甲醇降解微生物的筛选与培养 - 图文

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BACHELOR DISSERTATION

论文题目： 甲醇降解微生物的筛选与培养 学位类别： 工学学士 学科专业： 生物工程 作者姓名： 作者学号： 导师姓名： 完成时间：

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目录

目录 ................................................................................................................................... I 摘要 ................................................................................................................................ III Abstract ........................................................................................................................... IV 1引言 ............................................................................................................................... 1

1.1甲醇及甲醇降解微生物的简介 ......................................................................... 1

1.1.1甲醇的简介 ............................................................................................... 1 1.1.2甲醇降解微生物的简介 ........................................................................... 1 1.2甲醇降解微生物的研究进展 ............................................................................. 2 1.3甲醇降解微生物的筛选原理 ............................................................................. 2 1.4甲醇及甲醇降解微生物的应用 ......................................................................... 3

1.4.1甲醇的应用 ............................................................................................... 3 1.4.2甲醇降解微生物在处理甲醇废水中的应用 ........................................... 3 1.5甲醇及甲醇降解微生物的研究方向及问题 ..................................................... 4

1.5.1甲醇的研究方向及问题 ........................................................................... 4 1.5.2甲醇降解微生物的研究方向及问题 ....................................................... 4

2材料与方法 ................................................................................................................... 5

2.1实验仪器 ............................................................................................................. 5 2.2实验材料与试剂 ................................................................................................. 5

2.2.1菌种 ........................................................................................................... 5 2.2.2基础试剂 ................................................................................................... 5 2.2.3培养基 ....................................................................................................... 6 2.3实验方法 ............................................................................................................. 7

2.3.1观察菌种菌落的形态特征 ....................................................................... 7 2.3.2不同碳源下培养 ....................................................................................... 8 2.3.3不同氮源下培养 ....................................................................................... 8

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2.3.4不同培养转速下培养 ............................................................................... 8 2.3.5不同培养温度下培养 ............................................................................... 9 2.3.6不同培养pH下培养 ................................................................................ 9 2.3.7 不同培养时间下培养 .............................................................................. 9 2.3.8不同甲醇浓度条件下培养 ..................................................................... 10

3结果与分析 .................................................................................................................. 11

3.1菌落的形态特征 ................................................................................................ 11 3.2菌种在不同碳源、氮源的液态培养基中的生长情况 .................................... 11 3.3培养条件对甲醇降解菌生长的影响 ............................................................... 12

3.3.1转速对甲醇降解菌生长的影响 ............................................................. 12 3.3.2温度对甲醇降解菌生长的影响 ............................................................. 13 3.3.3pH对甲醇降解菌生长的影响 ................................................................ 13 3.3.4培养时间对甲醇降解菌生长的影响 ..................................................... 13 3.3.5甲醇含量对菌株生长的影响 ................................................................. 14

4结论 ............................................................................................................................. 15 参考文献 ........................................................................................................................ 16 致谢 ................................................................................................................................ 18

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摘要

随着工业发展的需要，甲醇被广泛地使用，使得甲醇对环境造成的污染越来越严重。为了更好地治理甲醇废水的污染,实验以甲醇作为惟一碳源,利用富集培养的方法从土壤中分离到一株甲醇降解菌,经对其形态特征观察鉴定该菌株革兰氏染色呈阴性,短杆状。通过进一步分析环境因素对菌株生长的影响,确定了甲醇降解菌的最佳培养条件为pH值7.5,温度28℃,转速160 r/min ,甲醇含量为1%，培养时间为5d。探索出甲醇降解菌的最适生长条件，可以为固定化微生物技术等现代生物技术处理甲醇废水提供有效的基础。

关键词:甲醇降解菌；筛选；生长条件

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Abstract

With the needs of the development of industry, methanol is widely used, making methanol pollution to the environment is more and more serious. In order to better treatment of methanol wastewater pollution, experiment, with methanol as sole carbon source by using the method of enrichment culture to a methanol degradation bacterium strain was isolated from soil, through the observation of its morphological characteristics identification of the strains of gram negative, rod shorter. Through further analysis of the effect of environmental factors on the growth, determines the optimum culture conditions for methanol degrading bacteria of pH 7.5, temperature 28 ℃, speed 160 r/min, methanol content is 1%, the incubation time is 5 d. Explore methanol degrading bacteria optimum growth conditions, can for the immobilized microorganism technology such as modern biotechnology methanol wastewater treatment to provide effective basis.

Key word: methanol degrading bacteria; Screening; Growth conditions

IV

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1引言

甲醇作为一类重要的有机化工原料，用途广泛，是制造各种药品、染料、农药、喷漆、炸药、香料的原料[1]，但同时甲醇也是一种重要的有机污染物，广泛存在于石油化工、有机合成、林业化工和塑料等生产废水中[2]，随着工业的迅猛发展，工厂所排放的废气、废水中的甲醇含量明显增多，在污染环境的同时也危害着人类的健康安全[3]。由于甲醇的生物可降解性很强，因此其生物处理方法有着较为广阔的应用前景，不仅能在治理污染的同时节约能源，还能在代谢后转化出抗菌素、氨基酸、蛋白质等有用代谢产物，产生多重效益[4,5]。

本实验从土壤中筛选出一株能利用甲醇为唯一碳源生长的菌株，为微生物降解甲醇提供了菌种来源。

1.1甲醇及甲醇降解微生物的简介

1.1.1甲醇的简介

甲醇（methanol）是一种无色透明易燃易挥发的极性液体，能与水、乙醇、乙醚、苯、酮类和大多数其他有机溶剂混溶。由于甲醇在人体新陈代谢中会氧化成比甲醇毒性更强的甲醛和甲酸（蚁酸），饮用含有甲醇的酒可引致失明、肝病、甚至死亡，因此甲醇对人体有强烈的毒性。

甲醇可从煤制取，特别是可利用劣质高硫煤和焦炉气回收制取。工业上几乎全部采用一氧化碳加压催化加氢的方法来合成甲醇，其工艺过程包括造气、合成净化、甲醇合成和粗甲醇精馏等工序。 1.1.2甲醇降解微生物的简介

能利用甲醇作为能源和碳源生长的微生物是一类在能量代谢中利用一碳化合物产生还原力的细菌，即甲基营养菌，属于革兰氏阴性菌。其所利用的含甲基（-CH3）的一碳化合物有：甲醇、甲烷、甲基胺（H3NH2）和甲酸等。

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根据甲基营养菌对一碳化合物的利用功能，又将其分为两个亚群：一是专性甲基营养菌，此类细菌均能利用甲烷进行生长，其他物质如二甲醚和甲醇仅起维持生长作用。二是兼性甲基营养菌，这类细菌可利用许多碳源（包括一碳甲基化合物）进行生长，其中大多数兼性甲基营养菌能够利用甲醇和甲基胺 [6]。

1.2甲醇降解微生物的研究进展

对甲醇的微生物降解研究开始于20世纪60年代，报道出的甲醇降解菌株主要有：甲基杆菌 (Methylobacterium sp. ) [7]，甲烷八叠球菌(Methanosarcinaceae sp. )

[8]

，栖热袍 Thermotoga sp. ) [9]，脱硫肠状菌 (Desulfotomaculum sp. ) [10]等。 20世纪80年代英国莱斯特大学研究出一种新的甲醇利用菌，经鉴定为嗜甲基

菌属，属革兰氏阴性菌[11]。

2001年中国科学院沈阳应用生态研究所与哈尔滨工业大学的几名研究者对氮肥厂活性污泥进行驯化筛选得到3株甲醇降解菌，经鉴定均为假单胞菌属细菌[12]。

2007年中国河北省农业大学及农科院的学者利用富集培养的方法从化工厂活性污泥中分离到一株甲醇降解菌CYW–32，经对其形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析，将菌株鉴定为嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilium ) [13]。

2009年中国医学院的孔庆胜等从活性污泥中筛选到一株可利用甲醇为唯一碳源和能源生长的细菌SDM11，该菌革兰氏染色阴性，短杆状。结合其形态特征和生理生化特性，该菌被初步鉴定为甲基营养菌属[14]。

1.3甲醇降解微生物的筛选原理

自然界中存在着各种各样的微生物，尤其是土壤微生物种类齐全，是微生物的大本营，所以从自然界中分离筛选微生物菌种，是我们获得优良新菌种最基本、最主要的方法。从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制培养基的pH值、控制分离培养基的营养成分、控制培养温度、添加抑制剂、对样品进行特殊处理、控制空气条件等。常用的纯种分离方法有简单平板分离法、平板划线分离法、毛细管分离法、土布分离法、稀释分离法、显微操作单细胞分离法等[15]。

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本实验采用平板分离法对甲醇降解菌进行分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的最适培养基和培养条件，创造一个只利于目的菌生长而抑制其他微生物生长的环境，从而可选择性地分离目的菌[16]。

1.4甲醇及甲醇降解微生物的应用

1.4.1甲醇的应用

甲醇用途广泛，是基础的有机化工原料和优质燃料。主要应用于精细化工，塑料等领域，用来制造甲醛、醋酸、氯甲烷、甲氨、硫二甲酯等多种有机产品，也是农药、医药的重要原料之一。

目前，随着人均能源消耗量的持续增大以及直接甲醇燃料技术的飞速发展，微型直接甲醇燃料电池（μDMFC）由于其广泛的应用前景而成为研究的热点。直接甲醇燃料电池作为当今最具有发展前途的可替代能源之一，主要作为便携式电源或移动电源应用于微电子设备、微型医疗器械、微机电系统、个人通讯设备等[17]。 1.4.2甲醇降解微生物在处理甲醇废水中的应用

目前对于甲醇废水的处理主要有物理处理法、化学处理法、生物处理法。常见的含甲醇废水的物理处理法有吸附法、焚烧法、汽化法等。常见的含甲醇废水的化学处理法有化学氧化法、湿式氧化法和电解氧化法[18]。

生物修复是治理有机污染的一种切实有效的方法，具有费用节省、能够最大限度地降低污染物浓度、可在现场处理污染土壤或水体、环境负面影响小等多重优势，所以一般认为生物法是去除甲醇污水中有机污染物最经济最有效的方法。利用海藻酸钠等包埋材料包埋驯化后的活性污泥制成固定化小球颗粒对甲醇废水进行处理，是利用甲醇降解菌处理甲醇废水的常用技术。目前国内外对甲醇废水生物处理工艺主要有上流式厌氧污泥床工艺、固定化微生物技术、厌氧序批反应工艺等[19]。

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1.5甲醇及甲醇降解微生物的研究方向及问题

1.5.1甲醇的研究方向及问题

由于甲醇来源丰富，将甲醇应用于燃料电池已成为世界各国微电子机械系统微型燃料电池领域研究的热点。而直接甲醇燃料的性能受温度制约，随着温度的下降，电池性能下降，这将严重影响电池结构及性能。因此直接甲醇燃料电池的低温启动、低温运行及保存和低温耐久性是限制其商业化应用的关键性问题之一，这也是当前更好地利用甲醇作为燃料电池研究中的一个研究方向。 1.5.2甲醇降解微生物的研究方向及问题

从20世纪60年代开始研究甲醇降解微生物以来，国内外以甲醇为原料，通过嗜甲醇细菌或酵母菌发酵生产单细胞蛋白[20-22]的研究颇多，但将其用于处理甲醇废水的研究报道较少。为了更为高效处理甲醇废水废气，要不断筛选降解甲醇的高效菌株，丰富甲醇降解微生物的菌种种类，是研究甲醇降解微生物的一个方向。

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2材料与方法

2.1实验仪器

超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ALC-1100.2型电子天平 德国赛多利斯股份有限公司 YC-260L冰箱 海尔集团

HGY型摇床 德国赛多利斯股份有限公司 ZDP-2160型恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 光学显微镜 上海光学仪器厂

752型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器股份有限公司

其它实验用具：试管；试管架；接种环；涂布棒；培养皿；电磁炉；灭菌锅；移液管；移液枪；酒精灯；烧杯； 250ml 三角瓶；玻璃棒；药品勺等。

2.2实验材料与试剂

2.2.1菌种

由指导老师提供土壤样品菌悬液。 2.2.2基础试剂

甲醇（分析纯） 宿州化学试剂厂 琼脂 杭州微生物试剂厂

95%乙醇（工业纯） 上海振企化学试剂有限公司 蛋白胨（分析纯） 北京奥博星生物技术有限公司 尿素（分析纯） 天津化学试剂三厂 葡萄糖（分析纯） 杭州微生物试剂厂

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碳酸二氢钠（分析纯） 中国医药上海化学试剂公司 硝酸钾 （分析纯） 上海化学试剂有限公司 硫酸亚铁（分析纯） 天津化学试剂厂 硫酸锰（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂 硫酸镁（分析纯） 天津博迪化工股份有限公司 硫酸铵（分析纯） 天津博迪化工股份有限公司 乳酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 乙酸钠（分析纯） 上海化学试剂总厂 氯化钴 上海东懿化学试剂公司 氢氧化钠（分析纯） 天津化学试剂三厂 2.2.3培养基

培养基是供微生物、植物和动物组织生长和代谢用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等[23]。 无碳基础培养基： 琼脂：9g 硫酸铵：2g 磷酸二氢钾：0.5g 自来水：500mL

加入3%的甲醇为唯一碳源，用于筛选甲醇降解微生物。 液体培养基： 硫酸镁：0.2g 磷酸二氢钾：0.2g 自来水：100mL PH：自然

优化液体培养基：实验通过在不同的碳源、氮源培养基上培养菌种，得到优化培养基配方。

甲醇：3g 硫酸铵：0.3g 硫酸镁：0.2g

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磷酸二氢钾：0.2g 自来水：100mL pH: 7.5

微量元素：微量元素与大量元素均是微生物生长繁殖以及生产代谢所不可缺少的。

钴离子：0.01g 锰离子：0.01g 铜离子：0.01g 铁离子：0.01g

2.3实验方法

2.3.1观察菌种菌落的形态特征 2.3.1.1筛选菌种

倒平板：将灭菌后的500mL培养基加入15mL甲醇，混合均匀后倒平板，共20个平板。

土样分离：称取10g土样放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使土样和水充分混合，使细胞分散，静置片刻。取悬浮液梯度稀释不同稀释倍数后各取0.2mL 分别接种于基础培养基上于37℃恒温培养箱中培养7d，观察培养后菌种的菌落形态并拍照[24]。 2.3.1.2贮存菌种

将灭菌后的试管培养基，摆好斜面。在超净工作台上将培养后的菌种用接种针在试管斜面上划 S型，然后放入恒温培养箱中设置温度为37℃，培养7d，待菌体长满斜面，待培养完成后放入冰箱中贮存留种。 2.3.1.3显微观察

接种：无菌操作条件下对平板培养物挑取菌种在培养基上进行密集划线接种。 培养：将平板用报纸包好，37℃，培养7d。

革兰氏染色：通过制片，草酸铵结晶紫溶液初染、卢戈氏碘液媒染、酒精脱色、番红复染在光学显微镜下观察并显微拍照。

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2.3.2不同碳源下培养 2.3.2.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.2.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，加入含有以硫酸铵（0.3g/100mL）为氮源，分别以甲醇(1%)、乙醇、葡萄糖（0.1%）、乳酸钠（2%）、乙酸钠（2%）为碳源，微量元素及大量元素配方如2.2.3，体积为100mL的无菌液体培养基。将接种好的三角烧瓶放入摇床中，设置温度为28℃，转速为160r/min。5d后观察培养后三角烧瓶中的菌体生长状态并拍照记录。 2.3.3不同氮源下培养 2.3.3.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.3.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，加入含有以甲醇（1%）为碳源，分别以硝酸钾、硫酸铵、尿素、蛋白胨为氮源（各0.01g/mL），微量元素及大量元素配方如2.2.3，体积为100mL的无菌液体培养基。将接种好的三角烧瓶放入摇床中，设置温度为28℃，转速为160r/min。5d后观察培养后三角烧瓶中的菌体生长状态并拍照记录。 2.3.4不同培养转速下培养 2.3.4.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.4.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，分别加入含有优化碳、氮源的100mL无菌液

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体培养基(配方见2.2.3)，分别置于100r/min，120r/ min，140r/ min，160r/ min，180r/ min，200r/ min，220r/ min转速下，于28℃培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。

2.3.5不同培养温度下培养 2.3.5.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.5.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，分别加入含有优化碳、氮源的100mL无菌液体培养基(配方见2.2.3)，分别置于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃温

度下，于160r/min 培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。

2.3.6不同培养pH下培养 2.3.6.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.6.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，分别加入含有优化碳、氮源的100mL无菌液体培养基(配方见2.2.3)，将pH分别调整为5.5、6、0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5于28℃、160r/min 培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。 2.3.7 不同培养时间下培养 2.3.7.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.7.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，分别加入含有优化碳、氮源100mL的无菌液

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体培养基(配方见2.2.3)，置于160r/min、28℃培养，分别取培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d的培养液在OD600nm测其吸光度。 2.3.8不同甲醇浓度条件下培养 2.3.8.1制备菌体悬浮液

取洁净的并装有无菌水的试管，用接种环将实验菌株挑取适量放入试管中，并用移液枪将菌体溶液吹吸均匀。 2.3.8.2接种摇床培养

用移液管吸取1mL菌体悬浮液，分别加入到含有0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%浓度甲醇的100mL选择培养基中，置摇床中反应5d，取反应液测定其在OD600nm下的吸光度。

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参考文献

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致谢

该实验论文是在老师的悉心指导和帮助下完成的，严谨的治学态度、渊博的知识和求真务实的敬业精神，使我终身受益，在此表示由衷的感谢。

在完成论文的整个过程中，从论文的选题、实验思路、实验操作到论文的撰写，老师始终耐心地帮助我。在老师为我做实验指导时，不仅讲解了实验操作的规范性，而且拓展了与此相关的很多知识，其幽默和蔼的态度让我无拘束地向他请教各种各样的问题，甚至诸如学业和今后生涯的指导。撰写论文之时，老师能够耐心地指出我的论文中的不足之处，提出合理的建议对论文进行修改。在我遇到任何难题时，老师都能够耐心地指点我，他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予了我无尽的启迪。老师学识渊博、态度和蔼、思维敏锐、作风严谨而又民主，这让我在钦佩之余，更认真地完成了实验，掌握了科研的方法，也获得了实践锻炼的机会。他耐心地帮助与指导对我完成此次毕业论文有着很大的帮助。

同时，还要对在论文期间，在学习、生活各方面给予我帮助的同学朋友表示十分的感谢。

至此论文完成之际，还要感谢在百忙中抽出时间和精力参加我的论文评审工作的所有老师。

最后，感谢我的母校——

本文参考了许多作者的研究成果，在此表示衷心的感谢。

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