四川理工学院微生物菌种选育实验指导

《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。 一、实验目的

通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二、实验内容

实验一 工业微生物菌种筛选

根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。

1、采样 2、增殖培养 3、纯种的分离； 4、高产菌株的初筛； 5、高产菌株的复筛。

实验二 微生物的诱变育种

用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。 1、出发菌株的选择； 2、同步培养；

3、单细胞(或单孢子) 悬液的制备； 4、诱变处理； 5、中间培养； 6、分离和筛选。

实验三 菌种保藏

采用合适的方法对实验二所得菌种进行保藏。 三、实验要求

1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。

2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭

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他人的数据。 四、考核办法

1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。

2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。

3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。

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微生物菌种选育概述

微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。所以微生物的很多工作都是围绕着—个“种”字而进行的。

菌种选育包括选种和育种两方面的内容。选种是根据微生物的特性，挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取；另一方面根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，采用各种分离筛选方法，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，在已有的菌种基础上，采用诱变或杂交等方法，迫使菌种发生变异，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三当菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。

第一节 工业微生物的分离筛选

菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。

菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤（见图）。

一、采样

（一）从土壤中采样

土壤样品往往是首选的采集目标：土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方；从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤。

土壤中微生物分布规律：一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌(108)＞放线菌(107)＞霉菌(106)＞酵母菌(105)＞藻类(104)＞原生动物(103)，其中放线菌和霉菌指其孢子数。

在分离菌株前要根据分离筛选的目的，

到相应的环境和地区去采集样品：因为各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。

1、土壤有机质含量和通气状况

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(1) 耕作土、菜园土和近郊土壤适合于细菌、放线菌生长。 (2) 山坡上的森林土适合霉菌、酵母菌生长繁殖。 (3) 采土样最好的土层是5—25cm。 2、土壤酸碱度和植被状况

土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤(pH7.0一7.5)环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。

3、地理条件 4、季节条件

秋季采土样最为理想。 5、采样方法

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5—25cm处的土样10—25g，装人事先推备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10一30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3—4g撤到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。 （二）根据微生物生理特点采样 1、根据微生物营养类型

每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。

微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生淀粉酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山查等果蔬中合有效多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。

若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。 2、根据微生物的生理特性

筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌，它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘

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蔗渣堆积处采样。 二、富集培养

一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基（如营养成分、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。 （一）控制培养基的营养成分

在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。 （二）控制培养条件

在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱(pH7.0一7.5)，霉菌和酵母菌要求偏酸(pH4.5—6.0)。因此，富集培养基的pH调节到被分离微生物要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20min，有利于孢子的萌发，可以较大地增加放线菌数目，达到富集的目的。 （三）抑制不需要的菌类

1、分离细菌时，在培养基中加入浓度为50u／ml制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的生长。

2、分离放线菌时，在样品中加入0.05％十二烷基磺酸钠(SDS)不仅可以抑制细菌的生长，还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟派酸(5mg/L)+制霉菌素(50 mg/L)+青霉素(0.8mg/L)也可以有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。

3、分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U／ml，可以抑制细菌和放线菌生长。

4、分离根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落，通常在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨酸防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。 三、纯种分离

经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。

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