的吸附作用，甚至纳米粒可以直接透过鼻上皮细胞，进入整个体循环，并在其中充当INS的载体调控INS的释放。Vila等[44]针对他们所得到的类似结果提出了以下可能机制：CS-INS纳米粒紧密吸附于鼻腔黏膜上，一方面使上皮细胞附近粒子浓度大大提高，另一方面同时释放所耦联的INS药物。 3. 胰岛素透口腔粘膜纳米载药体系

与鼻腔给药途径类似，口腔粘膜血管丰富，药物从口腔粘膜吸收后，通过颈内静脉到达心脏随血液循环向全身分布，因此药物吸收迅速且不存在胃肠道及肝脏的首过作用，生物利用度高，此外口腔粘膜表面积大（还可借助咽部及食道的粘膜），耐受外界影响能力强，受到小面积的可逆性刺激或破坏后，可以很好地恢复。口腔给药方便，易用，易去掉，因此胰岛素经口腔粘膜给药制剂是容易被广大糖尿病人所接受的新型制剂。

早在1995年，作者所在的研究室就开展了猪胰岛素口腔喷剂的研究工作。经过大量的筛选试验，我们发现大豆卵磷脂是一种无毒、安全及有效的粘膜吸收促进剂，而一定量的有机溶剂丙二醇，可以进一步提高卵磷脂在水溶液中的溶解度。通过正交实验可以确定卵磷脂与丙二醇的最佳比例，得到胰岛素口腔喷剂的最佳处方，经正常大鼠及糖尿病模型家兔舌下粘膜给药后，生物利用度可以达到25%以上，并且有剂量效应[45]。猪胰岛素口腔喷雾剂的三期临床研究结果表明，其人体生物利用度达到16.7%，已通过国家医药食品管理局的审评。

通过共聚焦荧光显微镜，可以随时观察FITC-胰岛素透过口腔粘膜的情况，图6-8是共聚焦显微镜观察兔舌下粘膜的透射图像，图6-9为兔舌下粘膜的荧光图像。从图可见在有卵磷脂作吸收促进剂时，FITC-胰岛素可以迅速在粘膜附近聚集，沿粘膜形成一条荧光带（图6-9 b），有的FITC-胰岛素还跨过了粘膜层。但没有促进剂时，FITC-胰岛素在粘膜层附近

聚集得非常少(图6-9 a)。由此可见卵磷脂有

非常明地促进胰岛素透粘膜的作用。

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图6-8 共聚焦显微镜观察兔舌下粘膜的透射图像

图6-9 共聚焦显微镜观察兔舌下粘膜的荧光图像：（a）舌下给予FITC-胰岛素溶液

（9u/kg）；（b）舌下给予FITC-胰岛素-卵磷脂乳液（9u/kg）

在多肽蛋白质药物的纳米给药体系中，纳米微乳是一种常用的载药体系，它具有制备简单，性质稳定，便于透粘膜吸收等优点。大豆卵磷脂是一种无毒、安全及有效的促进剂，同时它也是微乳体系中的表面活性剂和油相，丙二醇是卵磷脂的助溶剂。微乳制剂的水相为 pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）。该pH值与口腔唾液的pH值接近，机体容易适应，同时胰岛素在该pH值时性质稳定，容易透粘膜吸收。

为研究体系的最佳组成，进行了相图研究。通过PBS滴定法，测定由卵磷脂、丙二醇及PBS组成的油水体系的电导率变化，找到突跃点，即为相变点。相图实验结果如图6-10

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所示，左右两边的黄色封闭区即为o/w型稳定乳液。另一方面通过卵磷脂与丙二醇的二因素三水平的动物体内正交实验，筛选得到胰岛素口腔喷剂的最佳处方。而该处方中卵磷脂、丙二醇及pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）三者的比例，正好落在相图的右黄色封闭区，表示该制剂形成了稳定的水包油微乳。我们还采用动态光散射激光粒度仪测定了该微乳中粒径的分布范围为20-260nm，平均粒径67.5nm，具体粒度分布见图6-11 所示。对该制剂进行固定和染色后，透射电镜的照片如图6-12 结果表明该微乳中粒子大小及分布均匀。

图6-10 卵磷脂、丙二醇及PBS组成的油水体系在25℃的相图。IES表示乳

液中含有胰岛素；ES表示没有胰岛素的乳液

图6-11 胰岛素口腔喷剂的粒度分布图

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图6-12 胰岛素口腔喷剂透射电子显微镜图片

为了研究乳液中胰岛素与卵磷脂相互作用的关系，用荧光物质-FITC-标记人胰岛素，并按处方制备了FITC-人胰岛素纳米微乳液，在全反射荧光显微镜下观察该乳液（光源为488nm激光），结果如图6-13所示，从图上可清楚看到在纳米粒的表面及内部均存在FITC-人胰岛素。

图6-13 FITC-重组人胰岛素纳米微乳液荧光显微镜图像

ESI-MS进一步证实了PCCS极性头与胰岛素可以形成较为稳定的非共价复合物如图6-15所示，PCCS是氯化磷脂酰胆碱钙盐，其结构示意图如图6-14所示。在图6-15中，A-a, B-a, C-a分别是带有不同电荷的胰岛素六聚体的峰，而A-b, B-b,

C-b则是相应的胰岛素六聚体与PC的复合物。

图6-14 氯化磷脂酰胆碱钙盐，其结构示意图(PCCS, MW: 257.7 Dalton)

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图6-15 胰岛素与PCCS相结合的ESI-MS 谱图：(I) 单一胰岛素，标记号为胰岛素单体所带电荷；(II)胰岛素与PCCS(胰岛素与PCCS得摩尔比=1:1000)，●:胰岛素的多电荷离子峰，○: PC，●○: 胰岛素六聚体-PC复合物的多电荷离子峰，●○○: 胰岛素六聚体-2PC复合物的多电荷离子峰, ●○○○: 胰岛素六聚体-3PC复合物的多电荷离子峰, PC的相对分子质量为182.2，胰岛素单体的相对分子质量为5807.6 Dalton

根据上述结果，我们推测了乳液中卵磷脂与胰岛素组成的可能微观结构如图6-16所示。当卵磷脂浓度达到临界胶束浓度时，形成图6-16 所示的一般胶束；随着卵磷脂浓度的增大，胶束增大为不规则胶束；接着可形成卵磷脂的单室囊泡；也可能形成多室囊泡。而胰岛素在乳液中可能以游离形式存在，也可能存在于卵磷脂形成的胶束或囊泡上，或存在于其内。

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图6-16 胰岛素-卵磷脂纳米微乳液的结构示意图

4. 胰岛素肺部给药纳米制剂

人的肺泡表面积很大有140 m2，血流量达5000 ml/min，蛋白酶活性相对于胃肠道较低，不存在肝脏首过效应。肺泡壁比毛细血管壁还要薄，通透性非常好。动物实验表明一些多肽药物经肺吸收给药后生物利用度相当高，可达20%~50%。研究多肽蛋白类药物的肺部喷雾吸入给药制剂具有良好的发展前景。

利用改进的水相乳化溶剂扩散法制备的INS-PLGA纳米球（400nm）经猪肺部喷雾给药获得了很好的效果。相比INS水溶液肺部喷雾给药，INS-PLGA纳米球降血糖作用更明显，而且降糖作用时间长达48小时，而前者仅为6个小时[46]。Zhang等[47]以乳化聚合法制备了平均粒径为254.7nm，包裹率达79.1%的INS-聚氰基丙烯酸丁酯（polybutylcyanoacrylate）纳米粒。经大鼠气管给药，5、10、20 IU/kg几个剂量组均获得显著的降血糖作用，并且分别在4、4和8个小时到达最低血糖水平，血糖浓度分别为起始水平的46.9%、30.4%和13.6%。血糖水平在初始值80%以下的持续时间也比同剂量INS溶液长得多。与相同制剂的肌肉注射相比，肺部给药的相对生物利用度为57.2%。但从安全性考虑，纳米粒子对肺有一定的刺激性。

5. 胰岛素口服给药纳米制剂

多肽蛋白类药物的口服制剂使用方便，也最容易被广大患者所接受。但是口服制剂对药物的包裹率低，且极易被胃肠道内的各种消化酶和酸性物质所降解，生物利用度一般低，因此研究多肽蛋白类药物的口服制剂已成为药学工作者的巨大挑战。

Damge等在1988年开始用氰基丙烯酸酯PACA纳米囊包裹胰岛素制成口服制剂。他们先后以正常的、糖尿病的大鼠和狗为研究对象，研究了INS纳米粒在胃肠道（gastrointestinal tract，GIT）内的主要吸收部位、体内分布以及药理药效等。通过在大鼠GIT不同部位的腔内给药，考察给药后血糖降低、药效强度和持久性这几个指标发现INS主要吸收部位在空肠和回肠[48]。这一结果也为后来制备不同pH敏感的INS纳米粒提供了思路。随后他们又以

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四氧嘧啶诱导的糖尿病狗和高糖喂食的正常狗为研究对象分别考察了INS纳米囊的药效。口服INS纳米囊后第二天，就可以在糖尿病狗中检测到尿糖、饭后血糖、高血糖素和促生长素抑制素等的降低，这种效应一直可以维持六天以上；正常的狗中，给药后三天血糖降低65%，第九天达到72%，第15天为48%，一直到第21天血糖才恢复到了正常水平。除此之外，他们还以IBCA为单体，利用界面聚合反应制备INS-PIBCA纳米球，分别将其分散到含表面活性剂poloxamer 188和脱氧胆酸的油相介质和水相介质中，糖尿病大鼠口服给药。在油相分散介质组中，降血糖作用从给药后第二天一直持续到第10-13天，而水相介质组中，仅为两天甚至更短。可见，INS-PIBCA纳米粒分散介质的选择对于其药效的维持也是至关重要的[49]。

Barichello[50]等通过纳米沉淀法制备了包裹胰岛素的PLGA纳米粒，口服给药后观察到该制剂对动物的降血糖作用是有效的。

Pan[51] 等用三聚磷酸阴离子引发生物粘接性多糖-壳聚糖（CS）形成包裹胰岛素的壳聚糖纳米粒（CS-NPs），CS-NPs的粒径分布范围为250-400nm，多分散指数小于0.1，粒子带正电荷，非常稳定，胰岛素包裹率为80%，体外释药研究表明CS-NPs有一个对pH敏感的非常大的起始爆释效应。给四氧嘧啶诱发的糖尿病大鼠口服20U/kg胰岛素CS-NPs，降血糖作用可持续15h，与皮下注射胰岛素相比，其相对生物利用度达14.9%。

壳聚糖（CS）不仅有非常好的粘膜粘结性，而且它对多肽蛋白质的吸收有促进作用，早已有文献报道壳聚糖（CS）可作为胰岛素鼻粘膜吸收的促进剂。因此很多人用CS或Carbopol等粘膜粘结剂（mucoadhesion）来修饰脂质体和聚合物纳米粒的表面，这样不仅可以延长它们在吸收部位的停留时间，还可以提高药物的吸收利用度。已经用共聚焦扫描电镜观察到表面覆盖CS的脂质体可以插入到粘膜单层中。应用流化床技术可以使脂质体或聚合物纳米粒表面覆盖各种粘膜粘结性聚合物。如DPPC脂质体表面带负电荷，其表面可以覆盖CS、PVA及带有胆固醇的聚丙烯酸等。但表面带正电荷的带SA（硬酯基胺）的CCP脂质体表面可以覆盖Carbopol，PLGA纳米粒也可用类似方法在其表面覆盖CS等[12]。

动物实验表明，与未修饰的相比，被粘膜粘结剂修饰的脂质体和聚合物纳米粒的药效作用时间都大大延长，提高了药物的疗效。无论是口服胰岛素脂质体（或其PLGA纳米粒）还是降钙素脂质体（或其PLGA纳米粒），都有类似实验结果。肺部吸入胰岛素或降钙素的PLGA纳米粒的结果也类似。这些结果说明，被CS等表面修饰的脂质体或纳米粒可以深入渗透进入粘膜层，同时可以长时间地粘结在粘膜组织上，而且多肽药物直接释放到粘膜中，受到酶的破坏程度小，因此药物作用时间大大延长。Takeuchi等对这方面的研究

33

工作做了较详细的综述[12]。

6.7.2 环胞腺素A纳米载药系统

临床上，环胞腺素A（Cyclosporin A，CyA）主要用于器官移植所导致的异体排斥反应以及选择性自身免疫疾病的治疗。常规的口服制剂不仅表现出吸收差（口服剂量高达10mg·kg-1·d-1）[52, 53] 、生物利用度低，而且还表现出吸收不稳定，药物的药代动力学波动大，给药剂量和体内血药浓度之间的关系难以确定等缺点[54]。另一方面，它所表现出的不可逆的肾毒性也大大限制了它的广泛应用。目前已经商业化的微乳制剂Sandimmun Neoral（简称Neoral）虽改善了吸收，但仍具有严重的肾毒性；且增溶剂Cremophor RH40的用量为CyA的3.8倍，有可能引起变态反应[53]。

研究表明，CyA生物利用度低是因为大量的CyA在肠壁上被代谢掉了。微乳制剂对CyA吸收的改善被认为是由于微乳保护了CyA免受降解的缘故。因此保护CyA不在胃肠道降解是改善口服制剂的首要参数。另外，由于CyA的免疫抑制活性与它选择性作用于T淋巴细胞相关，CyA主要在淋巴系统中循环。所以建议CyA的淋巴管靶向性是制剂制备中需要考虑的第二个参数。因此进一步应用各种纳米载药系统包裹多肽，提高其生物利用度、靶向性、降低肾毒性都是非常有意义的。

环胞腺素A是含有11个氨基酸的环状多肽，相对分子质量为1203Da，与大多数多肽相比，它有相当好的亲脂性。它在水中不溶，但溶于醇类有机溶剂。这些理化性质有利于制备CyA纳米粒。

1992年Bonduelle[55]等制备了CyA聚氰基丙烯酸异己酯（PIHCA）纳米囊，采用的是界面聚合物法。为了减缓聚合反应的速度，单体中加入了SO2。该纳米囊对CyA的包封率达88%，这是由于CyA不溶于水的原因。后来他们又采用类似方法合成了CyA的（PIHCA）纳米球，包封率为84%，但由于CyA是吸附在纳米球上的缘故，因此体外释药表明该纳米球有非常大的爆释效应。纳米囊经NMRI小鼠口服给药后，CyA纳米囊的血药AUC比市售口服微乳液（作对照组）要高一些，而CyA纳米囊在肾脏中的浓度比乳液低，表明CyA纳米囊肾毒性减小。

黎洪珊等[53] 以溶媒-非溶媒法制备了CyA聚乳酸纳米球胶体（58.8nm）和纳米囊胶体（81.7nm）。经大鼠灌胃给药后，其绝对生物利用度分别为78.67%和70.24%；与市售CyA的微乳液Neoral相比，其相对生物利用度分别为112.39%和100.35%；二种纳米制剂血药峰浓度较小，分布和消除较慢，显示CyA聚乳酸纳米球和纳米囊口服吸收好，生物利用度

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高，且改变了药物的体内分布和消除特征。通过CyA的载药动力学研究发现，约有60%的CyA以吸附形式存在于纳米粒表面，而这些位于表面的CyA可能发挥着保护纳米粒在吸收之前免于降解的作用。

Molpeceres[56]等制备了CyA聚己内酯纳米球，采用的是纳米沉淀技术。具体方法是：聚合物与CyA溶在丙酮中，然后该有机相通过针头注入含有Poloxmamer 188的水溶液中立即形成纳米球胶体溶液。该纳米球对CyA的包封率最高可达98%。动物实验表明口服CyA聚己内酯纳米球的生物利用度与市售CyA的微乳液相比有了显著提高。

Varela等[57]通过体内体外两类试验综合评价了CyA-聚己内酯纳米粒（CyA-NP）的肾毒性和免疫抑制作用。连续给大鼠灌胃3天后，收集血、尿、肝、脾、肾样，测定其中的CyA浓度、肌酸酐血浆水平、肾小球中H2O2含量等。虽然经同等剂量CyA-NP处理的大鼠血液、尿液和各组织中CyA水平较高，几乎为未包裹CyA给药组（对照组）的两倍，但是二者肌酸酐血浆水平和H2O2含量却无显著性差异。另一方面，分离培养经药物处理的大鼠淋巴细胞，考察其增殖情况发现，两种制剂表现出一致的免疫抑制活性。这说明尽管CyA-NP的血药浓度要高得多，但是这些CyA并未完全发挥出其药效和毒性的作用，或许是由于聚合物纳米粒的包裹一定程度上限制了药物的作用。具体的作用机理还有待进一步探讨。CyA体外直接刺激健康大鼠中分离得到的淋巴细胞发现，当CyA浓度大于25μmol/L时，纳米粒明显促进CyA进入淋巴细胞。

最近用纳米沉淀技术制备了CyA的非生物降解性聚合物EudragitR RS或RL的纳米粒，这些纳米粒的粒径范围为170-310nm，包裹率达到70-80%。与市售口服Neoral胶囊相比，CyA纳米粒的家兔口服给药的相对生物利用度为20-35%，大大低于Neoral胶囊，由此可见，用聚合物包裹CyA制备得到的纳米粒并不是总比微乳液好[58]。因此人们又制备了一些不用聚合物的纳米给药体系，如CyA脂质体纳米粒，CyA卵磷脂胶束纳米粒等，它们均可以注射给药，也可以口服给药，但这些制剂通常不太稳定，而且与市售CyA制剂相比，生物利用度较低。

例如Zhang等[59] 以硬脂酸为载体，通过熔融-匀浆法制备了CyA-硬脂酸纳米粒。该纳米粒粒径较大为316.6nm，包封率为88.36%。以Neoral为对照组，大鼠灌胃给药，结果表明，CyA-硬脂酸纳米粒相对生物利用度约为80%，给药后4小时血药浓度达最大，滞后于Neoral的出峰时间（1.7小时）。这说明该纳米粒可以持续释放，达到缓释效果，但生物利用度较市售Neoral低。

有研究认为粘膜表面与药物的静电作用增强，可以大大提高药物经粘膜吸收的相对生

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物利用度。胃肠道粘膜的表面通常带负电荷，因此易与表面带正电荷的给药系统相互作用。EI-Shabouri[60]等用壳聚糖盐酸盐（CS-HCl）、白明胶-A使CyA卵磷脂纳米粒表面带上正电荷，而胆酸钠（SGC）使CyA卵磷脂纳米粒表面带上负电荷，这三种纳米粒的粒径为104-148nm，Zeta电位分别为+31.2mV、+23.1mV及-41.6mV，经Beagle狗口服给药，与市售CyA的微乳液Neoral相比，CS-HCl纳米粒的相对生物利用度增加了大约73%，白明胶-A纳米粒增加了18%，而SGC纳米粒减小约36%，EI-Shabouri的实验结果较好地证实了上述静电作用的设想，为开发新型的CyA纳米制剂提供了新的思路。

Calvo[61]等制备了一种有趣的CyA纳米囊，CyA溶于油性内核（含mygliolR）,而其外壳为聚己内酯，该纳米囊可通过眼角膜给药，CyA吸收良好。另外，还有人试图开发CyA纳米脂质体（SLN）十二指肠给药剂型[62]。 6.7.3 降钙素纳米载药系统

降钙素（Calcitonin, CT）是由32个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为3600，不同物种来源的CT其序列有较大的改变。CT溶于水（1：5）和甲醇（1：10），几乎不溶于丙酮、乙醇和氯仿。它是调节体内骨钙代谢的重要激素。因其能抑制骨吸收，稳定血清钙浓度，临床上主要用于治疗骨质疏松、Paget’s症（osteitis deformans）以及高血钙症。另外由于其对中枢神经系统有一定的抑制作用，近年来还应用于各种骨病引起的骨痛，糖尿病周围神经病变引起的肢痛，癌性疼痛。肾脏和肝脏是CT代谢的主要器官。CT的半衰期很短，注射的CT约10分钟即可从血浆中消失，但有意义的是CT从靶器官和组织（如骨骼）中消失的速率比血浆要慢得多，不同种属CT的半衰期不同，其中鲑鱼降钙素（salmon calcitonin, sCT）作用时间最长，故被广泛应用于临床。

由于sCT的高亲水性，Vranckx [63]等制备了一种含有水性内核的PBCA纳米囊。他们首先把sCT溶解在含有5%月桂基磺酸钠的乙酸缓冲溶液中。1mL这样的水溶液缓慢地滴加到剧烈搅拌的含有司盘80(15%m/m)的MygliolR中。15min后，加入100μL氰基丙烯酸丁酯（BCA）和200μL乙醇，聚合反应持续4h，得到200-300nm纳米囊。在水相中加入大量的BrijR 35时，可以得到粒径为50nm纳米囊。最后的产物是分散在MygliolR中的纳米囊，直接用于口服给药。大的纳米囊对sCT的包裹率为50%，而小的纳米囊为30%。而且该纳米囊在4℃放置一年，化学稳定性保持94%以上。Vranckx等制备的sCT纳米囊，经Wistar大鼠灌胃后，绝对生物利用度高达40%，降血钙活性是同剂量静脉注射活性的45%。

Sakurma[64]等通过自由基聚合反应得到了表面修饰有亲水性聚合物侧链的纳米粒。表面带有聚-N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）亲水性侧链的纳米粒是由苯乙烯及末端带有苯

36

乙烯基的亲水性大分子单体共聚而成的，当大鼠口服PNIPAAm纳米粒与降钙素的混合液后，与相同剂量的降钙素溶液进行对照，发现前者的降血钙作用明显强于后者，维持药效4小时。如果改变纳米粒大小以及大分子的相对分子质量对药效无改善。但是，当把单次口服方式改为平均分两次给药，前后相差40分钟，发现血钙浓度降低面积是前者的大约三倍左右；而两次用药间隔改为120分钟时则血钙AUC无明显改进。据此推测可能是PNIPAAm纳米粒对胃黏膜的黏膜吸附作用增强的原因。在此基础上，Sakuma等[65]利用自由基共聚合反应，将阳离子型聚乙烯基氨基（PVAm）基团引入到PNIPAAm纳米粒表面，从而获得了具有两种表面亲水聚合物侧链的纳米粒。由于PVAm不仅可以提高PNIPAAm纳米粒的包封率，而且还可以克服它易被胰蛋白酶降解的缺点，所以sCT-PNIPAAm-PVAm纳米粒表现出更强的降血钙作用。而相反如果在PNIPAAm纳米粒表面引入非离子基团聚乙烯乙酸酰胺（PNVA）侧链后，其促进sCT吸收作用可完全消失，这可能是PNVA掩盖住PNIPAAm基团的缘故。由此可见，纳米粒促进sCT吸收的性能与纳米粒表面的化学结构密切相关。提示可通过改变纳米粒表面的化学结构获得性能优异的多肽蛋白质药物载体材料。

近年来，由于固体脂质纳米粒具有稳定蛋白质、促进蛋白质经粘膜吸收的特点而越来越受到关注。特别是在脂质纳米粒表面覆盖上一层亲水性的聚合物如壳聚糖（CS）或聚乙二醇（PEG）后，可进一步促进药物的透粘膜吸收，其可能的机理是亲水性聚合物使纳米粒在粘膜中的稳定性提高，或纳米粒与粘膜的相互作用增强。

用复乳法可制得sCT-棕榈酸甘油三酯纳米粒[66]，然后把该纳米粒与CS溶液温浴一段时间后，即可得CS覆盖表面的sCT-脂质体纳米粒。sCT与脂质纳米粒结合性能良好，而与CS结合能力差，因此sCT在CS-脂质纳米粒表面吸附大大减少，这样就减少了爆释效应，而后续释药过程连续缓慢，而PEG-覆盖表面的脂质纳米粒有较明显的爆释现象，这几种脂质体纳米粒的电子显微镜图如图6-17所示。Alonso[67]等的动物实验结果表明，与口服sCT溶液相比，sCT-CS-脂质纳米粒口服后使动物血钙显著下降，并可以维持较长时间，而sCT-PEG-脂质纳米粒的降血钙作用与对照组无显著性差异（如图6-18所示），由此可见体内实验结果与体外实验结果取得了一致性，纳米粒表面的化学结构对纳米粒的释药特性有重要影响。

37

图6-17 表面修饰的sCT-棕榈酸甘油三酯纳米粒透射电镜图：PEG表面修饰（左），

PEG表面修饰的棕榈酸甘油三酯/MiglcolR纳米粒(中)，CS表面修饰(右) [66]

图6-18 降钙素制剂经小鼠口服口服给药后血钙随时间的变化[67]

6.7.4

Dalargin，DAL

DAL是一个亮氨酸-脑啡肽类似物（Tyr-DAla-Gly-Phe-Leu-Arg），它的第二位上含有一个D型-缬氨酸，具有一定的抗酶解作用，因此它在血液中表现出较好的稳定性。它主要用于中枢系统的麻醉镇痛，但是由于其难以通过血脑屏障，导致整体给药时几乎失去作用。因此，如何促进DAL透过血脑屏障，使其具有一定的靶向性是提高DAL药物疗效的关键。

Schroeder等制备了表面修饰有吐温80的DAL-PBC（poly(butylcyanoacrylate)）纳米粒，并对它们的吸收和体内分布进行了系统地研究。将DAL-PBCA纳米粒给小鼠静脉注射给药，通过小鼠的热板实验（hot plate）考察其中枢麻醉效果，结果表明，与游离的DAL相比，DAL-PBCA纳米粒中枢麻醉效果明显，并且表现出时间、剂量依赖性关系[68-71]。DAL-PBCA对血脑屏障的通透性大大提高。特别是用吐温80对DAL-PBCA纳米粒进行表面修饰后，可进一步提高了纳米粒的透过性。其原因可能是吐温80引起纳米粒表面性质发生特异

38

性改变，而发生改变的纳米粒表面可以从血液中吸收某些物质，反过来诱导内皮细胞从血液中对药物进行内吞吸收[72]。

在此基础上，Schroeder[68-70]等将吐温85加入到DAL-PBCA纳米粒中以提高纳米粒的稳定性，无论是静脉注射，还是口服都获得很好的疗效。甚至未经吐温80表面修饰的纳米粒的也有同样效果。但是吐温85的毒性问题成为该制剂实用化的巨大障碍[72]。为了进一步探讨DAL-PBCA纳米粒的靶向作用，用3H标记DAL，小鼠静脉注射，检测血、肝、肺、心、脾、肾、脑等组织中3H DAL的放射活性。与游离的DAL和未经吐温80表面修饰的纳米粒相比，表面修饰的纳米粒更稳定，聚合物纳米粒的包裹作用使DAL对酶代谢等其它降解破坏作用有更好的抵抗能力，纳米粒使DAL被运输并富集于脑部，在脑部的放射活性是前者的3倍。有意思的是，三者放射水平差异性最大的是在脑的P2部分，其主要代表脑中的突触体，为DAL引起麻醉的公认靶位置。而且表面修饰的纳米粒在脑中的消除也较其它二者慢，药效发挥更久。由此可见DAL纳米粒显示出良好的靶向性和缓释作用。比较纳米粒包裹的DAL和游离的DAL在血液中和肝脏中的放射活性变化，发现纳米粒的包裹作用还可以降低肝脏对药物的首过效应[73]。

Olivier等[74]通过体外共同培养牛脑毛细血管内皮细胞和大鼠星型胶质细胞模拟血脑屏障，来观察纳米粒DAL和游离DAL的透过特性，得到类似的结论。但是同时他们指出表面经吐温80修饰的DAL-PBCA纳米粒，其非特异性透过血脑屏障的能力与载体的毒性相关，这一点还有待进一步的研究与改进。 6.7.5 胞壁酰二肽及其亲脂衍生物

目前，巨噬细胞激活剂的免疫治疗已经被建议作为治疗转移瘤的一种常规疗法。其中胞壁酰二肽（Muramyldipeptide，MDP）的体外研究效果显著，但是由于它的亲水性强，在体内很快被清除，因此通常动物体内给药后就失去了抗肿瘤转移的能力。针对这一问题，人们采取了合成其亲脂衍生物如胞壁酰三肽-胆固醇（MDP-L-alanyl-cholesterol 即Muramyltripeptide-cholesterol，MTP-chol）以及利用载体保护的手段试图加以解决与改善。其中胶体载体由于具有广泛的巨噬细胞吞噬特点，因此很快就引起了人们的关注[47]。

Yu等[75]制备了包裹有MDP亲脂性衍生物(MTP-chol)的PIBCA纳米囊和脂质体，经小鼠静脉注射给药后，与对照组相比，它能明显抑制组织细胞肉瘤M5076诱导的肝集落增殖，而且接种前给药效果更明显。口服给药也得到了类似的结果。Morin等[76]制备了MTP-chol聚交酯纳米囊，通过体外实验考察了它的免疫调节特性。与游离型的MTP-chol相比，MTP-chol聚交酯纳米囊更有效地激活了大鼠尘细胞（alveolar macrophages）对同源肿瘤细

39

胞的抑制作用。

6.7.6 模拟肽（Peptidomimetics）

模拟肽是用来模拟多肽原始结构的一种多肽衍生物，但是在模拟肽中肽键(酰胺键)被非水解键所取代[77]，从而很大程度上解决了多肽的稳定性问题。最近FDA通过的几种人类免疫缺陷病毒I型（HIV-I）蛋白酶抑制剂，代表HIV疾病治疗中的一个重大突破[78]。短期临床实验已经证明其是有效的。它通过对HIV蛋白酶的抑制作用，来产生未成熟的非感染性病毒体从而抑制（HIV-I）病毒的复制。迄今为止，已经报道的有效抑制剂通常是寡聚多肽的衍生物，其结构中含有非水解性的共价键，该共价键是模拟多肽中的酰胺键被HIV-I蛋白酶抑制剂断裂时的四面体过渡态基序结构单元来设计的。虽然其中几种化合物体外给药效果很好，但在实际应用中，它们的口服生物利用度低，而且快速被胆汁排泄[79]。口服生物利用度较低往往归咎于其差的水溶性和相对高的分子质量。而提高水溶性的同时往往又会导致抑制剂的抗病毒活性降低。虽然已合成出既有一定水溶性，又有较强抗病毒活性的模拟肽，但是高亲脂性药物的口服给药依旧具有很大挑战性。

大量研究表明纳米技术在亲脂性药物口服制剂的研究中具有很大的发展潜力。以PBCA为载体制备的细胞生长抑制剂avarol纳米粒生物利用度是常规药物的8~9倍。研究表明，药物生物利用度的提高是因为纳米粒大大延长了药物与肠壁的接触时间，而不是因为纳米粒穿过肠黏膜的透过性增加。目前，一种新的多肽衍生的HIV-I蛋白酶抑制剂，CGP57813（Mw=758.96）已被合成出来，它在MT-2细胞中，抗HIV-I的IC90为0.1μM。与它的几个同系物一样，CGP57813表现出高度亲脂性。通过对它的理化性质进行研究发现，这一抑制剂适合包裹于PLA中。在最初的实验中，由于制备方法的处理不当以及药物暴露于GI黏膜的不充分，导致结果很不理想。Leroux[80-81] 等基于HIV-I蛋白酶抑制剂可以与胃里的某些酶结合，而粒子在胃中的不溶解性这一特性，制备了pH敏感的抑制剂纳米粒。他们选择了Eudragit?L100-55和Eudragit?S100两种聚合物作为载体。理论上来说，这两种聚合物分别可在GIT的上部与下部溶解。将含有10%（m/m）CGP57813的两种纳米粒分别给小鼠口服入药，8个小时左右，Eudragit?L100-55纳米粒组中CGP57813血浓度即达到体外IC90的10-100倍。这可能是主要是因为纳米化导致1）药物表面积的增大；2）粒子相对快的溶解；3）药物在聚合物基质中高分散性。相比前者，Eudragit?S100纳米粒的血浓度在给药后2.5小时即开始迅速降低，这可能说明该粒子在吸收部位没有充分溶解。在此基础上，他们进一步以狗为研究对象，考察了食物对这两种纳米粒药代动力学的影响。结果表明，禁食时，Eudragit?L100-55纳米粒组，血浓度IC90虽然仍获得了约为

40

1μmol/L的结果，但是仍低于预期结果，Eudragit?S100纳米粒组，血液中CGP57813几乎检测不到（<0.1μmol/L）。未禁食时，食物的存在并没有明显改变Eudragit?S100纳米粒组中药物的生物利用度，但是提高了Eudragit?S100纳米粒组中药物曲线下面积（AUC）。这一现象可以解释为，食物的存在可能可以通过增大小肠体积，减慢GI的运输和刺激GI的分泌，使得Eudragit?S100纳米粒易溶解，从而提高了药物的释放。最近类似的结果也从另一种HIV-I蛋白酶抑制剂（水溶性比CGP57813低70倍）获得。由此可见，这一抑制剂的吸收表现出一定的区域性，欲获得药物很好的吸收，需要保证药物在GIT的远端不溶解。

6.7.7 疫苗（Vaccine）

多肽疫苗具有安全性好，容易获得，纯度高等优点，但是也存在半衰期短，免疫原性较弱等缺点。许多试验结果证明：聚合物纳米粒能够使蛋白抗原的表面充分暴露，同时，能使抗原结构更趋稳定，引起体内强烈、特异的免疫反应，而常规的佐剂仅能勉强成功地引起免疫反应。目前，这一技术已经被应用于肝炎疫苗、流感疫苗、破伤风毒素疫苗以及HIV疫苗的制备，并且已经取得很好的效果。

Jung等[82]等制备了一种新型的破伤风毒素疫苗（SB（43）-PVAL-VG –PLGA）纳米粒，并将其与普通的疫苗溶液分别通过口服（p.o）、鼻腔吸收（i.n）和腹腔注射（i.p，做对照组）三种给药途径对6个星期大的雌性Bal b/c小鼠进行破伤风毒素免疫。给药后4~6个星期收集血样，根据ELISA反应确定血清IgG和IgA效价。将所得结果进行比较发现，无论是口服给药，还是鼻腔给药，血清IgG和IgA效价与注射组相比，均有很大程度地提高，IgG为3×103，IgA为2×103。其中，鼻腔给药可立即产生抗体反应，而口服给药抗体效价大小受粒径大小的影响很大，粒径>1μm的不产生任何免疫效应，最小粒径纳米粒（100nm）诱导产生最大的抗体效价。并且Raghuvanshi等[83]还试图开发破伤风毒素的单步控释疫苗剂型。他们将两种不同聚合物制成的免疫反应破伤风毒素疫苗单次注射大鼠，可引起大鼠持续5个月以上的抗体效价，高于破伤风毒素疫苗的生理盐水溶液。这与体外可持续4个月以上释放抗原的结果基本一致。为了进一步增加纳米粒的稳定性或提高它们的黏膜透过性，对其进行适当的表面修饰是常采取的手段之一。其中PEG常被用来增加疏水性纳米粒如PLGA和PLA等在体液中的稳定性，而CS则经常被用做加强粒子的黏膜吸附和透过吸收的修饰。Vila等[84]制备了PEG修饰的PLA和CS修饰的PLGA破伤风毒素疫苗纳米粒。体外实验结果表明二者均可以提高包裹蛋白质的稳定性，保护粒子免受酶介导

41

的聚集行为的发生。进一步用

125

I标记破伤风毒素疫苗，经BALB/c小鼠口服或鼻腔给

药，分析全血、淋巴结和其它相关组织的放射活性发现，给药后1小时，PEG修饰的PLA纳米粒给药组血液中的放射活性分别是PLA纳米粒给药组的10倍（鼻腔给药）和5倍（口服给药），而且在至少24小时内保持相当恒定。同样，淋巴结的放射活性也明显要高于未修饰的。经CS修饰的纳米粒不仅加强了粒子与粘膜之间的相互作用，促进药物的吸收，而且大大提高了PLGA纳米粒的包封率。同时体外Caco－2细胞的实验结果也支持以上结论。

亚单位疫苗通常需要佐剂来发挥它的免疫反应，但佐剂可能改变关键抗原决定簇的构象，降低抗原有效性。为此，Frey等[85]尝试着将抗原与Al2O3纳米粒共价结合。这个由peptomers（头尾相连的肽均聚物，head-to-tail-linked peptide homopolymers）组成的试验抗原源于HIV-I gp120的第4位保守区域（C4），这一区域被认为在结合CD4之前处于α-螺旋构象。用含有或不含有MDP佐剂的peptomers-纳米粒偶联物、游离的C4肽和C4-peptomers分别对小鼠进行免疫，其中无MDP佐剂的peptomers-纳米粒偶联物诱导最高peptomers特异性血清抗体反应，同时表现出对重组的糖基化gp120和HIV-I感染的T细胞最高的反应性。结果表明这一新型的疫苗手段无需添加佐剂，对构象敏感的病毒抗原免疫反应的诱导是成功的。 6.7.8 干扰素

干扰素（IFN）于1957年被英国伦敦国立医学研究所的Alick Isaacs 和 Jean Lindeman发现，IFN是组织细胞对病毒感染、或生物诱导以及各种合成作用反应、分泌的一类高活性、多功能蛋白质。按照分子结构、抗原性和来源的不同，可以分为?、?、? 等不同型别，其中病毒诱导由白细胞产生的INF为?，由纤维母细胞产生的INF为?, 有淋巴细胞产生的INF为?。同一型别又根据其氨基酸序列的差异分为多个亚型。例如IFN?-2b、IFN?-2a等。干扰素也可通过大肠杆菌、酵母菌等基因工程重组而得。这些也常命名为?，其纯度均较高，如?IFN?-2b，?IFN?-2a等重组INF经常用于临床。

INF具有抗病毒、抗增殖、诱导分化免疫活性细胞以及免疫调控等多种生物活性，被广泛应用于病毒性感染、恶性肿瘤和免疫性治疗。随着IFN临床使用的增加，其不良反应的发生率也有所增多，其不良反应可涉及免疫系统、血液系统、神经系统、泌尿系统等多个系统。特别是需要用到大剂量、反复注射时其毒副作用更大，因此药剂学家们开始用生物可降解聚合物如PLGA等来包埋INF，以期可以获得能在体内长期缓释给药的微球或纳米粒[86]。

42

但是INF性质活泼，在纳米粒或微球的制备过程中，以及在释药过程中都非常容易变性失活，因此制得的纳米粒通常还不太理想。通过选用恰当的制剂方法，或加入特殊的稳定剂如Poloxamer可在一定程度上提高IFN的稳定性，Sanchez[87].等用无水技术（oil-in-oil solvent extraction）制备了PLGA与Poloxamer的共混微球，使INF-?的稳定性有所提高，但是与预期效果还是相差较远。

当然还可以通过PEG修饰INF-?，提高其稳定性和延长半衰期。 6.7.9 其它

促黄体生成激素释放激素（Luteinizing hormone releasing hormone，LHRH） LHRH为10个氨基酸组成的小分子多肽。分子结构为：焦谷1－组2－色3－丝4－酪5－甘6－亮7－精8－脯9－甘

10

－NH2。当外源性LHRH或其类似物以生理脉冲频率（每90min一次）短

期、小剂量给药时，对垂体性腺系统起促进作用，临床用于性功能低下、不排卵、青春期延缓等疾病的治疗；而以非生理脉冲频率长期、大剂量给药时，可抑制垂体分泌黄体、生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）,导致性腺分泌激素能力下降，性器官萎缩，临床用于治疗一些激素依赖性疾病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位及青春期性早熟等。目前主要的给药方式是静脉滴注和鼻腔喷雾。此外LHRH的缓释微球制剂已获得成功，2001年该制剂的全球销售额超过8亿美元。也有人开展了LHRH口服制剂的研究，他们将LHRH制成LHRH纳米粒后，给Wistar雄性大鼠灌服14天，结果发现LHRH纳米粒组的大鼠精囊和前列腺的重量仅为LHRH对照组的50%，表明纳米粒载体使LHRH口服作用增强[88]。

肿瘤坏死因子α（TNF-α）具有显著的抗肿瘤生物活性。为延长其半衰期，提高疗效和安全性，Li[89]等采用PEG-PHDCA（poly(methoxypolyethyleneglycol cyanoacrylate-co-n-hexadecyl cyanoacrylate)）为载体材料制备了包载rHuTNF-α （recombinant human tumor necrosis factor-α）的纳米粒，粒径150nm，包封率58.4%。在植有S180实体瘤小鼠体内，以游离型TNF-α和载有rHuTNF-α的PHDCA纳米粒为对照，对其抗肿瘤活性进行评价。结果发现，相同剂量时PEG-PHDCA纳米粒的抑瘤率高达78.3%，作用明显强于游离型TNF-α和rHuTNF-α的PHDCA纳米粒（二者抑瘤率分别为15.4%和33.9%），而且动物容易耐受，未出现明显体重减轻。该结果可能与rHuTNF-α体内过程的改变有关。由于PEG的空间位阻效应，肿瘤血管通透性增加等因素，PEG-PHDCA纳米粒可明显延长rHuTNF-α的半衰期（t1/2=7.42h），增加rHuTNF-α在肿瘤组织的分布，从而使TNF-α的抗肿瘤活性显著提高。

43

除此之外，关于G-CSF、L-Asparaginase、蛋白质C（protein C）以及血红蛋白等多肽、蛋白质类药物纳米粒载药系统的研究也正在进行。 6.7 结束语

上述研究结果表明，纳米粒作为运输多肽、蛋白质类药物的载体具有巨大的发展前景，该项技术不仅可以提高多肽蛋白药物的稳定性，还可以达到注射缓释给药、直接口服给药、靶向给药（通过血脑屏障等）、提高各种给药途径的生物利用度等目的。

纳米粒的制备方法多种多样，方法的选择以及工艺的确定需要从以下几个方面来考虑：1）提高收率；2）解决纳米粒制备过程中多肽的稳定性；3）提高载药量；4）降低起始爆释率，获得药物连续释放。而其中如何最大程度地减少制备过程中对多肽构象和活性的破坏又是其核心问题，目前研究者们除了通过控制反应pH、温度和超声时间等方式，还试图通过添加某些赋形剂等对此进行改善。在探讨如何降低粒子起始爆释率的研究中，充分了解药物与载体之间相互作用及其作用方式也是很有必要的，对于后者的了解可以反过来推测药物可能的体外、体内释放过程以及指导制备方法的改进。另外，药物的用药个体化也是纳米粒制备中需要考虑的一个因素。

尽管纳米粒的体内吸收机制和RES系统吞噬纳米粒的机制还不完全清楚，纳米粒的粒径及电荷是如何影响载药体系的ADME的，这既是各类纳米药物有待研究的共性问题，也是今后多肽蛋白类药物纳米载药系统值得深入研究的问题。此外一些纳米制剂的药效或生物利用度等与人们预期的还相差较远，但随着医药工业的发展，新材料、新方法的不断涌现，多肽蛋白类药物的纳米载药系统将会不断完善，为人类造福的新制剂将会越来越多。

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