表观遗传学的结构机理研究2009CB825500-G

项目名称： 表观遗传学的结构机理研究 起止年限：依托部门：许瑞明 中国科学院生物物理研究所 2009.1至2013.8 中国科学院

首席科学家：

一、研究内容

本项目的主要研究内容是以X光晶体学方法为主要研究手段，结合其它生物物理和生物化学方法，深入研究以下几项表观遗传学的重要问题：

组蛋白修饰酶的反应机理和底物特异性

主要几类组蛋白共价修饰有乙酰/去乙酰化、甲基/去甲基化、磷酸/去磷酸化、泛素/去泛素化。其中组蛋白的乙酰/去乙酰化和甲基/去甲基化是近年来表观遗传学的研究热点，这也是本项目的研究焦点。尽管这方面的结构研究已有一定的进展，但还有一些重要的问题并不清楚。例如组蛋白H3的第四个赖氨酸(H3K4)和H4K20的三甲基化酶的结构和反应机理还有待解析；到目前为止H3K36和H3K27的甲基化酶识别其对应的赖氨酸的机理也不清楚。我们将着重研究H3K4、H3K36、H3K27和H4K20的甲基化和去甲基化酶的结构机理研究。同时，我们也将进行对组蛋白乙酰/去乙酰化、泛素/去泛素化和磷酸化酶的复合物的结构和功能的深入研究。

修饰后的组蛋白识别

目前已知的识别组蛋白乙酰化的有Bromo结构域，识别甲基化后赖氨酸的有Chromo,Tudor,PHD,WD40等结构域。其中有的PHD和WD40结构域也和未修饰的组蛋白结合。可以预测的是同一个修饰过的组蛋白末端残基将有不同蛋白质中的以上或全新的结构域识别。例如甲基化后的H3K4可被PHD和Tudor结构域识别。更重要的一个科学问题是一个组蛋白上的多个或多种修饰是怎样被同时识别的。本项目将发展化学生物学新方法来制备有关的组蛋白样品，利用Ｘ光晶体学、电镜和生物化学、分子生物学方法来研究组蛋白多种修饰的共识别以及新发现的单识别模式，例如PCL的PHD结构域与甲基化后的H3K27的结合。

组蛋白修饰酶的活性调控和蛋白质－蛋白质相互作用

有些组蛋白酶，例如大部分乙酰化酶和甲基化酶，单独就具有酶活性；而另一些组蛋白酶，例如大部分去乙酰化酶和部分甲基化酶和乙酰化酶，只有与其它蛋白质形成复合体时才有酶活性。还有一种情况就是复合体的形成大大地提高了酶活性。组蛋白修饰酶复合体里亚基之间的相互作用是怎样激活或者提高组蛋白修饰酶的活性的结构机理研究在国际上到目前为止还是空白，这也是本项研究的重点。同时，我们也将紧密追踪表观遗传学发展新动向，对于新发现的重要的组蛋白修饰酶与其它蛋白的相互作用，包括HDAC与含PDZ结构域蛋白质的相互作用，及时地阐明它们的结构机理。

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基于组蛋白修饰酶的药物设计

很多组蛋白修饰酶在疾病发生中有很大的作用。例如H3K4，H3K36和H3K79甲基化酶MLL，NSD1和hDot1L在白血病里，而H3K9和H3K27甲基化酶SUV39和EZH2在多种癌症里都有很大的作用。我们过去的结构生物学研究都涉及了相关的甲基化酶。我们将在本项目里继续深入研究与重大疾病相关的组蛋白修饰酶的结构和功能，利用所得到的结构信息用计算生物学和化学生物学的方法进行药物设计的初期研究。

以上几个方向将是本项目今后五年的研究重点。为了给进一步深入研究打下基础，我们也将同时开展蛋白质与核小体复合体的探索性研究。这项研究的意义是尽管核小体的晶体结构解析已完成10年多了，到目前为止唯一只有一个与短肽结合的复合体结构被解析。染色质的高级结构及其调控涉及到多种不同的蛋白质与核小体的相互作用，所以这方面的研究将是今后表观遗传学结构机理研究的重点。我们的先期研究工作将从技术层面上探索单个和多个核小体，尤其是包括修饰后的组蛋白的核小体的高效重组途径。

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二、预期目标

1、总体目标

本项目的总体目标是使我国在表观遗传学的结构机理研究水平跻身于国际先列。具体的目标为：(1)通过不懈的努力在表观遗传学机理研究领域做出几项有标志性的工作。我们选择的突破口为组蛋白修饰酶的复合体结构，蛋白质和核小体的复合体结构，以及异染色质(heterochromatin)的三维结构研究。(2)在组蛋白修饰酶的催化机制和底物识别机理，以及修饰后的组蛋白的识别研究做作出广泛的贡献。(3)利用所获取的与人类健康和疾病有重大关系的蛋白质三维结构信息开展药物设计研究。(4)通过本项研究建立起一只多学科相互合作的高水平表观遗传学研究队伍，培养一批勇于探索、求是创新的年青研究人才。

2、五年预期目标

我们期望完成10个以上在表观遗传学里有重要作用的蛋白质和蛋白质复合体的结构和功能研究。力争部分工作在高影响力的国际杂志(例如Nature, Science，Cell)上发表。建立起系统地表达组蛋白修饰酶以及在表观遗传学里有重要作用的蛋白质的表达、纯化、结晶和功能分析平台。探索重组核小体以及包括修饰后组蛋白的核小体的有效途径，为进一步研究蛋白质-核小体相互作用开创局面。从已知化合物文库中筛选出2?4个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物；用计算机辅助设计，合成，得到一组结构全新的、针对HDAC小分子抑制剂；并进行结构修饰和优化。为深入开展多学科合作、高复杂性的表观遗传学结构机理研究打下深厚的基础。

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三、研究方案

1、总体研究思路

本课题选择在表观遗传调控过程中具有重要生物学意义、与重大疾病的发生和发展

相关的蛋白体系为研究对象，特别是对一系列组蛋白修饰酶和与其相互作用的调控蛋白的结构和功能研究。我们将运用现有的各种基因克隆、蛋白质表达和纯化技术获取大量蛋白质和蛋白质复合物的样品；运用X-射线晶体衍射法和溶液NMR方法测定它们的晶体结构或溶液动态结构，通过结构分析揭示组蛋白修饰酶的活性中心组份和结构、底物和产物特异性的决定因素、蛋白质-蛋白质相互作用的位点、作用的方式、以及调控网络关系；我们将用化学生物学的方法合成有活性的修饰后的组蛋白将其作为组蛋白去甲基化和去乙酰化酶的底物，用来制备修饰过的核小体和提供表观遗传细胞生物学研究的新手段；冷冻电镜的手段来研究表观遗传中的大复合体和染色质的高级结构；结合结构生物学、化学生物学和药物化学的方法进行药物设计和筛选。同时，我们也将运用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物信息学等方法对于组蛋白修饰酶和相关的复合物进行基于结构信息的功能研究，这包括利用模式生物C.elegans的研究平台探索组蛋白的表观遗传修饰在个体发育，尤其是C.elegans寿命，性腺发育和生殖发育中的调控作用。

2、技术路线

本课题主要运用同生物信息学、分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、结构生物学和其它生物物理等方法, 针对一些参与组蛋白修饰过程并具有重要生物学意义与重大疾病相关的蛋白和蛋白复合物，开展功能、结构、相互作用关系、分子作用机制、以及临床应用可能性的研究。主要研究方法和技术路线概述如下：

（1）可溶性蛋白质和蛋白质复合物样品的制备

为获得可用于结构和功能研究的大量可溶性蛋白质，我们将首先在大肠杆菌体系中构建和表达目标蛋白。同时，对一些溶解性差、表达量低的蛋白质，我们将尝试其它的原核和真核表达载体和系统（包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞），表达不同标签的融合蛋白以及无细胞体外蛋白表达系统等进行表达条件的摸索。一旦表达成功，我们将尝试不同的蛋白质分离和纯化方法（包括亲和柱层析、离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛柱层析），以期获得具有活性、且适合于结构和功能研究的蛋白质。对功能特别重要的蛋白质或蛋白质结构域，如有必要，我们将根据生物信息学预测的二级结构，对蛋白质表面上一些氨基酸进行突变和修饰，以增加蛋白质的可溶性和稳定性。

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为获得稳定的、均一组分的蛋白质复合物，我们将尝试不同的原核和真核表达系统和载体（包括共表达）、不同的分离和纯化方法，并通过酵母双杂交、体外Pull-down和共沉淀加以验证，以获得具有活性、且适合于结构和功能研究的稳定蛋白质复合物。另外，我们将运用生物信息学方法构建蛋白-蛋白相互作用的模型，并根据相互作用方式对蛋白质表面上一些氨基酸进行突变和修饰，以增加蛋白-蛋白之间的相互作用能力，有利于蛋白质复合物的形成。此外，运用最新发表的以相图为基础的生物大分子“可结晶性”的新概念提高蛋白质晶体生长的成功率。

为保证实验的成功，我们将同时开展对一些具有重要功能的蛋白质结构域的克隆、表达和纯化的工作，由于目前对这些含有多结构域的大真核蛋白质的结构域的划定尚不明确，我们将运用生物信息学的方法来帮助进行蛋白质的结构域预测，并通过系统的片段缺失和点突变筛选，寻找具有合适大小和功能的蛋白质结构域进行研究。

（2）稳定蛋白质及蛋白质复合物的晶体生长和结构解析

一旦获得可供结构研究的蛋白质和稳定蛋白质复合物样品，我们将运用动态光散射仪对蛋白样品的溶液状态进行分析，考察其是否处于均一状态，在不同条件（温度、浓度、pH等）下的稳定形态和凝聚状态，同时运用溶液光谱（包括CD光谱和荧光光谱）方法分析蛋白质在溶液中的构象变化。综合各种因素，初步确定适合于结晶实验的条件。然后，进一步摸索晶体生长的条件，尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、pH和缓冲体系、以及不同添加剂等，得到高衍射质量的晶体用于X-射线衍射分析。一旦获得蛋白晶体，将利用X-射线衍射仪进行初步衍射实验，以帮助进行结晶条件的优化和低温冷冻条件的筛选。具有高衍射能力的蛋白晶体将运用国内外同步辐射光源进行高分辨率的X-射线衍射数据的收集。并运用单波长反常散射法、多波长反常散射法、同晶臵换法、和分子臵换法解析各种蛋白和蛋白复合物的三维晶体结构。

(3) 蛋白动态复合物相互作用介面的结构与动力学研究

溶液NMR技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用、测定蛋白质-蛋白质复合物三维结构的很有用的工具。根据蛋白质-蛋白质相互作用的强度，可选择相应的NMR技术来研究蛋白质-蛋白质的相互作用，如化学位移扰动法、分子间转移NOE(TRNOE)、酰胺质子交换率扰动法、横向或纵向弛豫速率扰动法、线宽变化、分子间饱和转移、分子间NOE等，以及各种各样的滤波或半滤波技术（ filter or half-filter）。

细胞内许多蛋白质之间存在着很弱的相互作用（解离常数Kd > 10-6 M），只能形成低亲和力的、瞬时复合物，但这些瞬时复合物在细胞活动的分子调控中发挥着相当重要的作用。

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我们将选择分子量合适的蛋白质-蛋白质复合物，运用异核多维NMR技术，在接近生理条件的溶液状态下，研究这些蛋白质-蛋白质复合物，特别是低亲和力的、瞬时蛋白质复合物的动态结构和性质、蛋白质-蛋白质相互作用的分子机制，探测蛋白质-蛋白质是否发生相互作用及其亲和力（Kd）、蛋白质-蛋白质的结合界面等。通过测定分子间的NOE确定蛋白质分子之间的距离约束，在稀释的定向介质中,如磷脂双层混合胶粒（Bicelle bicelle）, 聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）, 纤维状病毒（Filamentous viruses）等, 测定残留的偶极耦合常数(residual dipolar couplings)以确定蛋白质分子之间的相对取向，从而获得蛋白质-蛋白质复合物的空间结构。

蛋白质-蛋白质的相互作用往往会引起蛋白质动力学的改变。NMR技术被广泛地用来揭示蛋白质分子和蛋白质-蛋白质复合物的动力学特征。我们将利用异核多维NMR弛豫测量实验，研究皮秒-纳秒时间尺度的蛋白质分子结构的柔性与运动性，以及微秒-毫秒时间尺度的构象交换。通过改变实验条件（如实验温度、蛋白质浓度、pH值、配基类型等），研究蛋白质-蛋白质相互作用过程的热力学、动力学和分子作用机理。

（4）大复合体的冷冻电镜研究

冷冻电镜方法结合三维重构是近年来发展迅速并正在取得重要突破的技术。和其它方法相比，它具有以下几个方面的优势：1.保持生物样品的活性和功能状态；2.无须制备晶体，特别适合难于结晶的大分子及其复合物的三维结构判定；3.可以做到制样，数据收集，三维重构全过程自动化，为高通量的大分子及其复合物的快速三维结构解析打下基础。同时，随着设备的改进和技术的提高，电镜三维重构的分辨率也迅速提高。现在最高精度已经达到约4A左右。我们将用冷冻电镜方法来研究蛋白质复合体里各亚基之间的空间关系、蛋白质复合体与核小体的相互作用、染色质的高级结构和不同活性状态下的染色质三维结构形态的变化及染色质变化动力学。

（5）组蛋白修饰酶活性测定和蛋白质复合物的功能分析

我们将利用成熟的甲基化／去甲基化酶、乙酰／去乙酰化酶、泛素化连接酶/去泛素化酶、激酶等酶活性测定方法来鉴定和比较野生型和突变型的酶活性差别、以及单体和复合体中的酶活性差异。以下方法将用来测定蛋白质-蛋白质相互作用和寻找与已知功能蛋白质相互作用的蛋白和蛋白复合物： 表面等离子共振（SPR)；酵母双杂交（two-hybrid）系统、体外Pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）、二维电泳、TAP和质谱等功能蛋白质组学的方法。

我们将通过对蛋白和蛋白复合物的晶体结构的分析，找出在蛋白的生物功能和蛋白-蛋白相互作用中发挥重要作用的氨基酸，运用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和

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其它生物学和生物物理学方法加以验证；阐述蛋白生物功能的分子基础和作用机理；在细胞水平上验证我们的假设和理论，并且构建相应的基因缺失或基因转染的模式生物，筛选不同表型，建立重要蛋白的功能与疾病的发生和发展的关系。

（6） 体内合成有活性的含共价修饰的组蛋白的化学生物学方法

具体的做法是修改大肠杆菌或其它细胞内的遗传密码，使得无义的“UAG”密码对

应于感兴趣的非天然氨基酸。筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶的技术路线如下：首先在目标细胞中引入一个外源的氨酰-tRNA合成酶 和tRNACUA, 在目标细胞中外源的氨酰-tRNA合成酶和tRNACUA保持活性，但不与内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA反应，这个条件称为生物正交性。之后还要改变氨酰-tRNA合成酶的专一性,使其只催化tRNACUA与非天然氨基酸发生氨酰化反应。采取的方法:一是将 氨酰-tRNA合成酶 活性部位5-6个氨基酸残基进行PCR随机突变建立氨酰-tRNA合成酶突变库。然后对氨酰-tRNA合成酶突变库使用正负双向选择法：正选择得到对天然氨基酸或非天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶，主要是通过构建一个含有UAG密码子的氯霉素乙酰转移酶，如果无氨酰-tRNA合成酶活性，则细胞无法表达全长的氯霉素乙酰转移酶而无法存活。负选择剔除掉对天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶，识别内源的天然氨基酸的质粒编码一种细胞内毒素而死亡。 最终得到只对非天然氨基酸有专一性的氨酰-tRNA合成酶。凝胶电泳和质谱实验验证最终将非天然氨基酸通过特殊密码子UAG添加到蛋白质链中。

（7）基于表观遗传调控的药物开发前期工作

我们将用四种途径初步筛选出一系列的候选小分子：1）基于蛋白质结构的计算机虚拟筛选；2）基于化学小分子文库的高通量药物筛选；3）基于靶蛋白结构，合理设计针对性强的、结构新颖的小分子抑制剂；4）对于已知的小分子抑制剂做结构和性能改良。以下是以去乙酰化酶HDAC8为例的几种筛选途径的典型步骤：

a）基于靶蛋白HDAC8的结构模型，通过对已知活性部位和结构表面的分析，得到几个潜在的小分子结合位点；

b）选定一个规模合适的小分子结构库，将库中的每个小分子和几个潜在的结合位点进行快速的对接，初步筛选出一系列的候选小分子；

c）对这一系列的候选小分子，进行较精细的分子对接，将候选小分子规模缩小到实验容许的水平；

d) 然后检验候选小分子是否有生物学活性（具体见课题六研究内容）；

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基于化学小分子文库的药物筛选

我们将使用具有一定规模的化合物文库进行高通量的HDAC抑制剂筛选。中山大学正在建设一个约有6万个小分子化合物的文库可供使用。中科院药物研究所也具有一个规模可观的小分子化合物的文库。中科院广州生物医药与健康研究院的丁克教授愿意提供一个小规模的小分子化合物的文库（约6000个化合物）。对候选小分子化合物的生物学活性再进行系统检测 （具体见课题六研究内容）；

基于靶蛋白结构，合理设计、合成针对HDAC8的结构新颖的小分子抑制剂 a）对筛选得到的先导化合物，通过分子叠合等方法构建出小分子的三维药效团； b）通过计算模拟的方法揭示小分子结合部位和三维药效团之间相互作用的分子机制； c）根据靶蛋白结合部位和三维药效团之间的作用模型设计出更合理有效的小分子抑制剂。

d) 根据上述设计，利用组合化学方法合成化合物；

e) 对所合成的小分子化合物的生物学活性再进行系统检测（具体见课题六研究内容）； 通过对SAHA等HDAC潜在广谱类抑制剂进行结构改造，得到起专一性抑制作用的小分子

a）建立SAHA或其他的HDAC广谱类抑制剂和HDAC8的相互作用的可能的分子模型； b）从分子模型出发，修改广谱类抑制剂的药效基团，通过自由能计算等方式提高小分子的结合专一性；

c）对设计的结果通过对组蛋白乙酰化测定观察这些化合物对HDAC的抑制效应，迭代这一过程，逐步保留对HDAC8特异性升高，对其他组蛋白去乙酰化酶特异性减弱的操作。

3、 项目创新点

本项目的主要创新点在于瞄准表观遗传学的分子机理这个重大前沿科学问题进行系统性、系列性、多层次、多方面的研究。本项研究对象包括了所有常见的组蛋白修饰酶；研究对象的复杂性包括了从单个蛋白质或其中的结构域到多蛋白复合体以及蛋白质复合体与核小体的结合；研究的手段包括X光晶体学、核磁共振、冷冻电镜等主流结构生物学研究手段，以及生物化学、化学生物学、细胞生物学、遗传学、药学等方法。研究目标从搞清楚组蛋白的赖氨酸上加一个还是三个甲基到组蛋白修饰对于ＤＮＡ损伤应答和mRNA转运调控的影响以及抗癌药物的开发。我们相信，这样的课题选择和科研力量的凝聚是开展原始创新的基础研究的一大特色，也是促进有自主产权的药物开发的动力。

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4、取得重大突破的可行性分析

我们对于本项研究取得突破性进展充满信心，原因是：1）本项目有一支在表观遗传结构机理研究有深厚基础的充满活力的年青研究队伍。这支队伍已在组蛋白甲基化酶、去甲基化酶、去乙酰化酶的结构里已取得了国际领先的成绩。本支队伍的成员也在化学生物学里开拓了一个应用广泛的原创性领域、在利用冷冻电镜进行高精度结构解析方面作出的举世瞩目的贡献、在蛋白质-蛋白质相互作用和在肿瘤的靶向治疗和药理研究的一系列先进工作。这些成绩和研究经验是本项目成功的基础。2）本项目的课题选择瞄准了表观遗传学这个重大科学问题的前沿。同时，这些课题也是切实可行的。每个课题组都已在相关的领域有深厚的积累和基础。有相当多的蛋白已经表达成功，而且个别蛋白质晶体已经得到。3）本项目的几个课题组具有互补的技术优势。这对于合作研究和攻关一些技术难度高、科学意义重大的课题，例如高分辨率的染色质高级结构，将有不可取代的优势。 5、课题设臵

本项目的主题内容是综合结构生物学手段、其它生物物理和生物化学方法来揭示表观遗传学的一些重要机理。本项目的六个课题利用X光晶体学、核磁共振、冷冻电镜等主流结构生物学研究手段，以及生物化学、化学生物学、细胞生物学、遗传学、药学等方法从多方面、多层次来探寻表观遗传学的分子机理。具体的课题设臵见下：

课题一、几种主要组蛋白修饰(甲基化/去甲基化,乙酰化/去乙酰化)的催化机制和调控的结构机理研究

组蛋白修饰酶的结构和功能研究是表观遗传学的重要组成部分，也是国际上近年来的研究热点之一。本课题的研究目的是从原子分辨率的尺度上来揭示在表观遗传中至关重要的几类常见组蛋白修饰酶(包括甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰转移酶和去乙酰化酶)的催化机制、底物特异性和酶活性调控机理。本课题研究的结果将有助于提高对于表观遗传这一重要生命现象的理解，为以干预表观遗传系统为目标的药物研发提供结构信息。这项研究也将为我们的长期目标，也就是揭示染色质的高级结构及其从11纳米核小体串结构到高级结构的调控机理，打下坚实的基础。

主要研究内容：

一、组蛋白甲基化的结构基础

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（1）组蛋白甲基转移酶的产物和底物特异性。

有些甲基转移酶可以做单甲基化，而另一些酶可进行多甲基化。不同状态的组蛋白甲基化在细胞里起到的表观遗传调控作用效果大不相同。已有一些研究证明有些酶的活性中心的大小的细微变化，例如一个苯丙氨酸与酪氨酸的区别，就能影响到甲基转移酶的产物特异性。但是在体内不同状态的甲基化是由不同的甲基转移酶或者由不同组份的甲基转移酶复合体完成的。本课题将着重研究H3K4和H4K20的多甲基化分子机理。我们选择这两个位点的多甲基化机理研究的一个原因是它们的单甲基化酶，Set7/Set9和Set8的三维结构已被解析，而它们的多甲基化酶PRDM7/PRDM9和Suv4-20的结构信息还一无所知。我们将结合X光晶体学和生物化学的手段来揭示这两个多甲基化酶的分子机理，包括活性中心组份和结构、以及产物特异性决定因素。比较单和多甲基化酶的活性中心结构差异，并利用这些差异来设计能区分单和多甲基化酶的小分子抑制剂，这将是一件十分有意义的表观遗传学的生物技术和医学应用。

组蛋白甲基化酶和去甲基化酶具有高度的底物特异性，而目前只有一部份的甲基化酶和极少数的去甲基化酶与其底物结合的特异性得到了阐明。在以上的PRDM7/9和Suv4-20的结构研究中，我们还将利用所得到的结构信息进行定点突变和共结晶研究，目的是揭示这些酶的底物特异性的决定因素。另外有一类组蛋白甲基转移酶不识别孤立的短肽片段而需要整个核小体作为底物，已知的例子包括H3K27，H3K36和H3K79的甲基转移酶。蛋白质与核小体复合物的结构研究难度较大，而且在国际上还研究得很少。这也是我们希望作为领先国际研究水平的一个突破口。所以，本子课题的一项内容就是开展核小体的制备工作并用之于与组蛋白质修饰酶或其它蛋白的共结晶。

（2）组蛋白甲基化酶的调节

组蛋白修饰酶的活性调控机理结构研究在国际上还是空白，填补这项空白、促进这方面的研究壮大发展是本项研究的一个重要目标。有的组蛋白修饰酶在单体时不具有活性或者只有很弱的活性，而与其它蛋白结合后其酶活性就被激活了或者大大提高了。这种酶活性调控机制是细胞内表观遗传调控的一种体现，具体的例子包括：大部分组蛋白去乙酰化酶，如HADC1-3与含WD40 repeat和SANT结构域的蛋白质的相互作用，SIR2与SIR4的相互作用等；一部分乙酰转移酶，例如酵母中的Hat1与Hat2以及 Sas2与Sas4-Sas5的相互作用；本子课题集中研究一部分重要甲基转移酶的调控，而且这研究思路也贯穿到后面的对组蛋白去甲基化酶和乙酰化/去乙酰化酶的研究。我们选择MLL复合体作为对甲基转移酶调控研究

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的标本。MLL复合体的中心组份包括MLL，WDR5，RBBP5和ASH2L。其中MLL是H3K4的催化亚基，但它单体并没有活性。MLL与WDR5和RBBP5结合后的复合体具有H3K4双甲基化的活性，而再与ASH2L结合后就能使H3K4三甲基化。我们的目标是寻找以下两个重要问题的答案：1) WDR5和RBBP5的结合是如何激活MLL的酶活性的？2)ASH2L是怎样使MLL复合体作H3K4三甲基化的？由于MLL在许多白血病发生中有很大的作用，而且是在真核细胞进化过程中保守的Trithorax蛋白的代表，其结构机理的研究具有深刻的科学意义和可观的应用前景。

二、组蛋白去甲基化的结构机理研究

组蛋白去甲基化酶是否存在曾经长时间困扰着表观遗传研究。现在已知的去甲基化酶包括LSD1和一大批含JMJC结构域的蛋白质。组蛋白去甲基化酶的结构研究才刚刚起步，目前已知结构的组蛋白去甲基化酶仅有LSD1和JMJC家族中的JMJD2A和JHDM1。还有很多的去甲基化酶的结构和反应机理有待解析。本课题的主要研究内容是以蛋白质X射线晶体学方法为主要研究手段，结合其它生物物理和生物化学方法，深入研究组蛋白去甲基化酶的结构及其复合物：

(1) 组蛋白去甲基化酶的催化核心结构以及与甲基化多肽的复合物结构

组蛋白去甲基化酶的结构研究才刚刚开始，还有许多非常重要的问题并不清楚，很多组蛋白去甲基化酶的结构和反应机理还有待解析；到目前为止，去甲基化酶识别其对应的赖氨酸的机理还不太清楚。除了已经解出结构的组蛋白去甲基化酶外，我们准备接着研究其它几类组蛋白去甲基化酶具有酶活性的核心结构，如JHDM2、SMCX和JMJD3家族等。我们将着重研究H3K4、H3K36、H3K27和H3K79去甲基化酶结构和复合物结构。通过复合物的结构研究组蛋白去甲基化酶的催化反应机理和底物特异性。

(2) 组蛋白去甲基化酶与蛋白质的相互作用

大部分组蛋白去甲基化酶，都能与一些蛋白质形成复合物，如LSD1，JHDM2、JMJD2家族蛋白可与雄性激素受体形成复合物。它们在疾病的产生中起着重要的作用。有些组蛋白去甲基化酶，如LSD1，单独就具有酶活性；而与其它蛋白质如雄性激素受体形成复合体后酶活性发生改变。还有一种情况就是复合体的形成可大大地提高了酶活性。组蛋白修饰酶复合体里亚基之间的相互作用是怎样激活或者提高组蛋白修饰酶的活性的结构机理研究在国际上到目前为止还是空白，这也是本项研究的重点。

我们也将与本项目的其它课题组合作，开展基于组蛋白去甲基化酶结构的药物设计工

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作。很多组蛋白去甲基化酶在重要疾病如癌症等的发生中起着关键的作用，如KDM5B去甲基化酶在乳腺癌，KDM4在食管癌、胃癌和前列腺癌等重大疾病中都有关键的作用。我们将利用本课题所得到的结构信息结合计算生物学和化学生物学的方法进行药物设计、抑制剂的寻找等初期研究。

三、组蛋白乙酰化/去乙酰化酶复合物的结构研究

组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是由多个蛋白组成的组蛋白乙酰化酶复合物作用于组蛋白上的赖氨酸来完成的。多个组蛋白乙酰转移酶的催化亚基的结构已得到解析，所以本课题将聚焦在复合体里蛋白质-蛋白质相互作用的结构和功能研究。我们选择三个有不同结构复杂性的复合物，包括Hat1-Hat2双聚体，Sas2-Sas4-Sas5三聚体和多组份的NuA4，作为我们的切入点进行这方面的研究。

在Hat1-Hat2双聚体里，已知三维结构的Hat1是催化亚基。Hat2是一个WD40-repeat蛋白。它与Hat1的结合使得复合体的酶活性比Hat1单体的活性提高上千倍，而其中的结构机理一无所知。这也是本课题研究期望回答的问题。其次，Sas2是Sas2-Sas4-Sas5复合体中的催化亚基。它与Sas4的结合是整个复合物酶活性的先决条件，而Sas5的加入极大地提高了这个乙酰转移酶复合物的酶活性。研究这三个蛋白质之间的相互作用对于这个复合物的酶活性的影响是本课题研究的另一项内容。

组蛋白乙酰化在激活基因表达中的作用与以ATP为燃料的核小体重构复合体(Nucleosome Remodeling Complex)的作用是分不开的，但人们对于这两个过程是如何紧密的耦合在一起的理解还极其有限。本课题重点以组蛋白乙酰化酶（HAT）复合物NuA4以及核小体重构复合物SWR1共享的Yaf9p和Swc4p为主要研究对象，开展对组蛋白修饰与染色体重构在基因表达调控中的关系的结构机理探讨。NuA4是一个较为重要的乙酰化酶复合体，其主要组份为Act1p, Arp4p, Eaf3p, Eaf5p, Eaf6p, Eaf7p, Epl1p, Esa1p, Swc4p,Tra1p,Vid21p,Yaf9p,Yng2p等蛋白质。NuA4 HAT复合物能在生物体内催化组蛋白H4第5位，第8位，第12位，第16位赖氨酸的乙酰化反应，并且进一步的研究表明：组蛋白H4上述位点的乙酰化赖氨酸对特定基因具有转录激活作用。在该复合物众多的蛋白质组分当中，仅Esa1p具有组蛋白乙酰化酶的催化活性，其余的蛋白质组分在实验过程中发现为该乙酰化酶复合体发挥生物学活性所必须。此外，Yaf9p以及Swc4p同时还存在于核小体重构复合物SWR1当中。SWR1复合体在基因的转录过程中催化组蛋白H2A与组蛋白类似物H2A.Z在细胞核内的臵换反应，使其形成含有特殊核小体的染色质结构，从而维持基因表

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达转录的水平。对于Yaf9p以及Swc4p是如何协调两种具有不同生物学功能的蛋白质复合体在复杂生物体内实现生物学反应的时间－空间顺序的结构机理的探讨是本课题研究的另一项内容。有意思的是，该复合物中的Yaf9蛋白质的结构根据预测为一种全新的折叠类型。搞清楚这一种折叠类型的蛋白质是否在基因表达和调控中有类似的功能也是非常有意义的。

主要目标

本课题的预期目标是在以上的每个方向里做出有代表性的结构工作，并且利用所得到的结构信息进行深入的生的化和体内功能研究。我们总体上期望解析5个以上新组蛋白修饰酶复合物结构，并利用所得到的结构信息对这些组蛋白修饰酶进行进一步的功能研究。所得到的蛋白质结构也将用于小分子干扰剂的发现和设计。由于H3K79，H3K27，H3K36，H4K20甲基转移酶hDot1，EZH2，Set2和Suv4-20的底物是核小体，所以我们也将开展核小体的制备和与核小体结合的复合体的研究。

承担单位

中国科学院生物物理研究所，中国农业大学

课题负责人

许瑞明

主要学术骨干

陈忠周、吴玮、赵武玲、许航、曾宗浩

经费比例

课题二、组蛋白泛素化的结构基础

组蛋白泛素化连接酶和去泛素化酶在DNA损伤修复、基因的转录调控以及mRNA转运过程中起着重要的作用，也是国际上表观遗传学研究的热点之一。但是目前国际上还没有人开展专门对组蛋白的泛素化连接酶、去泛素化酶及其与调控蛋白质的单体和复合物结构测定以及基于结构的调控机理研究。组蛋白的泛素化在DNA的辐射损伤和断裂损伤信号途径中起着重要的作用，DNA受到紫外照射后会发生胶连反应，在DNA产生紫外照射损伤后，组蛋白H3、H4的泛素化连接酶DDB－CUL4－ROC1能使组蛋白H3、H4泛素化，使DNA与组蛋白分离，因此其它DNA损伤修复蛋白能与DNA结合，行使修复功能。而当DNA产

28%

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生断裂损伤后，组蛋白H2AX的泛素化连接酶RNF8-UBC13能使其泛素化，然后招募其它的DNA损伤修复因子如53BP1、BRCA1、Rap80到断裂位点，行使修复功能。组蛋白泛素化连接酶复合物DDB1－CUL4－ROC1和RNF8－UBC13在不同的DNA损伤修复过程中起着重要的调控作用，测定这些组蛋白泛素化连接酶的单体和复合物的三维结构，对于了解这些组蛋白泛素化连接酶复合物的分子组装机制，复合物中各个亚基间的相互调控作用机理，以及其在DNA损伤修复过程中的作用机理有重要的意义。

组蛋白去泛素化酶在基因转录的激活、沉默以及mRNA转运途径中起着重要的调节作用。其中功能研究较多的是酵母组蛋白去泛素化酶UBP8和UBP10，而酵母作为一种模式生物，研究其蛋白的结构和功能对于研究此类蛋白在其他真核生物中的作用有着指导意义。UBP10能使端粒区的组蛋白H2B去泛素化，抑制端粒区基因的表达。除了使端粒区的基因沉默外，UBP10也能调控其它区域的基因表达。UBP8能使转录激活区的H2B去泛素化，激活基因转录。UBP8还能通过sgf11以及sus1与mRNA转运途径相联系，调控mRNA的转运。目前mRNA转运与表观遗传修饰调控蛋白复合物之间的联系机制还不清楚。测定这些组蛋白去泛素化酶及其与调控蛋白质复合物的结构，对于深入理解组蛋白去泛素化酶在基因转录和mRNA转运过程中的调控机理有着指导意义。

主要研究内容：

（1）在DNA损伤修复过程中起重要作用组蛋白泛素化连接酶及其调控蛋白单体的结构和功能研究

DNA损伤修复与衰老、肿瘤发生、辐射效应等都有密切的关系。人类遗传性疾病已发现4000多种，其中不少与DNA修复缺陷有关。DNA损伤速率大约是每个细胞每天50,000至500,000处分子损害，如果一些关键的癌基因受到未修复的损伤将给机体带来灾难性的后果，因此DNA损伤一直以来也是癌症研究的一个重要方面。虽然这方面的研究很多，但是对DNA损伤应答的分子机制特别是对这些DNA损伤应答途径中调控蛋白质及其复合物的结构仍然所知甚少。组蛋白的泛素化在DNA的辐射损伤和断裂损伤信号途径中起着重要的作用，例如在受到紫外照射后，组蛋白H3、H4的泛素化连接酶DDB1－CUL4－ROC1能使H3、H4泛素化，使组蛋白和DNA间的分离，协助DNA修复蛋白能结合到受损伤的DNA位点行使修复功能。CUL4－ROC1的底物很多，例如组蛋白H3、H4、P53等，目前其底物特异性决定因素仍然是研究的热点之一，有研究显示含有一类WD40－repeat motif的蛋白在CUL4－ROC1的底物识别过程中起着重要作用，但是还没有CUL4－ROC1和此类蛋白的复

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合物结构，这一类蛋白单体的结构报导也很少，测定含有WD40－repeat motif的蛋白单体的结构以及DDB－CUL4－ROC1的复合物结构，能揭示DDB－CUL4－ROC1识别底物组蛋白H3、H4的结构基础，并为研究CUL4－ROC1复合物底物特异性的决定因素奠定基础。而组蛋白H2AX的泛素化参与双链断裂DNA修复信号的传导，双链DNA断裂后首先引起H2AX磷酸化，MDC1与磷酸化的H2AX结合后募集组蛋白泛素化连接酶复合物RNF8－BC13，使H2AX泛素化后结合其他的DNA损伤修复因子如53BP1、BRCA1、Rap80等在断裂位点行使修复功能。因此本课题的一个研究内容就是研究这些组蛋白泛素化连接酶及相关调控蛋白质的复合物结构及其分子组装机制，阐明其在DNA损伤修复过程中的作用机理。在原子分辨率水平上为进一步研究癌症的发生机理和治疗方法打下基础。

（2）在基因转录和mRNA转运过程中起重要作用的组蛋白去泛素化酶及其调控蛋白单体和复合物的结构和机理研究

组蛋白去泛素化酶在基因转录的激活、沉默以及mRNA转运的过程中起着重要的调控作用，例如酵母的组蛋白H2B去泛素化酶UBP10在基因的转录，端粒和核糖体DNA区域的基因沉默，营养物质的转运和细胞凋亡过程中起着重要的调控作用。UBP10能使端粒区的组蛋白H3保持去甲基化状态，并且与端粒的沉默因子sir4结合，使sir4与其他的sir蛋白如sir2、sir3等结合形成沉默因子复合物，保持端粒区基因沉默。然而UBP10的调控作用并不局限于端粒区，在染色体的其他区域UBP10起作用的机理仍然所知甚少。组蛋白H2B泛素化水解酶UBP8通常存在于组蛋白乙酰基转移酶复合物SAGA中，通过sgf11、sus1和SAGA复合物的其余部分结合，UBP8的结合不影响SAGA的乙酰基转移酶活性。在转录起始后UBP8能和磷酸化的RNA聚合酶II的C端结构域结合，水解基因转录区域内的泛素化组蛋白H2B，激活基因转录延伸，调控SAGA依赖的基因转录。UBP8还能通过sgf11以及sus1与mRNA转运途径相关联，影响mRNA的转运，但是组蛋白去泛素化和mRNA转运途径联系的分子机制还不清楚。本课题的另一个研究内容就是解析这些组蛋白去泛素化酶及其调控蛋白质复合物的结构，从结构生物学的角度阐明其在基因转录中的调控机理，以及SAGA复合物中其它组分对UBP8功能的调控机制，揭示表观遗传修饰因子与mRNA转运过程中的相互作用机理。

主要目标

测定组蛋白泛素化连接酶及其底物连接蛋白如含有WD40－repeat motif蛋白的三维结构，阐述泛素化连接酶底物特异性的三维结构基础，揭示组蛋白泛素化连接酶及其调控蛋白在DNA损伤应答途径中的作用机制。

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测定组蛋白去泛素化酶UBP8、UBP10及其调控蛋白如sus1、sgf11的结构，阐明组蛋白去泛素化酶调控基因转录的结构生物学基础，揭示UBP8与乙酰基转移酶复合物SAGA相互作用的机理，以及SAGA复合物中其它组分对UBP8的调控机制，阐明表观遗传修饰因子如组蛋白去乙酰化酶UBP8与mRNA转运途径相互作用的机理。

承担单位

中国科技大学，安徽大学

课题负责人

臧建业

主要学术骨干

张敏

经费比例

课题三、用高精度电镜方法研究组蛋白修饰酶复合体及染色质的高级结构

14%

X射线晶体学、电镜三维重构、NMR和一些光谱学研究是结构生物学中几种重要而且相互补充的手段。本课题将主要利用冷冻电镜三维重构技术研究组蛋白修饰酶复合体和染色质的三维结构，辅以修饰酶的体内功能分析，阐述表观遗传的调控机理。本课题的研究目的是（1）利用冷冻电镜三维重构对大分子及其复合体的结构解析优势，从亚纳米级的尺度上解析一些重要的组蛋白酶－蛋白质复合体的三维结构，以了解这些复合体形成的结构及其对表观遗传的催化机制、底物特异性和酶活性调控机理；（2）利用冷冻电镜技术开展高精度的染色质高级结构研究，以了解组蛋白酶和其它重要蛋白在染色质高级结构的建立和维持中的作用；以及（3）以C.elegans线虫为模型，探索组蛋白的表观遗传修饰在C.elegans个体发育中的调控作用。本课题研究的结果将有助于为本项研究的长期目标，也就是揭示染色质的高级结构及其从11纳米核小体串结构到高级结构的调控机理，打下前期基础。

主要研究内容：

（1）组蛋白酶－蛋白质复合体的结构

很多组蛋白修饰酶在体内都是以复合体的形式存在，而且在很多情况下其酶活性和其它生物功能都与整个复合体的结构有关。尽管Ｘ光晶体学方法在分辨率方面有很大的优势，但

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对于大复合体则有很大的局限性：1）它需要大量的蛋白质，而含多个或高分子量的蛋白质复合体的高产表达是一种挑战；2）结晶成功的可能性与复合体样品的构象、组份和寡聚均一性紧密关联。而冷冻电镜方法不需结晶，所需蛋白量要少得多，而且复合体分子量越大（应用范围通常?500kDa)它的灵敏度越高。

课题一里涉及的几个组蛋白酶复合体，Ｈ3Ｋ4甲基转移酶ＭＬＬ复合体（～1ＭＤa），Ｈ3Ｋ27甲基转移酶ＰＲＣ2复合体（～0.5M Da), ＮuＡ4乙酰化酶复合体（～1.3MDa），和很多其它的组蛋白修饰酶复合体，如ＬＳＤ1，ＳＡＧＡ，ＳＥＴ1，Ｓin3Ａ等都是百万道耳顿以上的复合体。这些大分子及其复合物的大小正好处于cryoEM的合适研究范围，所以对于它们的结构解析，冷冻电镜三维重构有它自己独到的优势。我们将主要利用电镜单颗粒重建（single particle analysis）的方法研究这些大分子及其复合物的三维结构。我们将紧密地与第一课题组合作，将组成复合体的各个单元体（比如组蛋白酶或核小体）或者单元体的一部分的高精度的结构嵌入得到的复合体结构中，从而研究组成复合物的单体（如组蛋白酶，蛋白质）之间的相互作用的结构基础，了解这些单元的相互作用的分子机制及调控机理。同时，我们也将研究突变组蛋白修饰酶－蛋白质复合体和对应的未突变组蛋白修饰酶－蛋白质复合体的结构区别，从而通过对这些组蛋白修饰酶突变体的结构变化了解它的活性调控机理。

（2） 染色质的高级结构；核小体，DNA的组装及其对遗传调控的影响。

核小体是染色质的基本结构。最简单的染色质结构就是一条DNA上的一连串核小体，也就是所谓的11纳米染色质纤维。更高一个层次的染色质结构就是30纳米的染色质纤维，它是由邻近的核小体有序堆积而成的。目前对于染色质高级结构的较为深入的认识也只局限于到30纳米纤维这个层次，而且对于其结构模型、结构的建立和维持机制的理解都还有相当的不确定性。用电镜三维重构的方法研究染色质的高级结构将是本课题的另外一个重要内容。

我们将用冷冻电镜三维重构的方法研究多个核小体组装成的局域二级结构，11纳米染色质纤维以及更高一级的30纳米染色质的高级结构。主要将对染色质二级结构比如核小体重复单元的长度及其调控因素；染色质高级结构建立、维持过程中的各种蛋白质－蛋白质的相互作用，维持机制等进行研究。比如H1组蛋白、组蛋白修饰酶、以及其它一些影响染色质高级结构的蛋白如MeCP2, MENT, Polycomb如何影响染色质的高级结构？它们在染色质高级纤维结构中处于什么位臵？它们在高级结构形成和稳定过程中的作用如何？

冷冻电镜特别适合于超大分子及其复合物的三维结构研究。这也决定了它适合于研究染

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色质的高级结构，比如由核小体，连接DNA和连接组蛋白H1组成的11nm染色质纤维，和由其组装成的30nm染色质纤维的大小正好处于冷冻电镜最适合的蛋白大小区域。目前，对于染色质结构的电镜观察还都局限于对其二维投影的观察，如参考文献2，对其空间结构的理解及模型的建立都有很大的局限性。本课题的着眼点和突破点将是染色质纤维高级结构的三维重建。由于各个染色质纤维的大小形态并不具有同一性，我们将主要利用冷冻电子层析成象（cryo Electron tomography）的方法对单个染色质纤维进行重建，并对其中的重复单元进行亚区平均（Sub-volume averaging）以达到更高精度的三维结构。我们将把组成这些高级结构的单元，如核小体，DNA和组蛋白酶等的原子尺度的结构嵌入到用电镜三维重构的方法得到的这些高级结构的三维密度图中，从而研究单体之间的相互作用的结构基础和调控机制。

（3） 不同活性状态下的染色质三维结构形态的变化及染色质变化动力学

染色质在不同的活性状态下具有不同的功能。我们将用冷冻电镜研究在不同状态下（乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、磷酸化/去磷酸化、泛素化/去泛素化）染色质的三维形态以了解不同活性状态对染色质的高级结构的影响及调控机制。

同时，染色质形态在所有结构层次上都是在动态变化的，这也决定了染色质的重要功能。我们将在动态变化中的染色质的不同形态用快速冷冻的办法固定下来，然后对不同时间段的染色质形态进行冷冻电镜三维重构，通过对动态变化过程进行“snapshot”摄影的方法对染色质变化的动力学及其调控因素进行研究。

电子显微镜，特别是冷冻电镜的样品可以是活性状态下处于自然缓冲液中的染色质。它提供了一个在正常生理环境下研究染色质形态变化及其动力学的良好工具。

（4） 体内环境下的表观遗传修饰功能研究

获得了组蛋白修饰酶及其复合物的三维结构信息后，我们将在生物体内进行相应的功能研究。在这部分研究工作中，我们主要利用模式生物C.elegans的研究平台探索组蛋白的表观遗传修饰在个体发育，尤其是C.elegans寿命，性腺发育和生殖发育中的调控作用。我们知道C.elegans线虫具有清楚的基因组遗传背景，并具有强大的RNAi和突变体库，遗传操作方便，是遗传学和发育生物学研究的良好模式；并且一些组蛋白修饰酶在C.elegans中已发现相应的同源蛋白，如人类H3K4的去甲基化酶RBP2在C.elegans中的同源蛋白RBR-2的RNAi处理可以增强H3K4的甲基化修饰，造成生殖器官发育的异常。通过体内功能的研究，我们预期的研究结果不仅有助于揭示组蛋白修饰酶的生物体功能，而且也将弥补表观遗传在线虫研究中的不足。

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主要目标

本课题的预期目标是用冷冻电镜单颗粒三维重构的方法解析出几个重要的组蛋白

酶与蛋白质复合体的三维结构，研究组成这些复合物的单体（如组蛋白酶，蛋白质）之间的相互作用的结构基础，从而了解这些单元的相互作用的分子机制及其对表观遗传的催化机制、底物特异性和酶活性的调控机理。用冷冻电子层析成象结合亚区平均的方法解析出核小体之间组装成的局域二级结构以及不同活性状态下的染色质纤维的三维结构，以研究染色质的组装调控机理以及组蛋白酶和其它重要蛋白在染色质高级结构的建立和维持中的作用。同时，辅以组蛋白修饰酶在C. elegans线虫的体内功能分析，探索组蛋白的表观遗传修饰在C. elegans个体发育中的调控作用。

本课题预计在每个方向上作出1－2个有代表性的工作，并发表于国际知名学术杂志上。同时，我们也将通过这一项目的启动，推动冷冻电镜三维重构技术在我国结构生物学领域的发展，培训一批重要的青年骨干人才并发展相应的技术。

承担单位

中国科学院生物物理研究所

课题负责人

朱平

主要学术骨干

赵艳梅

经费比例

课题四、表观遗传调控过程中重要蛋白的结构与功能研究

表观遗传调控是多层次的。最直接的调控就是组蛋白上的共价修饰，其次就是组蛋白修饰酶活性调控和其在体内的定位。本课题瞄准在表观遗传调控过程中参与调节功能的重要蛋白（或结构域）及其复合物作为研究对象，综合运用信息生物学、分子生物学、生物化学、蛋白质化学、细胞生物学和结构生物学的理论和方法，研究一些重要蛋白（或结构域）在参与调控组蛋白修饰过程中的分子机理和作用机制。通过解析这些蛋白和蛋白复合体的精细三维结构，来探讨结构和功能的关系，从而阐明蛋白之间的分子作用机制及的相互作用机理，

14%

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为进一步进行基于结构基础上的药物设计提供理论基础及前期积累。本课题主要包括以下2个主要内容：

组蛋白磷酸化的调控机理研究

组蛋白H3氨基末端的磷酸化修饰是染色质活性调节的重要事件。组蛋白H3 Ser-10 残基的磷酸化修饰在细胞间期和有丝分裂期有着相反的生物学效应，在间期H3的 Ser-10磷酸化由于促进邻近赖氨酸的乙酰化而激活邻近染色质位点基因的转录，而在G2 向M期的过渡期及有丝分裂早期（prophase）染色质中组蛋白H3 Ser-10 残基实现整体的磷酸化，导致染色质的整体性凝集，为两套基因组染色体在赤道板的排列和正确分离准备条件，因此组蛋白H3 Ser-10 磷酸化被看成有丝分裂的标志性事件。有实验证据表明组蛋白H3 Ser-10 磷酸化是由进化上非常保守的一组激酶aurora激酶中的aurora B催化的。显然aurora B的活性是受到严格的调节的。在动物有丝分裂细胞中的中期、后期和末期，aurora B先分布在染色体臂而后转移到着丝粒，再转移到纺锤体中区再到中体。在这个过程中aurora B与蛋白INCEP, Survivin, Borealin结合形成染色体过客复合物（Chromosome Passenger Complex, CPC）一起从染色体进入细胞质。以aurora B激酶为核心的这个蛋白质复合物在染色质凝集、染色体在赤道板的正确排列和分离、中体（midbody)的成熟及胞质分裂等这些过程的成功进行都是不可少的。Aurora B 在细胞中使CPC复合物中的INCENP，Survivin和Borealin 磷酸化。它的活性和细胞内定位受这几个蛋白的调节。它们的基因缺失或突变可使Aurora B 失活。我们已有的工作表明CENP-A 蛋白、ser10 磷酸化组蛋白H3和aurora B有类似的行为，均能从染色体转移到纺锤体再到中体，凝集成特殊结构复合物组成中体支持细胞完成胞质分裂。鉴于auroraB在表观遗传学中的功能和调节尚不清楚，为了深入了解aurora B激酶磷酸化组蛋白对细胞间期基因表达的调节，了解在有丝分裂期其活性的调节，以及CPC复合物形成的分子机理和调控机制。我们将利用免疫沉淀法从同步化细胞中分别抽提不同细胞相期和aurora B结合的蛋白复合物。分析这些复合物中蛋白质的种类和结构状态（包括修饰状态）以便区别细胞间期和中期aurora B的结构状态和调节因子、调节方式；克隆CPC复合物中的相关蛋白基因，分离纯化表达产物，用X射线晶体学和核磁共振研究蛋白结构及功能；以及用生化和分子生物学手段如RNA干扰等手段研究相关aurora B调节因子的功能。同时我们将与医院临床进行合作研究，探讨某些重要蛋白在疾病的临床确诊和治疗方面的可能性。

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（2）参与表观遗传调控的含PDZ结构域蛋白质家族的结构与功能研究

PDZ结构域可以与一系列蛋白相结合并调控其生物学功能。这些PDZ结构域结合蛋白包括一系列受体（例如G蛋白结合受体和酪氨酸激酶受体），离子通道（例如钠离子、钾离子和钙离子通道），细胞粘着蛋白（例如钙粘着蛋白和多配体蛋白聚糖），神经递质转运蛋白（例如多巴胺和5-羟色胺转运蛋白），微管动力蛋白（例如驱动蛋白和动力蛋白）以及许多信号传导酶。近来人们通过蛋白质组学、酵母双杂交等方法，发现在组蛋白修饰过程中有很多包含PDZ结构域的蛋白参与，例如激酶PBK/TOPK（PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase）通过磷酸化组蛋白H3来调节细胞的生长，PBK/TOPK激酶在妇女乳腺癌细胞中过量表达。在其C末端含有一个PDZ结合序列，因此PBK/TOPK参与组蛋白修饰的调控可能通过PDZ蛋白来实现；支架蛋白Pro-IL-16含有三个PDZ结构域，通过PDZ-配体相互作用，Pro-IL-16与转录因子GABP?1(GA binding protein ?1 subunit)和组蛋白去乙酰化酶HDAC3(histone deacetylase 3)形成蛋白复合物来调节Skp2在T细胞中的转录活性；T细胞特异性转录因子SATB1(special AT-rich binding protein 1)可以与CBP/300和组蛋白乙酰化转移酶PCAF相结合。SATB1与PCAF的结合将使SATB1中的PDZ结构域被PCAF乙酰化，从而导致SATB1不能与DNA相结合，但CBP/p300与SATB1没有相应的效应。然而这些PDZ结构域蛋白参与调节组蛋白修饰过程的分子机理尚未清楚，为了揭示PDZ结构域蛋白参与组蛋白修饰过程的分子机理及调控机制，在本课题中我们将利用信息生物学的方法找到参与组蛋白修饰的所有包含PDZ结构域蛋白，作为我们的研究对象来研究PDZ结构域及其蛋白参与组蛋白修饰过程的分子机理和调控机制，同时我们也将关注一些特殊的PDZ蛋白（如Tip-1等）在参与表观遗传调控过程中的分子机理。如此系统的研究将填补目前国际国内一片空白的局面。目前我们已经完成了对鼠源TIP-1基因的克隆、表达纯化、结晶和结构的初步分析；PBK/TOPK已从乳腺癌组织克隆，现正在进行下一步实验，同时我们将对其它基因（如Pro-IL-16、SATB1等）进行克隆尝试。由于在很多疾病中，组蛋白修饰表现出异常，因此我们的研究将与医院进行合作来探讨PDZ蛋白参与临床确诊及治疗的可能性。我们希望通过解析这些PDZ结构域或其复合物精细的三维结构，系统地研究PDZ结构域家族蛋白参与组蛋白修饰过程的调控机理，从分子水平上阐明PDZ蛋白参与组蛋白修饰过程的工作机制。希望能在某些PDZ结构域家族蛋白上找到药物靶点的切入点，为设计小分子药物来预防及治疗其参与的肿瘤和癌症及重大遗传病提供前期理论基础。

主要目标

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本课题的预期目标是在以上的研究内容里的每个方向得到几个原创性的重要蛋白的结构工作，通过解析这些蛋白质的三维结构，在原子分辨率水平上揭示这些蛋白与蛋白或蛋白与底物之间的相互作用力，并利用其它的实验手段来研究结构与功能的关系，从而揭示aurora B激酶在有丝分裂期活性的调控机制及CPC复合物的作用机理和阐明PDZ蛋白参与调控组蛋白修饰过程的一般规律。同时也将探索一些重要调控蛋白与一些重大疾病的潜在关系，并结合生物化学或其它物理、化学、细胞的手段来了解它们的功能和与本项目的其它课题组合作，来寻找潜在的药物结合靶点的切入点，并进行以结构为基础的药物设计。

承担单位

南开大学，天津科技大学

课题负责人

龙加福

主要学术骨干

黄熙泰、张同存

经费比例

课题五、表观遗传学的的化学生物学研究

表观遗传学的研究包含组蛋白的共价修饰和DNA甲基化，这些过程不仅在生物学上具有重大意义，化学反应的机制也非常复杂和有趣。例如，组蛋白的乙酰基化酶和甲基化酶分别需要乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸。组蛋白去乙酰基酶分为两类，一类是含有锌离子的经典水解酶（HDACs），另一类含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sirtuins)，去乙酰基的同时水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。 去甲基化酶有一种需要核黄素(LSD), 去甲基的同时产生甲醛和双氧水；有一种需要二价铁（JHDM），去甲基的同时产生甲醛。组蛋白的共价修饰在化学上的丰富多彩和复杂性决定了化学生物学的方法将提供研究表观遗传学的重要工具，结合结构生物学的方法，将对解决有关表观遗传的组蛋白修饰研究的主要问题作出重要贡献。同时，我们也将通过这一项目的启动，推动化学生物学和结构生物学在我国的紧密结合，并培训一批化学生物学方向的青年骨干人才。

化学生物学的一个重要的前沿方向是用基因编码的非天然氨基酸作为探针，研究信号转

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导和酶的催化机制。通过人工的方法可以增加用来编码非天然氨基酸的新遗传密码。首先把无义密码“UAG”确定为新的遗传密码，然后对天然的转运核糖核酸（tRNA）突变, 使其含有反密码子“CUA“。在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。在这之后，再将生命体中mRNA 上任意一个遗传密码取代为UAG, 并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，就可以在蛋白质中相应的位臵插入有特殊物理、化学性质的氨基酸, 从而在生物活体内对信号转导过程进行精确研究；并且可以大量表达在指定位点含有非天然氨基酸的蛋白质，进行结构生物学或酶学机理研究。这种新技术的出现,为蛋白质的修饰与合成提供了新思路,对表观遗传学的研究有重要意义。

主要研究内容：

本子课题的研究目的是利用高通量选择的方法，选择出对乙酰基赖氨酸，甲基赖氨酸，荧光氨基酸或具有光交联活性的氨酰-tRNA合成酶，从而在活细胞中表达在特定位点含有这些非天然氨基酸的蛋白质。这些新方法将从以下几个方面回答组蛋白的共价修饰在信号转导中的作用：

（1）修饰后的组蛋白是怎样被识别的？

以前的工作，例如JMJD2A 的 double tudor 结构域 和含有甲基化赖氨酸K4的多肽复合体的结构已经揭示了关于甲基化赖氨酸是怎样被特异性识别的重要机制 (Huang et al 2006)。 但是，固相合成法通常很难合成长度超过40个氨基酸的多肽，成本相当高（40个氨基酸的多肽需要约2000美元），而且因为每一步化学反应都有副产物（每一步氨基酸缩合的产率和准确度通常低于95%），常常很难拿到满足结晶学要求纯度的多肽。因此，利用活细胞自身蛋白质合成和能够识别非天然氨基酸（如甲基赖氨酸和乙酰基赖氨酸）的氨酰-tRNA合成酶的高效率（每一步氨基酸缩合的产率 和准确度通常高于99.9%），就可以以常规蛋白质重组表达的方法大量获得在特定位点有甲基赖氨酸，乙酰基赖氨酸等表达后修饰的全长蛋白质。 配合多肽合成，蛋白质剪切(protein splicing)，天然化学连接 (native chemical ligation) 等化学方法更可以获得有多种修饰的目标蛋白。在这个新方法发展起来以后，就可以大大加速获得蛋白复合体结构的过程，解析含有表达后修饰的组蛋白识别的机理，及其对染色体结构的影响和调控。结合电镜的技术，我们将研究对三甲基化的组蛋白H3K9和HP1蛋白的结合，修饰后的组蛋白的核小体蛋白质和核小体的复合体结构，以及异染色质

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(heterochromatin)的三维结构。

（2）修饰组蛋白有哪些酶？酶活性是否受到调控、是怎样调控的？

经典的生物化学方法是首先准备一个酶的底物和一个检验酶活性的方法，将细胞破碎后，进行多步柱层析，筛选出具有活性的组分，然后用质谱的方法确定酶的氨基酸顺序。例如：通过制备在特定位点有甲基化赖氨酸和组蛋白，和利用去甲基反应会产生甲醛的特点，在多步柱层析后确定JHDM1是消除组蛋白H3在K36位点甲基的酶（Tsukada 2006）。上述的方法虽然是非常强大的，但也存在局限性：第一，酶的底物，譬如在特定位点有修饰的组蛋白可能不容易获得。 第二，酶或者酶的复合体在多步柱层析后可能失去活性或解散，酶催化的反应也可能需要活细胞中的特定条件。应用基因编码的非天然氨基酸作为探针，有可能克服以上难点。例如，在获得对甲基赖氨酸和乙酰基赖氨酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶后，就可以很容易的在任意位点引入甲基赖氨酸或乙酰基赖氨酸。通过在组蛋白底物或修饰组蛋白的酶中引入光交联的氨基酸，就可以直接在活细胞中光交联存在相互作用的蛋白，结合质谱技术，就有可能发现新的组蛋白修饰酶或对组蛋白修饰酶起调控作用的因子。进一步通过生物化学和结构生物学技术，就可以揭示新的机理， 及发现新的药物靶点。

（3）修饰组蛋白的酶在哪些细胞里表达？是怎样被募集到受调控的基因区域的？在何时何种情况下表达？组蛋白的动态特性如何？

要解决这些问题，一个重要的方法是进行荧光标记。对组蛋白进行绿色荧光蛋白标记可能是有困难的，因为在核小体中组蛋白形成紧密的四级结构，而且组蛋白的末端本身具有重要功能。因此，对组蛋白进行基因编码的荧光氨基酸标记，对蛋白本身的干扰降到最低程度，结合荧光漂白恢复的办法，可以研究组蛋白在各种不同情况下的动态特性。由于相当多的修饰组蛋白的酶形成大的蛋白复合体，所以可能用绿色荧光蛋白标记也可能会影响其功能。用基因编码的荧光氨基酸标记，也将有助于回答修饰组蛋白的酶在哪些细胞里表达，在何时何种情况下表达，是怎样被募集到受调控的基因区域的的重要问题。

（4）甲基化和乙酰化是如何影响泛素化的？

组蛋白的泛素化是广泛存在的现象，如酵母的组蛋白H2B在赖氨酸123的泛素化占总H2B的10％左右。RNF 20/40具有针对H2B进行泛素化的泛素连接酶活性，H2B的泛素化可调节H3K4和H3K79的甲基化作用；CUL4-DDB-ROC1复合物则可对H3和H4进行泛素化。事实上在细胞内广泛存在组蛋白的甲基化、乙酰化和泛素化，利用构建的甲基化和乙酰化表达系统，探讨甲基化和乙酰化对组蛋白泛素化的影响。

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主要目标

利用高通量选择的方法，选择出对乙酰基赖氨酸，甲基赖氨酸，荧光氨基酸或具有光交联活性的氨酰-tRNA合成酶，并将这项技术用于甲基化、乙酰化后的核小体制备和结构研究，以及表观遗传调控的分子生物学研究。

承担单位

中国科学院生物物理研究所，复旦大学

课题负责人

王江云

主要学术骨干

季朝能、陈澍

经费比例

课题六、针对表观遗传关键蛋白的药物设计

表观遗传学是研究非遗传序列改变所引起的基因表达水平的改变。目前所知的也是研究得较为深入的表观遗传调控分子机理包括DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（包括甲基化，乙酰化，磷酸化，SUMO化，糖基化等)。组蛋白赖氨酸的N端乙酰化或去乙酰化修饰可改变染色质的区域结构。组蛋白的赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化会改变核小体的电荷，也会影响与核小体重构复合体（Nucleosome remodeling complex）的相互作用，进而形成一种开放的或紧密的染色质结构。一旦肿瘤抑制基因受到组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的作用，其基因转录将受到抑制，从而引起肿瘤发生。因此HDAC抑制剂可杀伤肿瘤细胞。许多组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶也在多种癌症发生中起重大作用，因而也被日渐意识到是抗癌药物研发的重要靶点。

表观遗传学从理论提出到临床尝试花费了约15年的时间，为肿瘤的发生机制的认识提供了新角度和新知识，表观遗传学的干预药物在临床上的有效性则提示表观遗传学理论的正确性，并为肿瘤治疗提供了新的重要靶点，为肿瘤治疗提供了新的方法。DNMT和HDAC已经被证明是肿瘤治疗的重要靶点，但一些已知抑制剂的药物性质经临床试验还不是很理想，其作用效果尚待提高、机制有待阐明。 因此，人们在寻找有效而毒性低的抑制剂。

14%

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主要研究内容

尽管有关靶向HDAC的抑制剂方面的研究已有可喜成绩，例如已在国外进行临床试验的抗癌的HDAC的抑制剂的研制，但由于目前这些抑制剂固有的限制，例如较大的细胞毒性等，限制了其进一步临床应用。当前，研制新型的具有我国自主知识产权的表观遗传学小分子抑制剂十分必要和迫切，而且具有重要的战略意义。小分子化合物因为能够自由通透细胞，可有效干预生物大分子和生物大分子之间，生物大分子和DNA之间的相互作用，其优点包括：作用快速、呈剂量依赖性、可逆性。因此小分子化合物成为表观遗传学研究和靶点药物开发的重要手段和策略。近十几年，经吸收组合化学方法逐渐发展起来化学生物学，大大提高了研制新型小分子化合物的效率，可以同时批量合成小分子化合物。

本课题的主要研究内容有：筛选具有良好药物性能的HDAC抑制剂、与本项目的其它课题组合作，利用结构生物学和化学方法改善和优化通过筛选得到的抑制剂、利用本项目各课题组的优势，合作开展组蛋白甲基转移酶、去甲基化酶、泛素化连接酶和去泛素化酶的小分子抑制剂筛选工作。

(1) 筛选具有良好潜在药物性能的HDAC抑制剂先导化合物:

HDAC是国际上公认的基于表观遗传调控的抗癌药靶。我们将充分结合本项目的结构生物学和化学生物学的强项，同时进行理性的和基于化学小分子文库的针对表观遗传学关键靶蛋白的抑制剂设计和筛选。我们已在前面的技术路线里提到用四种途径初步筛选出一系列的候选小分子：1）基于蛋白质结构的计算机虚拟筛选；2）基于化学小分子文库的高通量药物筛选；3）基于靶蛋白结构，合理设计针对性强的、结构新颖的小分子抑制剂；4）对于已知的小分子抑制剂作结构和性能改良。对于以上途径所得到的候选小分子抑制剂的生物活性检测、筛选出确能靶向抑制HDAC的化合物、同时又具有抗肿瘤活性是决定它们是否能成为有效的药物侯选者的关键。我们有这方面丰富的经验，具体的步骤见下：

a）组蛋白去乙酰化的测定

通过对组蛋白乙酰化测定观察这些化合物对HDAC8的抑制效应。组蛋白去乙酰化

的测定有成熟的方法，例如用带有荧光基团的乙酰化组蛋白多肽作为底物进行监测。

b）测定先导化合物对肿瘤细胞的增殖的影响：

将不同浓度的化合物加入细胞培养体系，通过MTT法测定OD值，计算IC50；通

过FACS测定细胞周期分布的影响

c）测定先导化合物对肿瘤细胞的存活/死亡的影响: Trypan blue, Annexin V-FITC, 细胞自噬测定

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d）明确先导化合物对肿瘤细胞的增殖、死亡信号转导通路的影响；

e）分析先导化合物抑制肿瘤细胞的增殖、杀伤肿瘤效应与抑制表观遗传学靶酶的相互关系。

f）对于有苗头的小分子化合物进行在体测试：主要利用裸鼠皮下抑制瘤模型、小鼠白血病模型，并观察其毒副作用。

（2）表观遗传学化学调控与其它信号转导靶点干预的相互关系

肿瘤是由多打击、多步骤引起的复杂过程。表观遗传导致肿瘤抑制基因的沉默被认为肿瘤发生的重要方面；另一方面，酪氨酸激酶因突变等原因引起的激活也是肿瘤发生的重要机制。而在某些肿瘤例如在慢性粒细胞性白血病，表观遗传学的异常和酪氨酸激酶的活化则是同时存在的，因此，它们对于肿瘤的发生发展可能协同作用，在不同方面、不同时期有所侧重。传统的观点认为酪氨酸激酶JAK通过激活转录因子STAT3和STAT5引起肿瘤，但新近报道酪氨酸激酶JAK可以破坏异染色质组件HP1(heterochrmatin protein 1)和Su(var)3-9基因的沉默而促进肿瘤而不必通过STAT途径。（Shi S et al. Nature genetics,2006;38:1071-1076）。关于JAK2的另一个研究则提示SOCS1的超甲基化是JAK2 V617F突变导致肿瘤机制的重要补充（Jost E et al. Leukemia. 2007 Mar;21(3):505-10）。Yang 等发现阻断酪氨酸激酶c-KIT可以使致瘤基因MAGE启动子发生甲基化而使之失活（Yang B et al, Epigenetic control of MAGE gene expression by the KIT tyrosine kinase. J Invest Dermatol. 2007 Sep;127(9):2123-8）.这说明表观遗传与酪氨酸激酶的活化有千丝万缕的联系。同时，把两种治疗策略加以联合是否可以取得更大疗效，则很值得在基础研究领域加以探讨。

我们将研究：

用酪氨酸激酶特异性抑制剂阻断信号转导在相关肿瘤细胞和白血病病人原代细胞标本是否可以引起表观遗传学的改变。

酪氨酸激酶小分子抑制剂（例如STI571,AMN107,Nilotinib等）的研究在过去的十年里取得了长足进展，有数个小分子药物获得FDA批准应用于临床，并获得了较好的疗效。我们具有c-KIT D816V突变和 c-KIT V560G突变的引起白血病的细胞模型，也具有新型c-KIT酪氨酸激酶小分子抑制剂EXEL-0862。我们用EXEL-0862，STI571,AMN107,Nilotinib等酪氨酸激酶小分子抑制剂处理c-KIT D816V突变和 c-KIT V560G突变细胞，系统检测表观遗传学的改变（包括Global甲基化改变和与该种白血病密切相关的肿瘤基因和肿瘤抑制基因的甲基化修饰情况）。

其他模型包括Bcr-Abl,PDGFRa，Jak2突变引起的白血病,将使用相应的特异性酪氨酸激

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酶小分子抑制剂。

用小分子化合物VX-680抑制aurora的活性后，检测组蛋白修饰的可能变化。探讨VX-680抑制肿瘤生长是否跟组蛋白修饰的变化有关。

探讨临床试验上十分棘手的STI571获得性耐受是否与肿瘤细胞的表观遗传学有关。 2）表观遗传干预药物与酪氨酸激酶抑制药物的联合应用抗肿瘤策略的探讨

由于表观遗传学和酪氨酸激酶突变在肿瘤发生发展过程中可能从不同侧面起作用，因此，联合应用这两个方面的小分子抑制剂可能有协同作用。我们将利用本项目所研制的表观遗传学抑制剂和已有的抑制剂，通过联合酪氨酸激酶抑制剂，探讨这两种抗肿瘤策略是协同抑制肿瘤。从细胞生物学和分子生物学角度探讨这种协同效应的基础。

主要目标

从已知化合物文库中筛选出2?4个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物；用计算机辅助设计，合成，得到一组结构全新的、针对HDAC小分子抑制剂；并进行结构修饰和优化，预期得到先导化合物。为进一步把靶点药物研发奠定基础，同时所得到的先导化合物也可应用于表观遗传学的化学调控研究。建立表观遗传干预与酪氨酸激酶的阻断联合应用抗肿瘤策略的分子药理学基础。

承担单位

中山大学，中国科学院生物物理研究所

课题负责人

潘景轩

主要学术骨干

许芳，齐财

经费比例

14%

6、各课题间的相互关系

本项目的六个课题包括了对于组蛋白甲基转移酶/去甲基化酶、乙酰转移酶/去乙酰化酶的结构和功能研究(课题一) ；组蛋白泛素化连接酶/去泛素化酶的结构和功能研究(课题二) ；高精度电镜方法在大组蛋白修饰酶复合体结构及染色质高级结构研究中的应用(课题三) ；组蛋白磷酸化调控以及与蛋白质-蛋白质相互作用研究(课题四) ；化学生物学方法在表观遗传学研究中的应用(课题五) ；基于组蛋白修饰酶的药物设计和开发(课题六)。由此可

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见，本项目的课题设臵是沿着一条组从组蛋白修饰到染色质高级结构研究这样的主干路线（课题一至四），并且在大力利用成熟的结构生物学方法的同时高度重视发展和利用新的研究方法（课题五）以及表观遗传学研究的重要应用（课题六）。这些课题的高度相关性会促使课题间的紧密合作。例如课题一、三、五、六之间的合作会利用组蛋白修饰酶的结构信息、合成和制备修饰过的核小体、进行染色质高级结构的探索和蛋白修饰酶的小分子干扰剂研制。其次，组蛋白泛素化是一些组蛋白赖氨酸甲基化的先决条件，而Ｈ3Ｓ10的磷酸化直接抑制Ｈ3Ｋ9的甲基化。这些表观遗传学的相互依赖的关系也有机地结合了课题一、二、四。总之，本项目的六个课题相对的独立，而相互之间又有天然的有机关系。相互之间的合作将极大地提高本项目的整体研究水平。

6、项目总体目标和五年目标的关系

本项目的总体目标是使我国在表观遗传学的结构机理研究水平跻身于国际先列。其中的一项主要长远目标是在表观遗传学机理研究领域做出几项有标志性的工作；这包括在组蛋白修饰酶的复合体结构，蛋白质和核小体的复合体结构，以及异染色质(heterochromatin)的三维结构研究方面有所突破。项目的五年目标为总体目标提供了以下基础：1) 提供复杂的组蛋白修饰酶复合体和核小体的制备技术；2) 为解决总体目标中的重大科学问题提供多学科合作的经验和平台；3) 所得到的结构和功能信息将为总体目标中的实验设计提供新思路；4) 为项目总体目标的实现培养出一支训练有素、勇于探索的年青研究队伍。

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四、年度计划

研究内容 克隆、表达和纯化有关的组蛋白修饰酶及其调控蛋白，并开展蛋白质结晶初始条件的探索。合成用于体外制备修饰后的核小体的氨基酸；构建和完善核小体制备技术。构建以线虫发育为模式的表观遗传学功能研究平台。对已知的HDAC8结构进行分析，并用之于HDAC抑制剂的计算机辅助筛选。 预期目标 成功地表达20个以上可溶的组蛋白修饰酶和其调控蛋白，并进行分离纯化和结晶条件筛选。争取得到5-10个蛋白质晶体的初步生长条件。实现以较低成本合成修饰后的非天然氨基酸，完善核小体制备技术。得到组蛋白修饰异常的线虫株。用计算方法筛选出几十至几百个HDAC的候选小分子抑制剂。 第 一 年 第 二 年 优化在第一年所得到的初始结晶条件、收集晶体的衍射数据和解析晶体结构。进一步改善其余蛋白质的表达和纯化条件，继续蛋白质结晶初始条件的筛选工作。开始组蛋白修饰酶复合体的纯化和结构研究的初始工作。开展核小体与组蛋白修饰酶相互作用的分析和复合体的纯化工作。构建氨酰-tRNA合成酶突变库，并对目标非天然氨基酸进行高通量筛选。分析发育异常的线虫株中的组蛋白修饰状态。提出对HDAC候选小分子抑制剂的改造方案，并对部分已知HDAC8抑制剂进行结构改造。探讨表观遗传干预药物与酪氨酸激酶抑制药物的联合应用抗肿瘤策略。 完成5-10个晶体的结构解析并且利用所得到的结构信息来构建突变型组蛋白修饰酶及其调控蛋白。验证由结构所预测的这些组蛋白修饰酶的作用机理。筛选出3-5个组蛋白修饰酶复合体的结晶条件。得到适合与晶体学和冷冻电镜研究的核小体和其它蛋白质复合体样品，并开展初步的三维结构研究。筛选并验证得到只对有关非天然氨基酸有专一性的氨酰-tRNA合成酶。完成对TSA等HDAC潜在广谱类抑制剂进行结构改造的理性设计和化学反应工作，并且对候选小分子抑制剂进行实验验证。初步揭示表观遗传干预与酪氨酸激酶的阻断联合应用抗肿瘤策略的分子药理学基础。 30

研究内容 优化组蛋白修饰酶复合体的初始结晶条件、收集晶体的衍射数据和解析晶体结构。开始基于结构信息的蛋白质-蛋白质相互作用及其在酶活性调控中的作用的功能研究。继续其余的组蛋白修饰酶复合体的纯化和初始结晶条件的筛选工作。寻找核小体与组蛋白修饰酶的复合体的晶体生长初始条件和开始较高精度的冷冻电镜研究。开展组蛋白修饰酶及相应的组蛋白修饰状态在线虫发育过程中的定位分析。开始制备含修饰后的组蛋白的核小体。对结构改造而获得的新颖的HDAC抑制剂进行进一步的生物活性检测，并对HDAC化学小分子文库进行高通量药物筛选。 解析组蛋白修饰酶复合体的晶体结构，并且结合生物化学和其它生物物理学方法来揭示这些组蛋白修饰酶的反应机理及活性调控机制。利用结构信息开展小分子预期目标 完成3-5个组蛋白修饰酶复合体晶体的结构解析并且揭示蛋白质-蛋白质相互作用影响酶活性的结构机理。得到3-5个新的组蛋白修饰酶复合体的初始结晶条件。筛选出1个核小体与组蛋白修饰酶复合体的结晶条件，得到一个较高精度的组蛋白修饰酶复合物的电镜结构。掌握制备带甲基化的组蛋白的核小体的体外重组技术。获得一组由基于结构信息改造的结构新颖的HDAC抑制剂和从化合物文库中筛选出2?4个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物预期得到先导化合物，并对它们的生物活性进行分析。 第 三 年 第 四 年 抑制剂的筛选工作。优化核小体与组蛋白修饰酶的结晶条件，以期得到衍射性能优良的晶体。分析带甲基化组蛋白的核小体与蛋白质的相互作用，寻找适合于冷冻电镜和共结晶分析的核小体-蛋白质复合物。揭示线虫不同发育阶段的染色质纤维局部二级结构的三维构像。继续进行基于化学小分子文库的高通量药物筛选，并对候选化合物进行生物活性检测和临床前研究。 完成有关组蛋白修饰酶复合体的晶体结构解析工作。筛选出2-4个具有良好特性的药物先导物，研究候选化合物是否具有抗肿瘤作用，及其抗肿瘤作用是否与其抑制HDAC的作用直接相关。收集核小体与组蛋白修饰酶复合体的晶体衍射数据。开始染色质高级结构的分析工作。 31

研究内容 解析核小体与组蛋白修饰酶复合体的晶体结构。开展药物先导物与组蛋白修饰酶结合的结构研究工作，为改良药物先导物的药理性质提供结构依据。结合晶体学和冷冻电镜方法来研究核小体与其识别蛋白的相互作用模式及其所形成的高级结构。 预期目标 完成一个核小体与组蛋白修饰酶复合体的晶体结构。揭示更多的组蛋白修饰酶的结构和功能关系。提供基于结构信息的有关药物先导物的改良方案。初步揭示染色质高级结构的三维构像。 第 五 年

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