简化免疫胶体金标记技术

包埋后免疫胶体金标记技术

1. 试剂

固定液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%多聚甲醛+0.1%戊二醛+4%蔗糖） 洗涤液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖）

醛基灭活液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖+0.1M甘氨酸） 脱水剂：甲醇（ddH2O稀释成30%，50%，70%，80%，90%，95%） 包埋剂：K4M (2.7g交联剂A+17.3单体B+0.1g引发剂C)

标记封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%TritonX-100+0.05%Tween 20) 标记洗涤液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4

抗体稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%Tween 20)

染色液：醋酸铀（3-4g醋酸双氧铀+100ml50%甲醇）；柠檬酸铅pH12（1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉+30mlddH2O）

2. 主要仪器：镍网（喷有方华膜和碳膜）、镊子、Parafilm、自制小环、冰箱（4℃至-35℃）、紫外聚合箱、培养皿、透射电镜、离子溅射仪、超薄切片机、恒温箱（28℃） 0.2二钾砷酸鈉缓冲液母液pH7.4：

0.4M 二钾砷酸鈉（21.4g二钾砷酸鈉/250mlddH2O） 0.2M盐酸（4.5ml/250mlddH2O）

50ml二钾砷酸鈉(0.4M)中加入8ml左右0.2M盐酸，调节pH至pH7.2-7.4,加入ddH2O至终体积为100ml，即为0.2二甲砷酸鈉缓冲液母液pH7.4 2.5%戊二醛母液pH7.4：

25%戊二醛10ml +0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用 4%多聚甲醛pH7.4：

a.16%多聚甲醛25ml+0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用

b. 2g多聚甲醛粉末+40ml ddH2O,70℃加热至粉末完全溶解，加入1.07g二钾砷酸鈉，用0.2M盐酸调至pH7.4，加入ddH2O至终体积为50ml，现配现用

0. 1M磷酸盐缓冲液pH7.4：NaH2PO4?H2O1.8g+23.25gNa2HPO4?7H2O+NaCl 5.0g.加入ddH2O至终体积为1000ml

K4M：2.7g交联剂A+17..3单体B至离心管中，充入氮气以使其充分混合，在加入0.1g引发剂C，继续充入氮气至其完全溶解，配置好的K4M包埋剂-20℃保存 3%醋酸铀：

3-4g醋酸双氧铀至100ml浓度为50%的甲醇中，静置过夜，过滤后4℃避光保存 1%柠檬酸铅：

1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉至30mlddH2O中，剧烈混匀，加入8ml1MNaOH至溶

液变得澄清，加入ddH2O至终体积为50ml，最终pH12左右 3. 步骤及方法 3.1 取材与固定

对于培养与分离的细胞，随用随取，取材时越快越好，动物组织取材的最理想的方法是经过组织灌流固定后再用锋利的刀片将其切成1mm3以下大小的组织块，投入到固定液中继续固定。植物材料由于有较大的细胞间隙和通气组织，因此固定液较难渗透至里层细胞，需要抽气以利于固定液的渗透。考虑到渗透压及细胞的生理条件，固定液中蔗糖浓度为4%，pH值为7.4。固定后的样品脱水前需要用0.01MPBS清洗干净，然后再用含有甘氨酸的PBS漂洗，灭活自由醛基。

注意事项：a 固定液的选择直接决定了样品的结构和抗原性的保存，戊二醛浓度超过0.1%，抗原性会迅速减弱。一般固定条件选择多聚甲醛3%+戊二醛0.1%-0.5%之间，4℃固定2-5小时。b 固定液保存时间久后，醛基会氧化，降低固定能力，因此最好现配现用。c 固定液有害环境，可以使用奶粉等蛋白类制剂处理。 3.2 脱水

脱水是指将生物样品中含有的游离水逐步替换成有机溶剂的过程，其对样品的最大影响是对脂类的抽提并引起组织细胞的收缩。常用的脱水剂是甲醇、乙醇和丙酮。考虑到样品的抗原性及脱水剂对脂类物质的抽提，低温包埋制样时，样品的脱水在低温下进行。

注意事项：a 低温时，低浓度的甲醇和乙醇会形成冰晶，所以30%甲醇或乙醇脱水时在0℃进行，当脱水剂浓度超过50%时，样品移至-20℃至-35℃进行。b 甲醇分子量较小，在细胞间穿梭较快，可以缩短脱水时间，梯度脱水时间在15min即可，乙醇也可以达到很好的脱水效果，脱水时间延长至60min。 3.3 渗透和包埋

渗透是包埋剂逐步取代样品中脱水剂的过程。低温包埋的样品渗透是用脱水剂和包埋剂以1:1、1:2、1:3的比例低温（-20℃--35℃）梯度渗透，然后再用纯的包埋剂低温过夜渗透，最后置于新管包埋。

注意事项：a低温包埋时，使用透光性较好地包埋管，包埋剂应尽量填满整个包埋管，避免残留氧气影响后续聚合过程。b未聚合的废包埋剂有害于环境，应聚合成无害的固体后再丢弃。c包埋用的包埋管以及包埋剂在包埋之前需要提前预冷，用于包埋的包埋剂需要现用现配 3.4 聚合

K4M低温聚合的条件是波长360nm的紫外光-35℃聚合，光源距离样品20-30cm。聚合箱中需要加有反射光的装置，使样品能接收来自各个方向的紫外光，以便样品聚合均匀。

注意事项：a 配置K4M时，先将交联剂A和单体B混合，冲入氮气混匀后，加入

引发剂C，继续冲入氮气直至C完全溶解。b K4M包埋剂由三部分组成：交联剂A、单体B和引发剂C。增加交联剂的量，组织块的硬度会增加。温度差异较大时，需调整三者比例，以获得硬度适中的包埋块。 3.5 K4M包埋块超薄切片

K4M为亲水性包埋剂，在进行超薄切片时，容易吸水，所以切片时，水槽的液面需相对降低。切好的超薄切片需要及时捞取，防止其在水面上漂浮时间过长导致样品与包埋剂脱开。切好的超薄切片捞于镍网上，应即时进行免疫金标，暂不标记的切片应4℃保存。

注意事项：免疫金标用的镍网，覆盖方华膜后，需要喷上碳膜，以减少抗体的非特异性吸附。捞片之前，碳膜的镍网需要先进行亲水化处理。

组织或细胞 固定液 0.1M 二钾砷酸鈉缓冲液 pH7.2-7.4（3%多聚甲醛+0.1%戊二醛+4%蔗糖）

4℃静置4h 洗涤液0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.2-7.4（4%蔗糖）：4℃洗涤15min X 4

0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.2-7.4（4%蔗糖+0.1M甘氨酸）；4℃静置30min

30%甲醇：0℃脱水15min

50%甲醇：-20℃(-35℃)脱水15min 70% 甲醇： -20℃(-35℃)脱水15min 80% 甲醇： -20 ℃ (-35 ℃ )脱水 15min 95% 甲醇：-20℃(-35℃)脱水15min

甲醇：-20℃(-35℃)脱水3x15min 100%

100% 甲醇： K4M=1:1：-20℃(-35℃)渗透1h 100% 甲醇： K4M=1:2：-20℃(-35℃)渗透1h 100%甲醇：K4M=1:3：-20℃(-35℃)渗透1h 纯K4M：-20℃ (-35℃) 渗透1h 纯K4M：-20℃(-35℃) 渗透过夜 合 48h RT 聚合 12h

紫外光 (360nm ）离光源 20-30cm ℃聚 ，-354. 免疫胶体金标记 4.1封闭

将含有超薄切片的镍网倒扣在20ul大小的封闭液液滴上，常温封闭10min。封闭的主要作用是封闭抗原以外的位点，以减少抗体的非特异性吸附。在封闭液中加入1%的冷水鱼凝胶，能起到更好的封闭效果。

注意事项：封闭液中的TritonX-100是一种表面活性剂，其能溶解脂质，增加抗体对细胞膜的通透性。Tween-20有复性抗原的作用，可提高抗原抗体特异性的识别能力。 4.2 一抗孵育

在胶体金标记实验中，一抗可以是兔源的多克隆抗体也可以是鼠源的单克隆抗体。多克隆抗体针对多个抗原决定簇，单克隆抗体针对一个抗原决定簇，所以一抗为多克隆抗体时，阳性率会增加。一抗的浓度，一般先稀释100-300倍，摸索最适浓度。孵育条件为4℃条件下过夜或常温2小时。

注意事项：为了保持抗体活性，抗体需分装保存，避免反复冻融。 4.3 二抗孵育

二抗是偶联胶体金颗粒的蛋白A。用于标记的胶体金颗粒的大小为5-18nm。二抗的稀释浓度为稀释至淡淡的浅红色即可。

注意事项：a膜蛋白的标记一般选用颗粒相对小的胶体金颗粒。b 抗体现用现稀释，12000rpm/5min离心后再使用，以去除金颗粒聚集体。 4.4 染色

二抗孵育后，先用0.01MPBS（pH7.4）漂洗6x2min；再用2.5%戊二醛固定10min双蒸水漂洗4x2min。由于K4M是亲水性包埋剂，采用醋酸铀和柠檬酸铅双染色时[9,10]，染色时间需要相对减少。一般铀染5min，水洗6x2min；再铅染3min，水洗6x2min。

注意事项：戊二醛固定的目的是为了保证抗原抗体结合的稳定性，双蒸水洗涤目的是去除溶液中盐离子，防止干扰后续的染色。染色液用前需要12000rpm/5min离心。

注意事项：a 免疫胶体金标记实验需要设置两个阴性对照，一个阳性对照。设为阴性对照的样品分别指不加一抗，不含靶抗原的样品；设为阳性对照的样品指肯定含有靶抗原的样品。b 做电镜的免疫胶体金标记之前，需要先做光镜下的免疫标记，只有在光镜下得到理想的标记效果后，在电镜下的免疫标记就没有必要进行了。c戊二醛会产生自发荧光，因此用于光镜实验的固定液不能含有戊二醛，一般用3%多聚

甲醛。

超薄切片（100nm） 0.01MPBSpH7.4（1%BSA+0.05%Tritonx-100 +0.05%Tween 20）封闭 倒扣5min，RT

一抗0.01MPBSpH7.4（1%BSA+0.05%Tween 20））稀释100-300倍，RT孵育2h或 4℃过夜

洗涤6x2min，RT 0.01MPBSpH7.4

二抗 0.01MPBSpH7.4 （ 1%BSA+0.05%Tween 20 ） ）稀释 50倍，RT孵育1h

6x2min 0.01MPBSpH7.4 洗涤 ， RT

0.01ddH2OpH7.4 洗涤 6x2min ， RT

镍网干燥后双染色

超薄切片（100nm） 0.01MPBSpH7.4（1%BSA+0.05%Tritonx-100 +0.05%Tween 20）封闭 倒扣5min，RT

一抗0.01MPBSpH7.4（1%BSA+0.05%Tween 20））稀释100-300倍，RT孵育2h或 4℃过夜

洗涤6x2min，RT 0.01MPBSpH7.4

二抗 0.01MPBSpH7.4 （ 1%BSA+0.05%Tween 20 ） ）稀释 50倍，RT孵育1h

6x2min 0.01MPBSpH7.4 洗涤 ， RT

0.01ddH2OpH7.4 洗涤 6x2min ， RT

镍网干燥后双染色

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