生化实验讲义

实验一 糖的颜色反应及还原性检验

A. 莫氏试验①

一、目的

掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。

二、原理

糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用

②

下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。

三、实验器材

棉花或滤纸；吸管1.0ml（×5）、2ml（×1）；试管1.5cm×15cm（×5）；容量瓶50ml（×5）；烧杯50ml（×5）；棕色瓶50ml（×5）；玻璃棒多根、电炉（配石棉网）多个。

四、实验试剂

莫氏试剂：称取α-萘酚2.5g，溶于95％乙醇并稀释至50ml。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。

1％蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。

1％葡萄糖溶液：称取葡萄糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。 1％果糖溶液：称取果糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。

1％淀粉溶液：将0.5g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至50ml。

五、操作

于5支试管中，分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液与1％淀粉溶

①

液1 mL和少许纤维素（棉花或滤纸少量浸在1ml水中），然后各加莫氏试剂2－3滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml（切勿振摇！！！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。

注意：①一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。

②亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替α-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。

B. 塞氏试验

一、目的

掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。

二、原理

酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；

②

有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。

三、实验器材

1． 吸管0.5ml（×3）、5.0ml（×1）。 2． 试管1.5cm×15cm（×3）

3． 水浴锅。

四、实验试剂

1． 塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100ml盐酸中[VH2O：V(HCl)=2：1]，临用时配制。 2． 1％蔗糖溶液：同试验A。 3． 1％葡萄糖溶液：同试验A。 4． 1％果糖溶液：同试验A。

五、操作

于3支试管中分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液各0.5ml，各加塞氏试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴中，比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。

六、问答题

1、分别写出两个实验的实验结果并进行分析。 1％葡萄糖溶液 1％蔗糖溶液 1％果糖溶液 1％淀粉溶液 纤维素 莫氏试剂 ＋浓硫酸 塞氏试剂 C．糖的还原性检验

一、目的和要求

了解鉴定还原糖的方法及其原理。

二、原理

在碱性溶液中，具有自由醛基或酮基糖能将金属离子（铜、铋、汞、银等）还原，糖本

２＋

身被氧化成酸类化合物。斐林试剂和班乃德试剂均为含Cu的碱性溶液,还原糖被还原成红色或黄色的Cu2O。此法常用作还原糖的定性或定量测定。

三、材料与仪器

吸管1ml（×5），2ml（×1）；试管1.5×15cm；水浴锅

四、试剂

斐林试剂（Ａ液）：称取15g硫酸铜(CuSO4·5H2O)及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000ml。

斐林试剂（Ｂ液）：碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

班乃德试剂：取无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml；取柠檬酸钠173g，无水Na2CO3 100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml，然后将150mlCuSO4溶液倒入混合即成。此试剂可长期使用。

１％淀粉溶液 １%蔗糖溶液

１%葡萄糖溶液

五、操作

1、于３支试管中各加入斐林试剂Ａ和Ｂ液１ml,混匀,分别加入１%葡萄糖、１%蔗糖和１%淀粉溶液１ml，置沸水浴中加热数分钟,冷却,观察各试管的变化.

2、另取３支试管,分别加入１%葡萄糖、１%蔗糖和１%淀粉溶液１ml,然后每管加入班乃德试剂２ml,置沸水浴中加热数分钟,取出冷却,和上面结果比较.

六.思考题

斐林反应与班乃德反应都发生了什么化学变化?

实验二 卵磷脂的提取和鉴定

一、目的和要求

掌握卵磷脂的提取方法及其鉴定方法。

卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多。卵磷脂易溶于乙醇、乙醚等脂溶剂，可利用此溶剂提取。新提取的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而成黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，具有特殊的鱼腥味，可鉴别。

（一）试剂1.鸡蛋卵黄（二）器材

2.95%乙醇

3.蒸发皿 4.水浴锅 5.试管 6.量筒

3.10%NaOH溶液

1.烧杯 2.漏斗

1.提取：于小烧杯内置蛋黄2g，加入热95%乙醇15mL，边加边搅，冷却，过滤，如滤液混浊，需重滤直到完全透明。将滤液置蒸发皿内，蒸气浴上蒸干，残留物即卵磷脂。

2.鉴定：取提取的卵磷脂少许，置试管内加 10%NaOH溶液2mL，水浴加热，是否产生鱼腥味。另取一些卵磷脂溶于1mL乙醇中，添加1～2mL丙酮，观察变化。

五、

1.卵磷脂的主要生理功能有哪些?

2.工业用大豆卵磷脂是如何制备的?3. 卵磷脂在食品工业的应用有哪些?

实验三 蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理 2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验内容

对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。 三、实验操作

（一） 双缩脲反应

1、实验原理

当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双

缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。 2、试剂 (1)尿素

(2)10%NaOH溶液

(3)1%CuSO4溶液

(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 3、操作

（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO4 2~3滴，混匀后观察颜色的变化。

（2）另取一试管，加蛋白质溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 2~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。

（二） 茚三酮反应

1、实验原理

除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应

生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为5~7。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。 2、试剂

蛋白质溶液 （同前）；0.5% 甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液 3、操作

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