分子生物学实验技术

分子生物学实验技术

目录

实验一细菌的培养 (2)

实验二质粒DNA的提取 (3)

实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (4)

实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (5)

实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (7)

实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (8)

实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (9)

实验八RNA提取与纯化 (11)

实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (13)

实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (15)

实验十一感受态细胞的制备及转化 (16)

实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (18)

实验十三DNA分析——Southern杂交 (19)

一基本操作

实验一、细菌培养

实验二、质粒DNA提取

实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度

实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析

实验八、植物RNA提取及纯化

二、目的基因获取

实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA

实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA

三、目的基因的克隆和表达

实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应

实验十一、感受态细胞的制备及转化

实验十二、克隆的筛选和快速鉴定

实验十三、DNA分析——Southern杂交

实验一细菌的培养

一、目的

学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理

在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器

（一）实验材料

大肠杆菌

（二）试剂

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化钠

4、1mol/L NaOH

5、琼脂粉

6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）

（三）仪器

1、培养皿

2、带帽试管

3、涂布器

4、灭菌锅

5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）

6、恒温摇床

四、操作步骤

（一）LB培养基的配制

配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：

细菌培养用胰蛋白胨10g

细菌培养用酵母提取物5g

NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。

LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。

（二）细菌的培养

（１）在液体培养基中培养

1、过夜培养

⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。

⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。

⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。

２、大体积培养

⑴按1∶100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。

⑵于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。

（２）在固体培养基中培养细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。平板划线法分离单菌落

⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。

⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。

⑶于37℃培养直至长出单菌落。

实验二质粒DNA的提取

目的

学习碱裂解法提取质粒的原理

原理

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

试剂与器材

一、试剂

1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5。高压灭菌20min。

2、LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20min。

3、溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。

4、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须现配）

5、溶液Ⅲ：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5mL）。

6、TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。

7、无水乙醇和70%乙醇。

二、器材

1、Eppendorf管、离心管架

2、10，100，1000ul微量加样器

3、台式高速离心机

4、摇床、高压灭菌锅

5、大肠杆菌DH5α（含质粒）

操作步骤

一、培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃×24h，然后从平板上挑取

单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃×12h。

二、提取步骤

1、将菌液移入1.5ml 离心管，8 000 rpm×1min，倒置于滤纸上，彻底除去残液。

2、加入100 ul预冷的溶液Ⅰ，用涡旋震荡器充分悬浮菌体。

3、加入4 ul RNase ，室温×2 min。

4、加入200 ul溶液Ⅱ，快速颠倒，温和混匀，冰浴5min。此时溶液应非常粘稠。

5、加入150 ul 预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），冰浴5 min。

6、12 000 rpm×5min。转移上清液至另一1.5ml离心管中。

7、上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃×20min。

8、12 000 rpm×5min，彻底除去残液。

9、加入500 ul 70% 乙醇洗DNA沉淀。3 000 rpm×1 min，彻底挥发除去乙醇。

10、加入40 ul ddH2O溶解DNA，待用。（或用TE溶解，-20℃保存）。

实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度

一、目的

学习测定DNA或RNA的浓度与纯度。

二、原理

核酸分子中的碱基集团含有共轭双键，它们对紫外光有强烈的吸收。核酸的最大吸收波长在260 nm，吸收低峰在230 nm。可以利用核酸的这一特性对其浓度进行测定。在波长260 nm下，A260=1时，双链DNA的含量为50 μg/ml，单链DNA为33 μg/ml ，RNA为40 μg/ml，寡聚核苷酸为 20～30 μg/ml。测出核酸溶液在A260的值，即可得出浓度。

根据经验数据，纯得DNA A260/A280=1.8,纯的 RNA A260/A280=2.0.若样品中含有蛋白或其它杂质会使其比值下降。

三、试剂与仪器

（一）试剂

TE缓冲溶液

（二）仪器

紫外分光光度计

四、操作步骤

1、开机，选择波长

开机前应先检查光路中有无障碍物。然后开启电源开关预热20左右。并调节波长在260 nm下。

2、选择A档，调零

面表上有4个可供选择的模式，本实验选择测定A值，因此选择A模式。待测核酸为水或TE溶液，选择水或TE做空白对照进行调零。

3、测定样品

将待测样品做适当稀释，用仪器配套的石英比色杯，以水或TE为对照的条件下测定，读取并记录样品A260的值。

4、计算样品的浓度

双链DNA浓度=50μg/ml×A260×稀释倍数

单链DNA浓度=33μg/ml×A260×稀释倍数

单链RAN浓度=40μg/ml×A260×稀释倍数

核酸总量=样品浓度×样品体积（ml）

实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

目的

学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。原理

水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN 发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成

线形分子（L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。

当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。

试剂与器材

一、试剂

1、DNA样品

2、TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍

3、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

4、溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

5、琼脂糖

二、器材

1、电泳仪系统

2、紫外灯

3、恒温水浴箱

操作步骤

1．选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。

2．选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。

3．制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

一般情况下可参考下表：

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加

热，至琼脂糖融化均匀。

4．将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60℃左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为0.5 μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳槽

水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽

中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。

注意：电极缓冲液要高出凝胶面2-5㎜。

5．待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样品点样顺序和点样量。

6．开启电源开关，最高电压不超过5V/cm。

7．电泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后电泳结束。一般20min—3 h，取电泳凝胶块直接拍照。

实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

原理

限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。

试剂与器材

一、试剂

1、EcoRⅠ酶

2、λDNA

3、TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍

4、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

5、溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

6、琼脂糖

二、器材

1、电泳仪系统

2、紫外灯

3、恒温水浴箱

操作步骤

一、质粒DNA酶切

1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。

2、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2 h。然后每个管中迅速加入2 ul EDTA

终止反应。

二、琼脂糖凝胶电泳

1、琼脂糖凝胶的制备（1％）

称0.4g琼脂糖加40ml 0.5 X TBE缓冲液,加热熔解。冷却至60℃加2ul EB，混匀。

2、胶板制备

将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，然后倒入熔好的琼脂糖，并在一端插好梳子。

待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽，垂直拔掉梳子。

注意：电极缓冲液要高出凝胶面2-5㎜。

3、加样

每个样品中加入1/10体积Loading buffer（10×），混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。

4、电泳观察

接通电源，电压为80V×1h左右，当溴酚蓝到达下沿1--2㎝处时，停止电泳。

5、观察及照相

将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。

实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析

目的

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

原理

十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。试剂与器材

一、试剂

1 、DNA extraction ：500ml

31.885g sorbitol (山梨醇)

6.05g tris PH8.2 (一般不调)

2、Nuclei lysis buffer: 500ml

100ml 1M Tris PH7.5

100ml 0.25M EDTA

200ml 5M NaCl

10g CTAB

100ml ddH20

3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml

用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l）,65℃预热，既为抽提液。

二、器材

操作步骤

一、基因组DNA提取

1、取0.15g左右小麦叶片，在液氮中迅速研磨后放入1.5ml离心管中，加入700ul抽体液（65℃预热）混匀，65℃水浴裂解40-60 min，期间温和混匀几次，加4 ul RNase 室温静置2min。2裂解好的DNA ，加入500 ul 氯仿：异戊醇（24：1），缓慢混匀，4℃×11 000rpm×10min。

3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃静置30 min。

4、将析出的DNA 离心，4℃×11 000rpm×10 min。

5、去掉上清，将沉淀用500ul 70% 乙醇清洗一次，

6、3000 rpm×1 min, 彻底挥发除去乙醇，溶于40ul dd H2O。

二、酶切及电泳分析

37℃反应4h，迅速加入2 ul EDTA 中止反应。0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。

实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA

目的

1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。

2、了解引物设计的一般要求。

原理

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。

PCR进行的基本条件：

⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）；

⑵引物；

⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）

⑷Taq DNA聚合酶

PCR循环由三个步骤组成：

⑴变性使模板DNA解离成单链；

⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；

⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：

⑴引物长度：15~25个核苷酸；

⑵CG含量为40%~60%；

⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；

⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；

⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3，

⑹两条引物间配对碱基数小于5个。

由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。

本实验以实验一中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。试剂与器材

一、试剂

1、Taq DNA聚合酶

2、10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）

3、dNTP

4、引物（P1、P2）

5、溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶。注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

6、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

二、器材

1、PCR扩增仪

2、电泳仪

3、台式离心机

4、紫外分析仪

5、恒温水浴

6、凝胶成像系统

操作步骤

一、PCR扩增

1

2、设置PCR

94 ℃ 180s

94 ℃ 45s

35 cycles: 55℃ 45s

72 ℃ 60s

72 ℃ 600s

3、运行PCR程序

二、PCR产物鉴定

反应结束后，取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

实验八RNA提取与纯化

一、目的

掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

二、原理

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA 首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA 沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。

RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。

三、试剂与器材

（一）试剂

1、暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3 h

2、DEPC

3、DEPC处理的ddH2O

4、RNA提取液：（每1000毫升中含有）

Tris 6.06 克(最终浓度为50 mM )

LiCl 6.03 克(LiCl -H2O 9.06克) (最终浓度为150 mM )

EDTA（0.5 M）10 毫升(最终浓度为5 mM )

SDS 50 克(最终浓度为5 % )

5、8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC处理的ddH2O

6、水饱和酚

7、氯仿

8、0.5M NaCl

9、溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

10、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

三、器材

1、分光光度计

2、电泳仪

3、台式离心机

4、手提式紫外监测仪

5、恒温水浴

6、凝胶成像系统

四、操作步骤

1、取植物叶片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小

量提取试剂量可减至1／10)

2、液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置

混匀，直至看不见任何团状物为止。

3、立即加入10毫升的等体积（酸性）酚/氯仿，剧烈（！）反复倒置混匀5至10min

（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！）。

4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。

5、重复步骤3和4，三次左右（注意观察界面上白色物质）。

6、取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀2-5min。

7、13000g×5min。

8、取上清，加入1/3体积8 M 的LiCl （即8 M LiCl应占最后体积的25%），沉

淀RNA，4℃过夜。

9、离心13000g ×10 min。

10、弃上清,保留沉淀（此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作）, 加

入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟（和缓地反复倒

置混匀），离心（13000g × 2 min）。重复洗涤沉淀数次。

11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。

12、用枪头吸去残留的液体，真空干燥2min。

13、加入200ul DEPC 处理过的水溶解RNA。

14、取用5ul电泳检测RNA完整性, 用TEB 缓冲液, 200V×20-30min。

15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度，A260 nm /A280 nm应在2.0 左右。

16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用.

辅助方案：试剂盒提取法（Trizol）

（一）试剂：

1.Ttizol Reagent

2.氯仿

3.异丙醇

4.70%无水乙醇

5.DEPC

（二）器材：

1、研钵

2、离心机

（三）实验步骤

1、称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离

心管中。

2、加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。

3、加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。

4、冷冻离心12 000 rpm×15min。

5、将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置

20min。

6、冷冻离心12 000 rpm×10min。

7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。

8、加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA

目的

学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

原理

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA 的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

试剂与器材

一、试剂

1、RNA模板

2、cDNA引物

3、反转录缓冲液

4、dNTP

5、AMV反转录酶

6、RNA抑制剂（RNasin）

7、Taq酶

8、10×PCR缓冲溶液

9、引物（P1、P2）

二、器材

1、PCR扩增仪

2、电泳仪

3、台式离心机

4、恒温水浴

5、紫外分析仪

6、微量移液器

操作步骤

一、RNA的反转录

1、在小管中依次加入

5 ul RNA

6 ul DEPC H2O

混合后,65℃×5 min(破坏二级结构).

2、置于冰浴5 min.

3、在管中依次加入: (反应体系为20 ul)

RT buffer ( 5×) 4 ul

RNasin 0.5 ul

dNTP ( 10mM) 2 ul

Oligo T17A（G／C）（50-100 uM） 1 ul

AMV反转录酶 1 ul

置于 42℃× 1 h。

4、70℃× 5 min（使酶失活，可省略）。

5、加入100ul ddH2O (从总RNA开始制备)或1000 ulddH2O（从mRNA开始制备）。

6、置于-20℃保存备用.

二、PCR扩增DNA

在灭菌的0.5ml PCR管中，依次加入

20μl cDNA

10μl 10×PCR buffer

5μl dNTP

2μl RT引物I

2μl RT引物II

1μl Taq DNA聚合酶

加dd H2O 补足50μl ，混匀。

PCR程序：

94 ℃ 3 min

95 ℃ 30 s

35 cycles: 55 ℃ 60 s

72 ℃ 90 s

72 ℃ 10 min

三、PCR产物的鉴定

取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

实验十质粒载体和外源DNA的连接反应

一、目的

掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二、原理

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。

在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25-100 ng / μl。

连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。

三、试剂与器材

（一）试剂

1、目标DNA片段（实验九RT-PCR扩增产物）

2、载体（pGEMT-easy）

3、2 ×ligation 缓冲液

4、T4 DNA连接酶

5、ddH2O

（二）器材

1、台式离心机

2、恒温水浴

3、微量移液器

四、操作步骤

1、取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:

2 × buffer： 5μl

pGEMT-easy：0.5μl

目的片段： 2.5μl

T4连接酶： 1μl

ddH2O 1μl

2、2000 rpm 离心30S，使反应体系充分混合。

3、4℃过夜连接。

实验十一感受态细胞的制备及转化

目的

掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

原理

受体细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

试剂与器材

一、试剂

1、0.1mol/L CaCl2取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

2、LB液体培养基（见实验一）

3、LB固体培养基（见实验一）

4、氨苄青霉素（100mg/mL）

二、器材

1、冷冻离心机

2、平衡天平

3、无菌操作台

4、微量移液器

操作步骤

一. 感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)

1、从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×

12-16h，可过夜培养。

2、将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。

3、取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃离心8 000rpm×1 min。

4、弃上清，加500 ul0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

5、彻底除去残液, 加200 ul0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。

6、冰浴静置 30 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

7、弃上清，加100 ul0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。

附注：

①、整个过程注意无菌操作和保持低温。

②、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

③、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

④、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。

⑤、D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD600值在0.4 - 0.5时，

此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。

二、质粒对大肠杆菌的转化

1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。

2、42℃热激90S。

3、迅速冰浴3min。

4、加入300 ul LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。

5、加入30 ul X-gal和6 ul IPTG,混匀。

6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨苄的LB固体培养基中。

7、37℃倒置，避光培养16-20 h。

8、蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。

实验十二克隆的筛选和快速鉴定

目的

掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。

原理

在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂---SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。

或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。

试剂与器材

一、试剂

1、破碎细胞缓冲液

50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)

1% SDS

2mmol/L EDTA

400mmol/L蔗糖

0.01%溴酚蓝

配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10毫升

20% SDS 10毫升

250mmol/L EDTA 1.6毫升

蔗糖27.2克

1.2%溴酚蓝 1.67毫升

加ddH2O至200毫升

2、10mg/ml 溴乙啶

3、TBE电泳缓冲液（5×）

4、Taq DNA聚合酶

5、10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）

6、dNTP

7、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

二、器材

1、电泳仪

2、1.5ml 离心管

3、Tip

4、培养皿

5、PCR扩增仪

7、台式离心机

8、紫外分析仪

9、恒温水浴

操作步骤

一、快速细胞破碎法测定

1、取1.5ml离心管编号码，每管加入50ul破碎细胞缓冲液。

2、取一培养皿在底部标记如图所示

3、待转化的细菌菌落长到2mm时

4、用牙签挑取单克隆将菌落点在作好标记的方格内，然后将牙签加入对应的培养管中

（培养管中含5ml LB液体培养基）。

5、培养皿37℃×6 h后4℃保存。培养管37℃×12 h左右。

6、用培养管中的菌液提取质粒。

7、酶切电泳检查质粒。

二、菌落PCR快速鉴定法

1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入25ul或50ul PCR反应体系中。

2、用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有

无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。

实验十三DNA分析——Southern杂交

目的

学习Southern杂交的原理及操作方法。

原理

（一）所谓DNA探针，实际上是一段已知序列的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检测样品基因的目的。在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA 链杂交后，再通过免疫反应进行检测。通过酶标记地高辛抗体检测，可以肯定杂交反应存在。

免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。

（二）核酸探针膜上杂交原理

1、杂交总原则

脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件（如酸碱,有机溶剂，加热）可使轻键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补序列的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补的原则结合成异源性双链的过程。

2、杂交膜的选择

杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1xSSC,0.1%SDS）煮沸5-10min后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。

3、预杂交和杂交液

预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅是预杂交液中不含探针。

下面是几种基本的杂交液配方：

（1）Standard buffer: 5Xssc,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent.

（2）Standard buffer+50% formamide:50% formamide(deionized),5Xssc,0.1%(W/V) N-lauroy lsarcosine.0.02% (w/v)SDS,2%Blocking Reagent.

（3）High SDS buffer(church buffer): 7%SDS,50% formamide(deionized),

5Xssc, 2% Blocking Reagent,50Mm Sodium phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine.

4、Southern Blotting

DNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操纵均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。 Southern 印迹杂交包括两个步骤：

（1）把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。

(2) 与标记的DNA探针杂交。

操作步骤

一、探针的标记

1、用灭菌去离子蒸馏水稀释1μgDNA至总体积16μl.。

2、DNA热变性：把DNA置于沸水中水浴10min。然后迅速插入碎冰中3min以上。

3、加4μl DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再离心2000rmp ×5min。

4、置于37℃反应至少2 h 。时间越长,标记探针的产量越高。延长反应时间至20 h

可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。

5、加入2μl EDTA以终止反应，对于原位杂交和膜反应杂交来说，标记反应可告结束，

上述反应液置于-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。

二、Soutern转移

首先讲DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂糖凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。

（一）试剂

1、0.25 M HCL

2、变性液：0.5N NaoH,1.5M NaCL

3、中和度：0.5M Tris-HCl,Ph7.4,3M NaCl

4、20 x SSC: 0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl

5、2 x SSC: 0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl

（二）程序：

1、将凝胶浸入0.25M HCl 中10 min。HCl处理的作用主要是通过嘌呤使DNA分子断裂，

因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略次步骤。

2、进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30 min。

3、把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15min×2次。

4、蒸馏水漂洗凝胶2次。

5、把凝胶浸入中和液中，室温泡15min ×2次。

6、处理凝胶同时，切一张同样大小硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜事先用2× SSC 浸泡。

剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。注意不要用手直接触及膜面。

7、准备转移用容器和支架，容器中放20×SSC 。支架上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。

8、依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水纸，玻璃板，500-1000g适量重物。

（注意：检查pH值，用硝酸纤维素膜时ph<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA 难以吸附到膜上。）

9、室温转移12-20 h。

10、取出转移膜，用2 × SSC 漂洗数次，以去处困难吸附在膜上的凝胶。

11、固定：可选择下述方法之一进行DNA固定:

①、紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20 min，简单漂洗干燥备用。

②、尼龙膜置于120℃×30min。

③、硝酸纤维素膜置于普通烘箱中65-70℃×3-4 h。

三、.Southern杂交

印迹杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5-25ng/ml，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。

（一）试剂

1、Standard buffer

2、Standard buffer+50%formamide

3、High SDS buffer

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