固相合成
更新时间:2024-03-05 05:38:01 阅读量: 综合文库 文档下载
多肽固相合成的一般方法
1.1 材料与试剂 1.1.1 树脂
二氯三苯甲基树脂(以下简称二氯树脂)和Wang树脂在多肽的固相合成中应用最为广泛,反应条件温和,价格低廉。将这两种树脂与Fmoc-氨基酸通过共价键连接,得到相应的氨基酸树脂。其中二氯树脂与氨基酸的连接反应是一个不可逆的取代反应,Wang树脂与氨基酸的连接反应是一个可逆的酯化反应,因此理论上要比二氯树脂的性能要优于Wang树脂。孙立枢等通过实验也发现以二氯树脂作载体,第一个氨基酸的连接率,以及目标肽的纯度和产率都要明显高于Wang树脂。郑彦慧等对Rink Amide(氨基树脂)的研究发现合成多肽时低取代度(即树脂的loading值低)、高溶胀度的树脂能获得较好的肽收率。
1.1.2 氨基酸
根据氨基酸的α-氨基的保护基不同,可分为Fmoc-氨基酸和Boc-氨基酸两种,本实验室采用的是Fmoc-氨基酸。很多氨基酸不仅α-氨基需要保护,其侧链上的氨基也要保护以有利于合成环肽或避免干扰反应。例如:Fmoc-Lys(alloc)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Asp(oall)-OH等等。
1.1.3 溶剂
实验中主要使用的溶剂有DMF,DCM,MeOH。DMF能很好地溶解氨基酸,以及用语Wang树脂的溶胀。DCM用于二氯树脂的溶胀,并且在氨基酸反应时加入密度较大的DCM有利于树脂飘浮起来。MeOH对树脂的作用于DMF、DCM相反,它使树脂收缩,因此在合成直链肽的最后常用MeOH与DCM交替冲洗树脂,树脂在一胀一缩中被彻底地清洗干净。
1.1.4 缩合剂
由于缩合方法不同,缩合剂也有多种。常见的有:HATU,HBTU,TBTU,DIC,HOBt(偶联助剂,常与其他缩合剂组合使用),DMAP等等。针对要连接的氨基酸序列的不同可选用不同的缩合剂。
1.1.5 有机碱
有机碱为反应提供了碱性环境,有利于游离-NH2的稳定。可选择NMM,DIEA等。
1.1.6 检测液
Kaiser Test 的检测液有A、B、C三种液体: A液——20%无水乙醇+80%苯酚
[7]
[6]
B液——吡啶
C液——5g茚三酮+100ml无水乙醇。 检测时加入顺序没有限制。
1.1.7 脱保护液
哌啶溶液:30%六氢吡啶+70%DMF。
1.1.8 切割液
切割液分为E液、F液和全保护切割液。
E液的成分为:TFA87.5%,H2O2.5%,苯酚2.5%,EDT2.5%,苯甲硫醚2.5% F液的成分为:TFA95%,H2O2%,Tis3%
全保护切割液的成分为:DCM98%,TFA2% 或者 TFA82.5%,H2O2.5%,EDT5%,苯酚5%,苯甲硫醚5%
针对不同的氨基酸序列选择不同的切割液,本实验使用的都是F液。
1.2 仪器与设备
上海舜宇恒平科学仪器有限公司电子天平 郑州长城科工贸SHB-III 循环水式多用真空泵 国华TBZ-82A恒温振荡器
瑞江RJ-TDC-40B低速离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司) 日本SHIMADZU公司LCMS-2020质谱仪
日本SHIMADZU公司高效液相色谱仪,SPD-10AVP紫外可变波长检测器,LC-10AVTP泵
1.3 操作流程 1.3.1 合成
多肽固相化学合成法,主要可以分为Boc方法和Fmoc方法。α-氨基用Boc(叔丁氧羰基)保护的称为Boc固相合成法,α-氨基用Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的称为Fmoc固相合成法。具体而言,首先对组成目的肽的氨基酸进行改造,使其成为氨基末端带有保护基的氨基酸。将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(树脂)相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一
过程,直至目的肽形成为止。接着目的肽从树脂上裂解,进行氧化折叠,这样得到了人工合成肽的粗产品。再进行纯化,化学修饰,最后进行活性鉴定。
树脂+Fmoc-氨基酸+溶剂+缩合剂+有机碱 ← ← ← ← ← ←
↓ 通N2,20~30分钟 ↑
↓ Kaiser Test 检测,3分钟 ↑
[9]
[8]
树脂透明(连上氨基酸)↙↘(未连上氨基酸)树脂深蓝色或黄色 ↑
洗去反应残留液↓ ↓洗去反应残留液 ↑ 脱保护,30分钟↓ ↘ → → → → → → → → → 洗去脱保护液↓
加入下个Fmoc-氨基酸+溶剂+缩合剂+有机碱,重复以上步骤直到连上最后一个氨基酸 MeOH与DCM交替洗树脂↓
抽干,得连有多肽的树脂,称量
1.3.2 切割
上一步中得到的树脂+切割液
摇床中反应2—2.5小时,离心↓
上清液+乙醚 离心↓ 沉淀+乙醚 离心↓ 沉淀+乙醚 离心↓ 沉淀+乙醚 离心↓ 得沉淀,干燥
↓
质谱检测
↓
高效液相色谱检测
正在阅读:
固相合成03-05
2011-2012学年第一学期深圳宝安区高三调研测试卷03-20
《商务礼仪》期末试题及答案8639305-07
儿科学考点速记口诀01-04
监理月报第8期-文化艺术中心12-14
王远方故意杀人案庭审笔录07-08
13-14(2)概率(A)试卷A 正考03-28
- 多层物业服务方案
- (审判实务)习惯法与少数民族地区民间纠纷解决问题(孙 潋)
- 人教版新课标六年级下册语文全册教案
- 词语打卡
- photoshop实习报告
- 钢结构设计原理综合测试2
- 2014年期末练习题
- 高中数学中的逆向思维解题方法探讨
- 名师原创 全国通用2014-2015学年高二寒假作业 政治(一)Word版
- 北航《建筑结构检测鉴定与加固》在线作业三
- XX县卫生监督所工程建设项目可行性研究报告
- 小学四年级观察作文经典评语
- 浅谈110KV变电站电气一次设计-程泉焱(1)
- 安全员考试题库
- 国家电网公司变电运维管理规定(试行)
- 义务教育课程标准稿征求意见提纲
- 教学秘书面试技巧
- 钢结构工程施工组织设计
- 水利工程概论论文
- 09届九年级数学第四次模拟试卷
- 合成
- 浅谈家庭教育对聋童健康心理发展的促进
- SPSS17.0统计软件使用指导 全面的指导
- 体育学院理论课教案本 - 图文
- 学会用腹部呼吸 边走边瘦
- 使用IAR移植ucos到stm32的步骤
- 某市政工程质量评估报告
- 数字化设计与制造的国内外发展现状及趋势
- 厦门大学门户网站设计
- 2008年高教社杯数学建模成绩表(word格式) - 图文
- Multiple chioces
- 数据挖掘数据预处理
- 干部作风调查问卷
- 离心压缩机操作手册(透平机)
- 广西壮族自治区防治传染性非典型肺炎
- 第三课 走向社会主义现代化建设新阶段
- 专职辅导员招聘笔试试题
- 深汕特别合作区人防工程方案报建登记表
- 过场控制课后习题
- 2014年金属工艺学试卷B
- 危险化学品生产单位安全管理人员网上考试初训题库试题(附答案)