硕士毕业论文-微量泵入硝普钠对血管内皮损伤的研究

目录

一、中文摘要 ............................................................................................................. 1 二、英文摘要 ............................................................................................................. 2 三、符号说明 ............................................................................................................. 4 四、正文 ..................................................................................................................... 5

（一）前言 .......................................................................................................... 5 （二）材料与方法 .............................................................................................. 5 （三）结果 .......................................................................................................... 9 （四）讨论 ........................................................................................................ 10 （五）结论 ........................................................................................................ 16 五、附图表 ............................................................................................................... 17 六、参考文献 ........................................................................................................... 20 七、文献综述 ........................................................................................................... 27 八、致谢 ................................................................................................................... 27 九、攻读学位期间撰写的论文 ............................................... 错误！未定义书签。

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微量泵入硝普钠对血管内皮损伤的研究

申 请 人： 专 业： 导 师： 一、中文摘要

目的：血管内皮是保护血管形态和功能的一层生理性屏障，也是机体最大

的内分泌、旁分泌组织系统。内皮细胞所分泌的血管活性物质包括：内皮素-1(ET-1)、细胞间黏附分子(ICAM)，一氧化氮(NO)、内皮衍生超极化因

子(EDHF)等等。硝普钠是一种常见血管扩张剂，但硝普钠的毒副作用和不

良反应目前研究较少见，作为血管扩张常用药，诸多临床试验表明其对血

管内皮细胞具有损伤作用。

方法：本研究在以大量硝普钠临床用药观察记录为研究依据。运用数理统

计学处理：结果统计采用SPSS11.0统计软件分析，数据均采用X±S表示，

组间差异用单因素方差分析，差异显著者用SNK-q检验进行比较。P<0.05

为差异有统计学意义。

结果：研究发现，硝普钠对人血管平滑肌细胞合成胶原的抑制作用，抑制

白介素-1诱导血管内皮细胞粘附分子-1的表达，对血管平滑肌钙激活钾通道具有影响，对血小板聚集有一定抑制作用。

结论：硝普钠对血管内皮有损伤作用。

关键词：硝普钠、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、合成胶原、血管内皮

粘附分子、钙激活钾通道、血小板

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Trace pumped sodium nitroprusside on vascular endothelial

injury

Applicant Speciality Supervisor Professor Professor

二、英文摘要 ABSTRACT

Objective： Vascular endothelial layer of physiological barrier to protect the vascular morphology and function, but also the body's largest endocrine, paracrine organization system. Vasoactive substances secreted by the endothelial cells include： endothelin -1 (ET-1), intercellular adhesion molecule (ICAM), nitric oxide (NO), endothelium-derived hyperpolarization factor (EDHF). Nitroprusside is a common vasodilator, sodium nitroprusside side effects and adverse reactions of the present study is less common, as the blood vessels to dilate commonly used drugs, many clinical trials show that its injury-role of vascular endothelial cells.

Methods： In this study, in a study based on a large number of the sodium nitroprusside clinical medication observation record. Use Statistical analysis： The results of mathematical statistics using SPSS11.0 statistical software analysis, data are ± S, the difference between the groups with one-way ANOVA, varied significantly by SNK-q test comparison. P <0.05 was considered statistically significant.

Results： The study found that sodium nitroprusside inhibition of human vascular smooth muscle cells and collagen synthesis, inhibition of interleukin-1-induced vascular endothelial cell adhesion molecule-1 expression in vascular smooth muscle

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calcium-activated potassium channels that have an impact on certain inhibitory effect on platelet aggregation.

Conclusion： Sodium nitroprusside on vascular endothelial damage.

Keywords： Sodium nitroprusside, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, synthesis of collagen, vascular endothelial adhesion molecules, calcium-activated potassium channels, platelet

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三、符号说明

英文缩写 SNP cGMP NO EDRF HVSMC VCAM 英文全称 Sodium nitroprusside Caged cGMP nitrogen monoxide Endothelium-derived relaxing factor Vascular smooth muscle cell vascular cell adhesion molecule 中文全称 硝普钠 鸟嘌呤核糖苷-3'，5'-环磷酸酯 一氧化氮 血管内皮释放因子 血管平滑肌细胞 血管平滑肌细胞 4

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四、正文 （一）前言

血管内皮是保护血管形态和功能的一层生理性屏障，也是机体最大的

内分泌、旁分泌组织系统。内皮细胞所分泌的血管活性物质包括：内皮素

-1(ET-1)、细胞间黏附分子(ICAM)，一氧化氮(NO)、内皮衍生超极化因子

(EDHF)等等，在维护血管结构和功能，调节内环境稳定等方面起着重要的

作用。这些扩血管物质（NO）与缩血管物质（AngⅡ）失衡导致了血管内

皮的损失。大量研究表明，血管内皮功能损伤是多种血管病变进程中最为

重要的始动环节之一。

血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自

分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症

反应等功能。NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶（eNOs）作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活

鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血

小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。

然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子

减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件

的发生。

（二）材料与方法

1实验材料

1.1主要仪器和器材

250-500透明动物加压仓 501型超级数显恒温水浴 上海701所杨园医用氧舱厂 上海浦东跃欣科学仪器厂 SW-CJ-IF型超净工作台 德国Leica公司 Leica020-519.010光学显微镜 德国Leica公司 5

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5810R低温高速离心机 德国Eppendorf公司 摄像及FR-988生物显微图像分析系上海复日科技有限公司 统 SmartScape2002生物图像分析软件 上海复日公司 MTFG-A通风柜 深圳医疗器械公司 微量可调移液器 法国Gilson公司 THZ-C恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂 MLS-3020高压蒸汽消毒锅 日本三洋电器公司 EL×800酶联免疫检测仪 美国Biokit公司 EL×800BioelisaReader 美国Bio-TekInstruments POLARstarmicroplatereader 德国BMG公司 DL-360超声波仪 浙江石浦海天电子仪器厂 Milli-Q去离子水制备仪美国Millipor有限公司 AB104-N精密电子天平Delta320电子PH计 美国MettlerToled有限公司 美国MettlerToled有限公司 电子天平 上海第一天平厂 电子摇床 上海离心机研究所 THZ-C 恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂 水浴锅 上海医疗器械七厂 Incucell55型温箱 德国Incucell有限公司 DK-8A型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司 DK-8D型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司 超低温冰箱 美国公司 LKB-Ⅲ型超薄切片机 德国Leica公司 CM1900恒温冷冻切片机 德国Leica公司 微波炉 Galanz公司 -70℃冷柜 HarrisManufacturing公司 干热消毒柜 StuartScientific 2.试剂及药品

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硝普钠 美国Sigma公司 一氧化氮检测试剂盒 碧云天生物技术研究所 甲苯胺蓝 中国医药集团上海化学试剂公司 InSituCellDeathDetectionKit 瑞士Roche公司 Caspase-3/CPP32FluorometricAssay美国BioVision公司 Kit Ant-nitrotyrosine：兔抗鼠 美国Upstate公司 TTC 中国医药集团上海化学试剂公司 多聚甲醛 中国医药集团上海化学试剂公司 NaCl 上海生化试剂一厂 NaH2PO4.2H2O 上海生化试剂一厂 Na2HPO4.12H2O 上海生化试剂一厂 考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒 南京建成生物科技公司 蛋白酶抑制剂 康成生物有限公司 甲醛 中国医药集团上海化学试剂公司 二甲苯 中国医药集团上海化学试剂公司 中性树胶 中国医药集团上海化学试剂公司 乙醚 中国医药集团上海化学试剂公司 30%H2O2 中国医药集团上海化学试剂公司 无水乙醇 中国医药集团上海化学试剂公司 工业氮气 上海江南气体公司 工业氧气 上海江南气体公司 3.主要试剂的配制

（1）0.9%生理盐水 NaCl9g ddH2O1000ml 混匀后高温高压消毒备用 （2）硝普钠 7

硝普钠0.3g 潍坊医学院硕士学位论文

0.9%生理盐水 10ml 溶解后振荡，用时振荡 （3）一氧化氮标准品NaNO2 在1ml中取50ml，用0.9%的生理盐水稀释标准品。 二实验方法

本研究在以大量硝普钠临床用药观察记录为研究依据。运用数理统计

学处理：结果统计采用SPSS11.0统计软件分析，数据均采用X±S表示，组

间差异用单因素方差分析，差异显著者用SNK-q检验进行比较。P<0.05为

差异有统计学意义。

（1）内皮细胞VCAM-1mRNA表达的检测

生长状态良好的内皮细胞分别用IL-lα(10ng/mL)、IL-lα(10ng/mL)+SNP(10-4

mol/L)刺激6h，消化收集细胞，按异硫氰酸胍一步法提取总RNA。紫外分光

仪定量，每组取30μgRNA上样电泳，用α32P-dCTP(比活度3000Ci/mmoL)标记的cDNA探针杂交，洗膜后-70℃压片24h，常规显影定影后，洗脱液处理尼

龙膜，α32P-dCTP标记的β-actin为探针，再次杂交，以检测上样RNA的完整性

与加样的准确性。

（2）内皮细胞膜表面VCAM-1表达的检测

细胞ELISA,接种于96孔板、生长状态良好细胞，换含2üS的M199培养过

夜后，用含5üS的M199培养，分为下列各组：IL-α(l0ng/mL)，IL-lα(l0n

g/mL)+SNP(浓度分别为10-5、5×10-5、10-4mol/L)，作用6h。IL-lα(10ng/mL)，

IL-lα(10ng/mL)+SNP(10-4mol/L)，分别作用2、6、12h。上述过程结束后，弃

去培养液，PBS+0.05%Tween20清洗，0.25%的戊二醛固定20min，1%的脱脂

奶粉37℃封闭2h，清洗后加入50μLVCAM-l抗体(l:5000)，4℃过夜，清洗，加

入50μL生物素标记抗鼠抗体(l:8000)，37℃，1h后清洗，加入50μL新闻和素

标记的辣根酶(l:8000)，37℃温育1h，清洗后加入100mL过氧化物酶底物，室

温显色20min后加入50μL4NH2SO4终止反应，结果以酶标仪490nln下的光密

度值(A)表示。

流式细胞仪检测，生长状态良好的内皮细胞换含2üS的M199过夜后，用

含5üS的M199培养，其中实验组分别加入IL-lα(10ng/mL)、IL-lα(10ng/m

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L)+SNP(10-4mol/L)，孵育6h后胰酶消化，PBS收集细胞，离心去上清，用1：

100稀释的抗VCAM-1抗体重悬细胞，4℃，60min后，10倍量PBS重悬细胞，

离心去上清,加入荧光素标记的1:100稀释的二抗，4℃，60min后，10倍量PB

S重悬，离心去其上清，0.5mLPBS重悬细胞，流式细胞仪检测其平均荧光强

度。

（3）胃蛋白酶消化法测定细胞胶原合成

将样品静息的HVSMC加入含有所需药物和3H-脯氨酸(74kBq/ml)的培养液

(1ml)，于37℃培养24h后收集各孔培养液加入试管中，然后依次加入25μLl5mol/L醋酸，25μL胃蛋白酶，50μL未标记的脯氨酸，混匀后于4℃静置3h，再

加入250μL4℃预冷的1.2mol/L过氯酸，反应2h后，将反应液中未被消化的胶

原蛋白收集，进行液闪测定，以检测培养基中胶原蛋白的含量。细胞移出培

养板后，收集进行液闪测定，以检测细胞内胶原的含量，总胶原生成量为培

养液和细胞内胶原生成量之和。另以相同的培养条件培养细胞，计算各组每孔细胞的数目。

（三）结果

研究发现，硝普钠对血管内皮有损伤作用。硝普钠对人血管平滑肌细

胞合成胶原的抑制作用，抑制白介素-1诱导血管内皮细胞粘附分子-1的表

达，对血管平滑肌钙激活钾通道具有影响，对血小板聚集有一定抑制作用。

硝普钠血管扩张的作用机制：硝普钠对细胞作用的研究很少。它直接作用

于血管平滑肌。类似于亚硝酸盐作用，血管扩张作用主要是“铁-亚硝基”基团

的作用。比亚硝酸类作用强，持续时间短，对其他平滑肌作用极小，Poge等

发现在明显降压剂量硝普钠时，对子宫、十二指肠平滑肌无影响。John，on报告只在松弛血管平滑肌浓度100倍时，对子宫平滑肌才有影响，而对动物离

体心肌则无影响。故对心肌无松弛作用。对中枢神经或自律神经无影响。扩

张血管作用亦不是通过中枢或自律神经起作用。Page和Johnson等证明这些效

果通过分子本身起作用，而不是通过它的代谢产物硫氛酸盐或佩化物起作

用。它是唯一作用于血管平滑肌的药物。这在临床上有很大应用价值。

大量临床研究和应用表明，硝普钠对血液动力、肾功能及冠状动脉流量有直接影响。

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(1)对血液动力学影响：硝普钠直接作用于血管平滑肌引起动脉和静脉松

弛。动脉压、静脉压、肺动脉压随体、肺循环阻力下降而减低。从而减低了

心脏前、后负荷。心率正常人稍增加，高血压病人增加较多，心衰时不增加

或减少，后者因不增加心肌耗氧t对冠心病泵衰竭是很重要的。对心排血t主要决定于用药前血液动力学状态，在高血压无心衰时，心排血量常减低。而在

心衰时，心排血量常增加。

(2)对肾功能影响：硝普钠减低肾血管阻力而增加肾血流量。Page等研究

正常和肾性高血压狗中，硝普钠可使正常狗对氨马尿酸清除率比对照增加11

9%，而使肾性高血压狗则降低到对照的95%。Bostron和K-aloyamides观察到

当平均动脉压由134降到69mmHg时，伴随对氨马尿酸清除率，菊淀粉清除率

和钠排出下降。在心衰病人尿里、肌醉和钠排泄增加。

(3)对冠状动脉血流量影响：对冠状动脉有直接扩张作用。增加冠状动脉

血流里。改善心肌营养状态。同时由.于心肌需氧量减低，超过了由于动脉压

降低，冠脉灌注压减低，造成冠脉流量减低所造成的不良影响，不会引起心

肌缺血加重。同时证明它可以增加缺血心肌局部灌注，减低缺血心肌局部乳

酸产物，增加了缺血区侧枝循环，而不发生强力的窃血现象。

（四）讨论

1 硝普钠对人血管平滑肌细胞合成胶原的抑制作用

内皮素(ET-1)对人血管平滑肌细胞(HVSMC)合成胶原及硝普钠(SN

P)对HVSMC合成胶原的影响实验表明：加入梯度浓度SNP，NO水平呈剂

量依赖性增加(均P<0.01)；ET-1使胶原合成量增加80%(P<0.01)，加入

梯度浓度SNP较ET-1组胶原合成量分别减少了38%、42%、57%(均P<0.0

1)，呈剂量依赖性；ET-1+SNP低、中、高浓度组较ET-1组细胞内cGMP

含量明显增加(均P<0.01)，且cGMP含量随SNP增加而增加；细胞内cGM

P含量与胶原合成量呈良好负相关关系(r=-0.93)。结论.ET-1可引起HV

SMC合成胶原增多；SNP可剂量依赖地抑制HVSMC合成胶原；SNP对胶

原合成的抑制作用可能是通过cGMP途径起作用[1-3]。

硝普钠抑制血管平滑肌细胞合成胶原实验表明，培养液中ET-1组NO的含

量为(95.50±7.47)mmol/L。与ET-1组相比较，各不同浓度SNP组NO含量显

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著升高(与ET-1组相比，均P<0.01)，且NO含量随SNP剂量的增加而增加。

以3H-脯氨酸掺入量表示胶原含量，ET-1组胶原含量较C组显著增加了8

0%(P<0.001)。SNP低、中、高浓度组胶原含量较ET-1组显著减少，分别减

少了38%、42%、57%(与ET-1组相比，P<0.01)，表明SNP可抑制HVSMC合

成胶原，并呈剂量依赖性。SNP低、中、高浓度组cGMP含量较ET-1组显著

增加,分别增加了184%、354%、529%(与ET-1组相比，均P<0.001)，表明S

NP可引起cGMP含量增高，且cGMP含量随SNP剂量的增加而增加。细胞内

cGMP含量与HVSMC合成胶原量呈显著负相关，随细胞内cGMP含量增

加，HVSMC合成胶原量减少。相关系数(r)为-0.93(P<0.01)。

研究发现，动脉内皮损伤后，NO的产生显著减少。给予球囊损伤后再

狭窄动物添加补足NO供体Sin-1，结果发现，血管内膜增厚被抑制，甚至

趋于消退。最近还有报告，将内皮型NOS基因导入球囊损伤血管后的动物，损伤诱发的细胞生长及新内膜形成能够得到抑制，防止或减轻了再狭

窄的发生。进一步研究发现，内皮细胞与VSMC共同孵育时内皮细胞释放

的NO有抑制胶原合成的作用[4-6]。SNP通过释放NO能显著抑制细胞胶原合

成，SNP低、中、高浓度组与ET-1组相比3H-脯氨酸掺入量即胶原合成量下

降，分别下降了38%、42%、57%，呈剂量依赖性[7]。

目前，NO抑制细胞合成胶原的机制尚不清楚。cGMP在细胞内起重要

第二信使作用，参与血管舒缩、血管活性物质的自分泌和旁分泌、细胞增

殖、细胞表型等许多重要功能的调节。NO主要通过cGMP及非cGMP途径

而发挥其生物作用[8-10]。目前认为，cGMP有抑制细胞合成胶原的作用，作

为一个重要的信使分子，在调节再狭窄的形成过程中发挥着重要作用。体

外实验发现，在细胞培养液中加入8-Br-cGMP(cGMP的模拟物质)后，细胞

合成的胶原量明显下降。Chu也观察到同样现象，而且加入美甲蓝(cGMP

的拮抗物质)后，细胞合成的胶原量回升。细胞内cGMP含量与胶原合成量

之间有良好的线性关系，表明cGMP与胶原合成量有密切关系，提示SNP

抑制胶原的作用可能与cGMP途径有关[11]。

2 硝普钠抑制白介素-1诱导血管内皮细胞粘附分子-1的表达

作为内皮源性舒张因子的一氧化氮(NO)，通过降低血小板凝聚川、抑

制血管平滑肌增殖闭及迁移，减少白细胞对内皮细胞的粘附[12]。硝普钠在

体内作为一氧化氮的供体，对内皮细胞粘附分子VCAM-l的表达有较大影

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响[13]。一氧化氮抑制IL-1α诱发的内皮细胞粘附分子VCAM-1的基因表达

水平其作用呈浓度及时间依赖性。一氧化氮抑制内皮细胞粘附分子VCAM

-l的表达是其抑制单核一内皮细胞粘附及抗动脉粥样硬化的机制之一[14]。

此外，硝普钠抑制IL-1α诱导的内皮细胞VCAM-1mRNA的表达。

研究表明，作为一氧化氮供体的硝普钠显著抑制细胞因子诱导的内皮

细胞粘附分子VCAM-1的表达，其作用呈浓度及时间依耐性，在内皮细胞

粘附分子VCAM-1mRNA表达水平，硝普钠也表现为明显的抑制作用。近

年来的研究结果显示：在多种动脉粥样硬化危险因子直接或间接作用下，

在动动脉粥样硬化易发部位诱发前炎症因子（1L-1，TNF，INF，MCP等）

的分泌及释放，导致白细胞（特别是单核细胞与T淋巴细胞内膜下募集，进

而产生的一系列免疫，炎症反应时动脉粥样硬化发生的第一步。硝普钠作

为一氧化氮的供体，抑制1L-1α诱发的内皮细胞粘附分子VCAM-1的表达[1

5]

。同时，有研究显示[16-17]，硝普钠抑制平滑肌增殖及血小板聚集[18-19]。

分别以10-5、5×10-5、10-4mol/L浓度的硝普钠同1L-1α(10ng/mg)共同刺激

内皮细胞6h，其膜VCAM-1的表达经细胞ELISA检测其光密度值分别为0.78±

0.17，0.65±0.09，0.47±0.12，与单IL-lα刺激组(0.80±0.07)比较，硝普钠在5×1

0-5及10-4mol/L浓度，可显著抑制VCAM-1表达(P<0.01，n=12)。以IL-lα(l0ng

/mL)分别刺激2，6，12h，ELISA测定的光密度值为0.30±0.14，0.80±0.12，1.

00±0.17。同时加入SNP(10-4mo/L)，则ELISA测定光密度值为0.22±0.12，0.51

±0.15，0.56±0.08，硝普钠可明显抑制VCAM-l的表达(P<0.01，n=12)，并且随

与IL-lα共刺激时间的延长，其抑制作用也增强，上诉结果与通过流式细胞仪

测定所得出的结果一致。

3 硝普钠对血管平滑肌钙激活钾通道的影响

血管内皮细胞通过释放多种血管活性因子对血管平滑肌张力进行调

节，其中血管内皮释放因子(EDRF)的作用尤为重要。许多舒血管物质作用

于血管内皮细胞使其产生及释放EDRF，然后由EDRF介导血管平滑肌舒张

[20]

。

硝普钠对血管平滑肌钙激活钾通道的影响研究发现，在形成细胞贴附

模式后即给予电压箝制，选择箝制电压(HP)为0mV，检测电压(TP)为阶跃

脉冲0至60mV，每步递增10mV，共6步。阶跃脉冲波宽25，间隔15。以无

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通道活动的膜片作为对照，然后加硝普钠(SNP)1nmol/L于细胞浴池内，再

进行同样电压箝制，150s后通道被激活，8min后通道活动呈衰减趋势。随

检测电压的增高，SNP激活的KCa开放增加，但SHRspKca电流小于WKY。

SHRsP阻力血管平滑肌被SNP激活的KCa电流比WKY小，在检测电压为2

0、30、40、50、60mV时其电流幅值显著小于WKY(P<0.05，n=5)。根据电

流电压关系曲线可求出被SNP激活的KCa的斜率电导：SHRsP为5821±3.3pS

(x±s，n=6)，WKY为121.88±6.4pS（x±s，n=5)。SHRsp阻力血管平滑肌

被SNP激活的Kca的电导明显小于WKY。在形成细胞贴附模式后给予电压

籍制，按上述相同的实验程序，选择箝制电压(HP)为0mV，检测电压(TP)为阶跃脉冲0至60mV，每步递增10mV，共6步。以无通道活动的膜片作为

对照，然后加8-Br-cGMP10μmol/L于细胞浴池内，进行同样电压箝制，2m

in后可激活SHRsp及WKY阻力血管平滑肌KCa，通道活动持续到18min仍未

完全衰减。随检测电压的增高，cGMP激活的Kc.的开放增加。但SHRspKC

a的电流小于WKY。这一结果与SNP激活作用相似。依据被cGMP激活的S

HRsp及WKY阻力血管平滑肌KCa的电流一电压关系可得出被cGMP激活

的KCa的斜率电导：SHRsp为62±4.3pSWKY为124±7.2pS(n=5)。SNP的作用

成份NO可通过扩散进入平滑肌细胞内，激活鸟昔酸环化酶产生。GMP而发

挥作用。

血管平滑肌的收缩起始于细胞膜兴奋导致的胞内游离钙浓度([Ca2+]i)

增高。使[Ca2+]i增高的途径有多种，其中因膜电位去极化引起的电压依赖

性钙通道开放是主要途径。而膜电位直接受钾通道影响；钾通道开放可增

加K+外流，导致血管平滑肌细胞膜超极化，引起电压依赖性钙通道关闭，

减少胞外钙内流降低细胞内钙浓度，从而引起血管舒张。由于血管平滑肌

细胞膜主要存在着大电导的KCa，其密度可达15000/细胞，因此KCa在调节

血管的舒缩中起着重要作用[21-23]。据研究，血管内皮细胞与动脉中层之间

的功能偶联至少有三条通路：除了NO和前列环素外还有内皮超极化因子

(EDHF)途径。关于这些内皮释放因子对肠系膜动脉、脑阻力血管钾通道的

作用，Brayden和Murphy(1996)报告NO不影响兔的脑阻力血管平滑肌的膜

电位，但激活兔肠系膜动脉的远支(口径200-300μm，属于阻力血管)的AT

P敏感钾通道(KATP)，EDHF还激活肠系膜动脉的aPamin敏感的钾通道[24-2

13

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5]

。

郑永芳等[26]在研究SNP对KCa影响中，观察其电导等动力学特征符合

KCa的特性，在膜内向外(inside-out)模式下，SHPsp与WKY此段血管的平滑

肌KCa的启闭对胞内钙浓度呈明显的依赖性。胞内钙浓度接近零时，记录不

到KCa电流。应用相应的钾通道阻断剂可削弱与消除KCa电流。在此基础上，

发现同量的SNP作为外源性NO的来源均可激活SHRsp及WKY大鼠肠系膜

动脉阻力血管平滑肌KCa。并且，这一激活效应与cGMP的激活效应非常相

似。提示NO的激活效应是由cGMP介导的[27-29]。但是，不论是SNP/NO或c

GMP激活的SHRspKce的电导、通道开放电流等均小于正常血压对照WKY

大鼠。这种差异无疑表明高血压时内脏阻力血管平滑肌细胞KO对EDRF/N

O的反应性降低。这在血管内皮细胞与血管平滑肌的功能联系中，将使平

滑肌膜复极化与超极化不足，致使不能有效地关闭钙通道导致舒张减弱[30

-32]

。

综上所述，高血压时血管舒张减弱，血管张力持续增高，一方面有血

管内皮细胞释放的舒张因子EDRF/NO及其介导物。GMP的下降，同时也存

在着阻力血管平滑肌膜的离子通道Kca对舒张因子反应性的降低。两者的

作用自然促使外周阻力增高，导致血压升高[33-34]。如是，本实验结果已从

血管内皮释放因子与血管平滑肌钾通道的角度解释了高血压血管舒张不

良外周阻力升高的原因。由于内脏阻力血管在形成外周阻力中的重要性，

因此本实验的结果对于逐步阐明高血压发病的血管机制无疑具有重要意

义。

4 硝普钠对血小板聚集的抑制作用

硝普钠对血小板聚集有一定抑制作用，硝普钠对二磷酸腺苷(ADP)诱

聚途径、花生四烯酸诱聚途径、血小板活化因子诱聚途径均有抑制作用，

但其效能对不同诱聚剂是不同的[35-36]。PasquiAL[37]研究指出，当使用AD

P、胶原蛋白和花生四烯酸诱聚剂时，硝普钠对血小板聚集抑制的ED50分

别为：2μM（ADP）、2.5μM（花生四烯酸）和4.5μM（胶原蛋白）、0.3μ

M（硝普钠）硝普钠对血小板聚集的抑制呈剂量依赖方式。血小板在10-5

M肾上腺素的聚集反应中，硝普钠低浓度时（0.15μM·ml-1）时主要影响次

级聚集，高浓度时肾上腺素引起的聚集初级波消失，在4.5μMADP的聚集

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反应中也有同样情况。硝普钠的最大抑制血小板聚集浓度，可部分解聚已

经聚集的血小板。

在硝普钠的结构中含有亚硝基团(-NO)，在pH中性是可释放一氧化氮

(NO)。目前认为硝普钠的作用是由于药物本省结构中的NO直接作用于血

管平滑肌和血小板，激活鸟苷酸环化酶，是环鸟苷酸(CGMP)浓度增加，从

而产生血管平滑肌松弛，血小板聚集抑制[38-39]。RovinJD等在这方面做了

动物实验，他们在一个带有内膜损失的犬的狭窄冠状动脉力学模型中，产

生急性血小板血栓，在栓塞形成的远端，出现循环血流减少，在这个模型

中，阿司匹林可消除血小板作为引起循环血流减少的媒介，但当肾上腺素

以0.2μg·㎏-1·min-1速度输入时，循环血流再次出现减少。他们对17只有狭

窄冠状动脉的狗静脉输入硝普钠，滴速为4.4±2.7μg·㎏-1·min-1，所有狗的循

环血流减少消失。血小板CGMP水平输入前是2.9±1.1pmol/108，当循环血流

减少消失时GCMP水平增加至4.3±1.6pmol/108。在硝普钠静脉输入期间，肾

上腺素用0.2μg·㎏-1·min-1速度对11只狗输入20min，循环血流减少没有出

现，但停用硝普钠，继续输入肾上腺素，循环血流减少在5-25min内出现，

随着循环血流减少的恢复，血小板CGMP也降低至3.3±1.4pmol/108，Dolli

MG等研究了硝普钠的作用和CGMP抑制了CGMP依赖性蛋白激酶C和钙

通道的血小板激活[40-43]。PasquiAL等也指出：Ca2+增加花生四烯酸和血小

板活化因子对血小板的聚集作用，而硝普钠能明显降低Ca2+的此项作用，

其活性浓度范围是1-10μM。硝普钠抑制血小板活化因子和花生四烯酸引

发的钙升高，推测硝普钠可能对细胞钙代谢有作用[44]。

另外，SaxonBA等也吃定了硝普钠存在时ADP和三磷酸腺苷(ATP)的

释放明显抑制。没有硝普钠时，在含血小板的血浆中平均有5.4×10-6MAD

P和2.3×10-6MADP释放，而有硝普钠存在时，则仅有平均0.8×10-6MADP和

0.5×10-6MADP关于这点也有相反的报告，认为硝普钠提高血小板CGMP水

平浓度，但不改变释放反应[45-47]。

硝普钠抑制血小板聚集，降低血小板功能，可伴随出血时间延长，Hi

neR等对19例需体外循环的心脏手术病人输入硝普钠，硝普钠输入后出血

时间明显改变，当硝普钠输入率≧3g·㎏-1·min-1，出血时间显著延长（P﹤

0.05），但仅在≧5g·㎏-1·min-1，出血时间超出正常范围，SaxonBA等研究

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三个心梗病人，用硝普钠治疗高血压，输入率分别是25、75和165μg·min-1

，这些病人模板出血时间不正常，但病人没有异常出血[48-49]。而Cunning

hamM等却报道一例29岁女性，因高血压输入硝普钠300μg·min-1维持正常

血压24小时后，病人出现大脑出血，出血时间延长(14min)。

血红蛋白或正铁血红蛋白能与NO结合，有效降低游离NO浓度，因此，

血红蛋白或正铁血红蛋白抑制NO对鸟苷酸环化酶的激活，逆转硝普钠对

血小板聚集的抑制作用。有文献报道在硝普钠加入同时或1-5min前在血小

板悬浮液中加入50μM血红蛋白，能显著对抗硝普钠的抑制作用，而单独加

入血红蛋白在血小板中，既无聚集作用，也不改变任何聚集剂的作用。25

μM高铁血红蛋白抑制硝普钠对鸟苷酸环化酶的激活达88-90%。50μM高铁

血红蛋白大约降级硝普钠对CGMP水平和抗聚作用分别是95%和70%[50]。

血红蛋白逆转硝普钠对血小板聚集抑制的作用对不同诱聚剂作用效

力不同。其中对血小板活化因子的作用最小，可能是硝普钠在血小板活化

因子引起的聚集中强效抑制作用的反应。

LidburyPS等研究iloprost(环前列腺素介质)与硝普钠在血小板聚集方

面的相互作用中发现2或4g·ml-1的iloprost对胶原引起的血小板聚集仅产

生小的抑制，1或2μg·ml-1的硝普钠的结果与之相似，但2ng·ml-1iloprost与1

μg·ml-1硝普钠结合产生血小板聚集抑制等于8ng·ml-1iloprost或1μg·ml-1硝

普钠的效果。显示一种协同作用，用ADP作诱聚剂获得类似结果。但两者

对血管平滑肌松弛无此作用，仅等于相加结果。

Iloprost是环前列腺素介质，它通过刺激腺苷酸环化酶增加环腺苷酸

（CAMP）抑制血小板聚集，而硝普钠抑制血小板聚集是激活鸟苷酸环化

酶，增加CAMP水平，这两个继发信使系统的激活对血小板聚集抑制起到

协同作用。

（五）结论

综上所述，硝普钠是目前应用较广泛的降压药，但硝普钠对人体血管

内皮细胞有一定损伤作用。长期临床观察发现，硝普钠对人血管平滑肌细

胞合成胶原的抑制作用，抑制白介素-1诱导血管内皮细胞粘附分子-1的表

达，对血管平滑肌钙激活钾通道具有影响，对血小板聚集有一定抑制作用。

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五、附图表

图1 细胞内cGMP和细胞合成胶原的相关关系

图2 10-4mol/L浓度的SNP作用不同时间对1L-1诱导的SMCICAM-1表达的影响

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图3 SNP激活SHRsP阻力血管平滑肌钙激活钾通道的电流幅值、开放时、关闭时直方图

图4 硝普钠二水合物的晶体结构

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图5 血管横截面示意图

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