人参皂苷Rh2对人膀胱癌细胞T24增殖和凋亡的影响

中药药理与临床 2012; 28( 1) 35

a p o p t o s i s w e r e m ea s u r e d by MTT m e t h o d a nd f l o w cy t o m e tr y ． I n a n i n v i v o P D m o d e l p r o duc e d by 1-m e t hy l -4-ph e ny l -1，2，3，6-t e tr a hyd r o py r i - d i n e ( M P T P) tr ea t m e n t ( 20 m g / k g ，3 t i m e s ，i p ) ，n i ss l s t a i n i n g a nd t y r o s i n e hyd r o xy l a s e ( T H ) i mm un o h i s t o ch e m i s tr y w e r e u s e d t o o

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g r a ( S N C) ． C a s p a s e -3 p o s i t i v e c e ll nu m b e r i n S N C w a s d e t e r m i n e d by u s i n g i mm u - n o

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i s t o ch e m i c a l m e t h o d ． R es u l t s : I n PC 12 c e ll s ，C A P E 1． 25μM s i g n i f i c a n t l y d e c r ea s e d c e ll v i a b ili t y l o ss a nd a p o p t o s i s r a t e i nduc e d by M PP + ． I n P D m o u s e m o d e l ，n i ss l s t a i n i n g a nd T H i mm un o h i s t o ch e m i s tr y s h o w e d t h e s i g n i f i c a n t l o ss o f s u r v i v e d n e u r o n s a nd T H -p o s i t i v e n e u r o n s i n S N C ． C a s p a s e -3 i mm un o s t a i n i n g s h o w e d a s i g n i f i c a n t i nc r ea s e o f c a s p a s e -3 p o s i t i v e c e ll nu m b e r i n P D m o u s e m o d e l ． T h e tr ea t - m e n t w i t h C A P E s i g n i f i c a n t l y p r e v e n t e d t h e l o ss o f T H -p o s i t i v e n e u r o n s a nd d e c r ea s e d c a s p a s e -3 p o s i t i v e c e ll nu m b e r ． C o n cl u sio n : T h e s e r e - s u l t s s u gge s t t h a t C A P E h a s t h e p r o t e c t i v e e ff e c t i n m o d e l s o f P a rk i n s o n ＇s d i s ea s e ( P D ) ． K ey wo r d s c a ff e i c a c i d ph e n e t hy l e s t e r ; M PP + ; M P T P ; t y r o s i n e hyd r o xy l a s e ; c a s p a s e -3

人参皂苷 Rh2 对人膀胱癌细胞 T24 增殖和凋亡的影响

邝 姮1

，危建安2

*

，曾汇霞1

( 1 广州中医药大学第二临床医学院，广州 510405; 2

广东省中医院中心实验室，广州 510006)

摘 要 目的: 探讨 20( S ) -人参皂苷-R h2( G S -R h2) 对人膀胱癌 T 24 细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法: 采用

MTT 法检测 G S -R h2 对 T 24 细胞增殖抑制率; 光学显微镜观察 G S -R h2 作用前后细胞形态变化; 流式细胞仪检测 G S -R h2 对 T 24 细胞

凋亡和细胞周期分布影响; RT -PC R 检测 m RN A 表达。结果: G S -R h2 在 5 m g / L ～ 21． 97m g / L 浓度范围内，对 T 24 细胞增殖无明显抑 制作用; 21． 97 m g / L ～ 160m g / L 浓度范围内，G S -R h2 对人膀胱癌 T 24 细胞的生长有抑制作用，呈量-效关系，

I C 50 为 37m g / L 。T 24 细 胞经 G S -R h2( 40m g / L ) 作用后光镜下呈死亡形态改变; 细胞增殖指数( P I ) 由 42． 534% 下降至 31． 03% ; 早期凋亡细胞数明显增加; p53 和 m yc m RN A 表达下降。结论: G S -R h2 能显著抑制人膀胱癌 T 24 细胞增殖、诱导 T 24 细胞凋亡，其机制可能与 G S -R h2 下调 P 53 和 m yc m RN A 表达，阻滞细胞进入 S / G 2 期等有关。

关键词 人参皂苷-Rh2; T24 细胞; 增殖; 凋亡

膀胱癌是以血尿为主要症状的癌症，是中国最常见的泌尿 系统肿瘤，其主要病因是基因及环境因素的影响，目前膀胱癌 的基本治疗手段为外科手术、放疗和化疗，但对晚期癌症的治 疗效果不太显著。人参皂苷是人参的主要活性成分，目前研究 发现，人参皂苷-R h2 ( G S -R h2) 的抗癌作用最强。国内外文献 先后报道 G S -R h2 对人卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌细胞、前列腺 癌等肿瘤细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用

［1 ～ 4］

，但关于其对

膀胱癌细胞作用的研究较少。本实验就 G S -R h2 对人膀胱癌 T 24 细胞的作用及其可能机制进行探讨，旨在为膀胱癌的临床 治疗提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1． 1 试验药物 20 ( S ) -人 参皂苷-R h2 ( G i n s e n o s i d e -R h2，G S - R h2) ，购自 广东省 药 品 检 验 所，规 格: 20m g / 瓶，批 号: 111748- 200501。

1． 2 细胞 人膀胱移行细胞癌细胞 T 24( 中国科学院上海生 科院细胞资源中心) 。

1． 3 试剂 胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) ; MTT( 美国 AMRESCO 公司，批号 Amresco0793) ; Annexin V-FITC

k i t ( B i o V i s i o n 公司，批 号 K 101-100 ) ; 碘化丙啶( P I ) ( B i o V i s i o n 公司) ; R P M I -1640 ( 杭州吉诺生物医药 技 术 有 限 公 司，批 号

G NM 31800) ; 胰酶( G i bc o 公司，批号 25200-072 ) ; P B S 粉剂( 武 汉博士德生物工程有限公司，批号 A R 1155) ; TR I Z O L ( I nv i tr o - ge n 公 司，批 号 15596-026 ) ; P r i m e S c r i p t TM RT r eage n t k i t 和 S Y BR P r e m i x E x T a q TM 试剂( 购自大连 T a k a r a 公司) 。 1． 4

仪器

荧光定量 PC R 仪( A B I ，7500) ; 高速冷冻离心机

( 美国 BE C K M A N 公司) ; C O 2 培养箱( 美国 T h e r m o 公司) ; 倒置 显微镜( 日本 N I K O N 公司) ; 超净工作台( 新加坡 E S C O 公司) 。 1． 5

方法 T 24 细胞用含 10% 胎牛血清的 R P M I -1640 培养基 ( 含 100U / m l 青霉素和 100U / m l 链霉素) ，于 37℃ 、饱 和湿度、

5% C O 2 培养箱中培养，细 胞消化采用 0． 25% 含 EDT A 胰酶。 G S -R h2 用 70% 乙醇水溶液配制。取对数生长期 T 24 细胞，以 1． 5 × 105 / 孔浓度接种于 24 孔板，每 孔体积 500μl 。培养 24h 后，换液并加入终浓度分别为 5、10、20、40、80、160m g / L 的 G S - R h2，并设置空白对照组和乙醇溶剂对照组，每组设 3 个复孔。 培养 24h 后，弃培养液，每孔加入 50μl 5m g / m l MTT 和 450μl 不 含血清 R P M I -1640 培养液。继续培养 4h 后弃去培养液，每孔加 入 500μl DM S O ，避光震荡孵育 10m i n ，用酶联免疫检测仪( 波长 570n m ) 测定每孔吸光度值( A ) 并计算细胞生长抑制率( I R ) 和

* 通讯作者

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半数抑制浓度( I C 50) 。I R = ( 1 － 实验组 A 平均值 / 对照组 A 平 均值) × 100% ; I C 50 由作图法得出。经多次重复实验发现 5、 10、20m g / L 浓度的 G S -R h2 对细胞均无明显抑制作用，但当浓度 达到 40 m g

/ L 时 G S -R h2 对细胞的抑制率突然显著上升且超过 50% ，40、80、160m g / L 浓度的 G S -R h2 抑制率分别为 61． 58% 、 97． 02% 、98． 96% ，表明 G S -R h2 对 T 24 细胞增殖抑制的敏感浓 度在 20 ～ 40 m g / L 之间。以 1． 5 × 105

/ 孔浓度接种 T 24 细胞于

24 孔板，设置空白对照组、溶剂对照组、药物各浓度组，药物浓 度以 10m g / L 为起始浓度，30% 递增，共设置 7 个浓度，最大浓 度 48． 3m g / L 。每组设 3 个复孔，检测方法同上。 1． 5． 1 细胞形态学观察

取对数生长期细胞种 25c m 2

的培养

瓶，当细胞长满培养瓶底约 60% 时置于光学显微镜下观察细胞 形态后加药。设空白对照组、溶剂对照组和 G S -R h2 的 I C 50 浓度 组，培养 24h 后，于显微镜下观察细胞形态变化并作记录。 1． 5． 2 细胞周期检测 收集药物作用 24h 的细胞，用 P B S 洗涤

1 次，加入 1ml 预冷的 70% 乙醇，4℃ 固定过夜。取出细胞后， 1200rpm 离心 5min ，弃去固定液后用 PBS 洗 细 胞 1 次，加 入 500μl PI 染色，避光孵育 15min 后上机检测，分析细胞周期。测 出各期细胞所占比例并比较增殖指数( PI)

。 PI = ( S 期 + G 2 / M ) / ( G 0 / G 1 + S + G 2 / M ) × 100%

1． 5． 3 细胞凋亡检测 收集药物作用 24h 的细胞，用 500μl B i nd i n g B u ff e r 洗涤 1 次，120 目筛网过滤，静置 10m i n 后离心，弃 去上清后加入 10μl A nn e x i n V -F I T C 和 50μl P I ，混匀避光孵育 15m i n 后离心，弃上清后用 500μl 流式 P B S 重悬细胞，上机检测 细胞凋亡情况。

1． 5． 4 m RN A 表达检测

取对数生长期细胞种 6 孔板，培 养

24h 后加药，设置空白对照组、溶剂对照组和 I C 50 浓度的 G S -R h2 实验组，每组设 2 个复孔。继续培养 24h 后，弃去培养液，用预 冷的 P B S 洗涤 1 次，弃去 P B S 后加入 1m l T r i z o l 并收集细胞，按 说明书操作提取总 RN A ，用紫外分光光度计测定 A 260 / A 280， 计算 RN A 样品的纯度和浓度。按说明书操作合成 c DN A ，以适 量 c DN A 为模板在 T a q DN A 聚合酶催化下进行 PC R 扩增。按 照 S Y BR P r e m i x E x T a q TM 试剂说明进行 r ea l t i m e -PC R 反应，反 应体系 20μl ，每份样品做复孔检测扩增条件为: 预变性 95℃ 30s ，PC R 反应 95℃ 5s ，60℃ 30s ，40 个循环后 60℃ 延伸 34s 。

mRNA 相对表达量用比较 CT 值法计算，以看家基因磷酸 甘油醛脱氢酶( Gapdh) 为内参，即用看家基因和靶基因 CT 值差

( ΔCt) 计算靶基因相对看家基因 Gapdh 表达量( 1 / ( 2ΔCt) ) ，以 对照组作比较基准，计算实验组 mRNA 的相对表达量( Ratio) 。 引物应用 Invitrogen 公司在线软件 OligoPerfect? Designer 设 计，用 BLAST 进行比对，由 Invitrogen 公司合成，实验用引物相 关情况见表 1。

表 1 实验中应用的引物

基因 引物序列

T P 53 F : 5＇-G AA GG T G AA GG T CGG A G T C -3＇ R : 5＇-G AA G A T GG T G A T GGG A TTT C -3＇ M Y C F : 5＇-T C AA G A GGCG AA C A C A C AA C -3＇ R : 5＇-GGCC TTTT C A TT G TTTT CC A -3＇ G A P D H

F : 5＇-T C AA C AA

G A T G TTTT GCC AA C T G -3＇ R : 5＇-A T G T GC T G T G A C T GC TT G T A G A T G -3＇

1． 5． 5 统计学方法 s p ss 19． 0 软件包进行统计学处理。m RN A 表达采用 t 检验，P ≤0． 05 为差异有统计学意义; 其余实验数据 采用平均值法。

2 结果

2． 1 G S -R h2 对 T 24 细胞的增殖影响

实验发现，

G S -R h2 在 5 ～ 20m g / L 浓度无抑制作用，其对 T 24 无抑制作用的最大浓度为 21． 97m g / L ，根据图表公式求出 I C 50 ≈37． 00m g / L 。为获得更为 稳定的实验结果，减 少实验误差，后 续实验取 40m g / L 浓度进 行。

图 1

G S -Rh2 对 T24 细胞抑制作用

2． 2 G S -R h2 对 T 24 细胞形态学的影响 光学显微镜下观察

所得，空白和溶剂对照组 T 24 细胞密度大，数量多，呈梭型，有触 角。经 40m g / L G S -R h2 处理 24h 后的细胞多呈圆形，密度减少， 胞膜变圆滑没有触角，胞质减少，折光度减弱，核皱缩颜色变浅， 细胞体积缩小，并有大片细胞脱落，如图 2。

图 2

G S -Rh2 对 T24 细胞形态学的影响 A 为空白对照组; B 为溶剂对照组; C 为 40m g / L G S -Rh2 实验组

2． 3 G S -R h2 对 T 24 细胞周期的影响 与溶剂对照组相比， 40m g / L G S -R h2 作用 24h 后实验组 G 0 / G 1 期细胞所占比例明 显上升，

G 2 / M 期和 S 期细胞比例均下降( 如图 3 所示) 。对照 组和实验组的增殖指数 P I 值分别为 42． 534% 和 31． 030% 。

2． 4 G S -R h2 对 T 24 细胞早期凋亡的影响 对照组有部分细 胞出现早期凋亡，这可能与细胞本身状态有关。实 验组细胞 ( 40m g / L G S -R h2 作用 24h ) 早期凋亡率比溶剂对照组上升 10．9% ，有明显差异，如图 4。

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图 3

G S -Rh2 对 T24 细胞周期的影响

图 4

G S -Rh2 对 T24 细胞凋亡影响

2． 5 G S -R h2 对 T 24 细胞 p53、m yc 基因 m RN A 表达的影响 与

溶剂对照组比较，实 验组( 40m g / L G S -R h2 作用 24h ) m RN A 的表达发生显著改变，

p53 和 m yc 表达水平显著降低。m yc 对 照组和实验组的 x ± S D 分别为 1． 0265 ± 0． 0375、

0． 3705 ± 0．0262，p53 对照组和实验组的 x ± S D 分别为 1． 2055 ± 0． 2906、0．

8265 ± 0． 1450，如图 5。

3 讨论

G S -R h2 是人参的活性成分，其通过调节免疫功能、抑制肿 瘤转移、诱导癌细胞凋亡、逆转肿瘤细胞的耐药性、诱导癌细胞

分化并抑制癌细胞生长等机制［5］

发挥其抗癌作用。G S -R h2 抗 肿瘤作用具有多靶点、多效应的特点，同时其不良反应少，不易

产生耐药性，是近年来研究的热点［6］

。本实验通过研究 G S -R h2 对体外培养人膀胱癌细胞 T 24 的作用，证实 G S -R h2 有抑制膀 胱癌细胞增殖并诱导其凋亡作用，为膀胱癌的临床治疗提供实

验依据。

细胞形态学变化是研究细胞增殖和凋亡不可或缺的一部分。

结果显示，经过 G S -R h2 24h 作用后的 T 24 细胞出现了明显的形 态学变化，细胞密度减少，细胞体积缩小，并有大片细胞脱落。

实验中采用 MTT 法研究并证实 G S -R h2 对 T 24 细胞有抑制 增殖的作用，其半数抑 制浓度 I C 50 为 37． 00m g / L 。其中在 5 ～

21． 97m g / L 浓度范围内抑制率没有明显差异或无抑制作用，而 21． 97 ～ 160m g / L 浓度内 G S -R h2 能呈量-效关系显著抑制细胞 增殖并诱导其凋亡。

研究表明，

DN A 受损的细胞通过以下方法避免 DN A 复制: 停滞在 G 1 期; 或者是在细胞已经通过 G 1 期的限制点后，通过 抑制复制子的起始或延伸，暂时停滞在 S 期

［7］

。O t a 等［8］ 检测

到 G S -R h2 可使黑色素瘤 B 16 细胞的细胞周期阻滞于 G 1 期。 本实验证明，

G S -R h2 能使 T 24 细胞周期阻滞于 G 1 期，G 2 期和 S 期细胞明显减少。由此可推测，

G S -R h2 可阻止细胞进行 DN A 复制，抑制细胞分裂。结果显示 T 24 细胞经 G S -R h2 作用 24h 后 其增殖指数由 42． 534% 下降至 31． 030% ，因此 G S -R h2 能使细 胞增殖指数降低。

高亲和力特异性结合，利用此原理可检测细胞的早期凋亡。实 验结果显示，实验组早期凋亡细胞较对照组增加 10． 9% ，差异 显著，因此表明 G S -R h2 对 T 24 细胞有诱导凋亡的作用。

m yc 基因是较早发现的一组癌基因，编码细胞核磷酸蛋白， 参与转录调节

［9］

。c -m yc 的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，

其过度表达与膀胱癌的恶性程度密切相关［10］

，膀胱移行细胞癌

病理分化越低，c -m yc 癌基因蛋白表达率越高，患者临床预后越

差

［11］

。本实验结果显示，G S -R h2 能使 m yc 基因表达显著下降， 这可能是 G S -

R h2 诱导细胞凋亡的机制之一。 野生型 p53 是常见的抑癌基因，通过其核心区结合 DN A ， 阻止细胞从 G 1 期进入 S 期，此时间间隔组织了细胞周期素与 C D K 的相互作用，允许损伤的 DN A 被修复。在此过程中，p53 在核内启动 p21 的转录，而 p21 结合并阻止 C D K 2 的作 用［9］

。

但突变型 p53 却能加速癌症进程、增强癌细胞化学耐药性、阻滞

癌细胞凋亡等

［12］

。由于细胞内野生型 p53 蛋白稳定性被严格

控制，半衰期只有 6 ～ 20m i n ，而突变型 p53 蛋白在癌细胞中高 水平堆积并具有较长的半衰期( 1 ～ 24h ) ［12］

，从而容易被检测

到。李俊鹏等

［13］

研究表明，p53 在正常膀胱黏膜中无表达，在

膀胱移行细胞癌组织中明显表达，其阳性率随膀胱移行细胞癌 病理分级增高而增高，随临床分期增加而增高，且 p53 与膀胱移 行细胞癌病理分级、临床分期呈正相关，因此 p53 可作为判断膀 胱移行细胞癌恶性程度和预后的重要指标。本实验结果显示 G S -R h2 能使 p53 基因表达显著下降，因此推断 G S -R h2 能促进 T 24 细胞发生早期凋亡可能与其使 p53 表达下降有关。

综上所述，

G S -R h2 能显著抑制体外培养人膀胱癌 T 24 细胞 增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与 G S -

R h2 阻滞 T 24 细胞进

图 5

G S -Rh2 对 T24 细胞 m yc 和 p53 m RN A 表达影响

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入 S / G2 期和使 myc 、p53 基因表达下降有关。

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