基础生物学实验讲义1

《基础生物学实验》备课笔记 基础生物学实验》 生物学实验
生物工程系
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普通生物显微镜的构造及 构造及使用方法 实验一 普通生物显微镜的构造及使用方法一、实验目的与要求 1 了解普通光学显微镜的构造和性能 2 掌握普通光学显微镜的使用方法 二、显微镜的主要构造 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。
1.目镜
2.镜筒
3. 转换器 4. 物镜 5. 载物台 6. 聚光器 9.反光镜 10. 底座 11. 镜臂 14. 粗调焦旋钮
7. 虹彩光圈
8. 聚光镜调节钮 13. 细调焦旋钮
12. 标本片移动钮 17.光源
15.电源开关 16.光亮调节钮
（一）机械部分 1.镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 2.镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 3.镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 4.镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 5.物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有 3－4 个圆孔， 是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声 时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 6.镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有 一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进 器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标 本作左右、前后方向的移动。 7.调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 （1）粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较 大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野 中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 （2）细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降， 多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层 次和不同深度的结构。 （二）照明部分2
装在镜台下方，包括反光镜，集光器。 1.反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光 源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光 线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 2.集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是 把光线集中到所要观察的标本上。 （1） .聚光镜： 由一片或数片透镜组成， 起汇聚光线的作用， 加强对标本的照明， 并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转

动它可升降聚光器，以调节视野 中光亮度的强弱。 （2）.光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一 柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。 （三）光学部分 1.目镜：装在镜筒的上端，通常备有 2－3 个，上面刻有 5×、10×或 15×符号 以表示其放大倍数，一般装的是 10×的目镜。 2.物镜： 装在镜筒下端的旋转器上， 一般有 3－4 个物镜， 其中最短的刻有 10×” 符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有 “100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色 的线，以示区别。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为 10×，目镜为 10×，其放大倍数就为 10×10=100。 显微镜的使用方法 三、显微镜的使用方法 准备工作： （一）准备工作 首先将显微镜的工作台擦干净，然后将要观察的标本和各种器具准备好。 （二）显微镜的使用 1.取用：将显微镜从镜箱取出，取出时一手握镜臂，一手托底座将其轻放在离工 作台边缘 8－10 厘米处，偏左的位置。 2.低倍镜的使用 （1）对光：对光前，先安上合适的目镜（一般采用 10×目镜），将 10×、40×、 100×物镜按照顺时针安在物镜转换器上，逆时针转动转换器使 10×物镜对准载 物台中央的通光孔。 从目镜中观察， 同时调节反光镜或接通电源， 直至视场明亮、 均匀为止。 使用双目显微镜对双目镜宽度要进行调节， 用推或拉的方法调节两目镜之间 的距离，直到在两个目镜上双眼同时观察时，两个图形的视场正好完全重合，此 时镜筒刻度盘上所示的数字，就是观察者两眼瞳孔之间的距离。 根据物镜的放大倍数调节聚光镜的高度，使用油镜时由于放大倍数大，镜像 亮度小，需要较强的照明，需要将聚光镜升至最高处。 调节可变光阑（光圈）使聚光镜的镜口率与物镜的镜口率一致，才能充分发 挥舞静的分辨率，方法为：将显微镜调整到工作状态后，从目镜筒中拔出目镜， 一边观察（向拔出目镜的目镜筒里看），一边缩小光阑，这时可看到缩小的光阑 被物镜成的像，然后逐渐调大光阑，当光阑像的边缘与物镜通光孔黑圈的边缘一 致时停止，这时的聚光镜镜口率与物镜镜口率就一致了。如显微镜可变光阑圆框 上刻有表示口径的标尺，可调至物镜镜口率的 80％，即物镜镜口率为 0.65，则 可变光阑的标尺调至 0.65×80％＝0.52 即可。
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（2）观察：将标本放置在载物台上，使标本对准通光孔正中，下降镜筒或升高 载物台，并从侧面观察，使物镜下端和标本逐渐接近，但不能碰到盖玻片。从目 镜观察，用粗

准焦螺旋慢慢升起镜筒和下降载物台直到看到标本为至，再调节细 准焦螺旋至物像清晰。 3.高倍镜的观察 在低倍镜下，找到要进一步观察的部位，移至视野中心，再上升聚光镜、逆 时针转动物镜转换器换上高倍镜。 合格的显微镜操作距离是由低倍镜转换到高倍 镜时刚好合用的，一般稍为调节一下细准焦螺旋即可看到清晰的物像。 4.油镜的观察 在高倍镜下看到标本后，把需要进一步放大的部位移至视野中心。上升镜筒 或下降载物台约 1.5 厘米。将物镜转离光轴，在盖玻片所要观察的部位上滴一滴 香柏油，把光阑升至最大。换上油镜，小心调节粗准焦螺旋，使油镜慢慢下降或 慢慢上升载物台，从侧面观察油镜下端与标本之间的距离，当油镜的下端开始触 及油滴时即可停止。从目镜观察，调节细准焦螺旋，直至看清标本物像。 观察完毕，上升镜筒或下降载物台，将油镜转离光轴，用干的擦鏡纸轻轻地 吸掉油镜和盖玻片上的油，再用浸湿二甲苯的擦鏡纸擦拭两三次，最后用干净的 擦鏡纸再擦拭两三次。 （三）观察后的处理工作 清洁：显微镜上的污物（残物或灰尘），用擦鏡纸擦干净，若擦不干净可蘸 少许二甲苯进行擦拭。 显微镜各部分的放置：擦完后，把物镜转离光轴，把反光镜转到与载物台垂 直的方向， 以减少灰尘粘落上面， 而后罩上鏡套， 小心的放回鏡箱内， 保存备用。 （四）使用显微镜时应注意的事项 1.取放时动作一定要轻， 切忌震动和暴力， 否则会造成光轴偏斜而影响观察， 而且光学玻璃也容易损坏。 2.由于物镜的螺丝口容易损伤，安装物镜时要特别小心，即先向左方倒转一 小段， 凹凸双方吻合后再向右方旋转， 不要转的太紧， 轻轻捻到头， 再稍紧即可。 3.鏡检标本应严格按照操作程序进行，观察时要从低倍镜开始，看清标本后 再转用高倍镜、油镜。 4.使用油镜时一定要在盖玻片上滴油后才能使用。油镜使用完后，应立即将 镜头、盖玻片上的油擦干净，否则干后不易擦去，以致损伤镜头和标本。但应注 意二甲苯用量不可过多，否则，物镜中的树胶溶解，透镜歪斜甚至脱落，盖玻片 移动甚至连同标本一起融掉。 5.使用时不可用手摸光学玻璃部分，如需擦拭应严格按照光学部件擦拭办 法。 6.使用的盖玻片和载玻片不能过厚或过薄。标准的盖玻片为 0.17±0.02 毫 米，载玻片为 1.1±0.04 毫米。过厚或过薄将会影响显微镜成像及观察。 （五）生物显微镜的擦拭和保养 1.擦拭 （1）光学部分的擦拭 顺序：吸耳球吹――毛笔、刷子和羽毛轻刷――擦鏡纸轻擦——擦鏡纸蘸二 甲苯轻擦。 镜头表面发霉和发雾可用擦鏡纸蘸

少量酒精乙醚混合液（3：7）轻擦。内表 面发霉和发雾，一般无法清除，所以严防发生。4
（2）机械部分的擦拭 用干净的软布擦拭，或用擦鏡纸蘸二甲苯轻擦，不得用酒精和乙醚，因为这 些试剂会侵蚀油漆，容易把油漆擦掉。 2.保养 防潮、防尘、防腐蚀、放热。 （六）检过程中常出现的问题及其分析解决的途径问 题 原 因 亮度调节旋钮位置不对 灯泡、光源变压器或保险管是否烧坏 聚光镜是否在光路中央的正确位置 视野照明不均匀 物镜是否转到光路中的正确位置 透镜上有无指纹或油渍 目镜表面生霉 所有物镜均难以 调焦 细准焦螺旋是否调至极限 是否标本太厚，厚薄不均 标本正面朝下 盖玻片厚度是否正确 聚光器是否处于正确位置和正确聚焦 解 决 方 法 调节亮度调节旋钮 更换烧坏部件 低倍镜下，关闭可变光阑， 靠调中螺旋把光束调中 转入正确位置 擦鏡纸蘸二甲苯擦拭所有 外露透镜 更换目镜 改变起位置至可调范围中 间 换较薄均匀清晰的标本 调整标本正面朝上 换标准盖玻片 调节聚光镜位置和聚焦 利用合适的油镜浸没油镜 检查 用低倍镜准确地把标本移 到视野的中央， 然后用高倍 镜或油镜把标本调中 是 清洁目镜 否 清洁物镜 移去盖玻片重新封片 存在小气泡
视野不亮
高倍镜和油镜难 于调焦 高倍镜和油镜下 难于找到标本 视野中所见到的 图象有污物、霉 斑或人工假象
当转动目镜时鏡内霉斑或污物是否随之转 动 检查载玻片和盖玻片之间是否有气泡 是否看到清晰黑色界限的环状物
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实验二 植物细胞的基本形态与结构细胞是生物形态结构和生命活动的基本单位。在进化过程中,植物细胞形成 了特有的结构。在光学显微镜下可以观察到细胞的细胞壁、细胞核、质体和液 泡。
细胞壁 细胞核 液泡 细胞质
一、实验目的 熟练使用光学显微镜观察植物的细胞，并能在显微镜下辨认植物细胞的各 部分显微结构，掌握细胞的基本结构。 学会制作植物表皮、果肉等临时装片。 二、实验用品 洋葱鳞茎、红辣椒果实、银杏叶、番茄果实、马铃薯块茎等。 显微镜、载玻片、盖玻片、解剖刀、培养皿、吸水纸、滴管、镊子等。 I2-KI 水溶液、Janus 绿水溶液、稀碘液。 三、实验内容 洋葱鳞叶表皮细胞观察 红辣椒果实表皮细胞观察 马铃薯块茎细胞观察 1. 制作临时装片 用镊子夹起盖玻片，使盖玻片一边先放下，接触到水，然后再轻轻放平， 以免产生气泡。
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2. 洋葱鳞叶表皮细胞观察 （1） 洋葱鳞叶表皮细胞临时装片 取洋葱鳞叶的内表皮约 2mm×2mm 制作临时装片。制片时，用刀片在鳞叶 内表面划处一“井”字，用镊子撕

取中间方形部分，尽快放入水中展平。 （2）细胞结构观察 低倍镜下观察洋葱鳞叶表皮细胞及其表皮细胞的排列方式，高倍镜下观察 细胞壁、细胞质、液泡、细胞核和白色体。 细胞壁：无色，比较透明。 细胞质：呈淡黄色，为一薄层。 细胞核：呈黄褐色，为扁圆形的小球体，被中央大液泡挤压紧贴着细胞壁。 液泡：无色，位于细胞中央，充满细胞液。 紫色品种洋葱的材料中有些细胞液泡是紫色的，为什么？ （3）染色观察 将 I2-KI 染液滴在盖玻片的一侧， 在另一侧用吸水纸将染料吸入后， 待表皮 材料呈淡黄色时，观察细胞核及核仁。注意观察：细胞核的形状和在细胞中的 位置；细胞核中核仁数量；液泡与细胞质之间的界限。 3. 红辣椒果实的表皮细胞 取红辣椒果实的一块果皮，将表皮向下放在载玻片上，用镊子夹住材料， 以解剖刀刮去果肉，刮至无色或半透明的浅橙色，这时仅留下表皮。将其制成 临时装片，观察细胞中的有色体，和细胞壁上的初生纹孔场。 4. 马铃薯块茎细胞 用解剖针针尖刮取少许马铃薯块茎细胞，涂抹在载玻片上，用 I2-KI 溶液染 色片刻制作临时装片，置于显微镜下观察细胞中的淀粉粒结构。 思 考 1. 光学显微镜下可以观察到植物细胞的什么结构？ 2. 原生质运动对植物细胞的生活有什么意义? 作业 绘图，并注明各部分结构名称
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洋葱根尖分生组织的培养及有丝分裂观察 实验三 洋葱根尖分生组织的培养及有丝分裂观察实验目的 1.制作洋葱根尖细胞有丝分裂装片，养成独立动手操作的习惯。 2.观察植物细胞有丝分裂的过程，识别有丝分裂的不同时期，比较细胞周期不 同时期的时间长短，培养学生视图、比较、分析、判断等能力。 3.绘制植物细胞有丝分裂简图，养成严谨求学的科学态度。 实验用品 洋葱、小麦。 显微镜、载玻片、盖玻片、解剖剪、解剖刀、培养皿、吸水纸、滴管、镊 子等。 、盐酸。 95%乙醇、醋酸洋红染液（或龙胆紫溶液） 一、洋葱根尖的培养 提前 3～4 天，取洋葱一个，放在广口瓶上，装满清水，让洋葱的底部接触 瓶内的水面。把广口瓶放在温暖的地方培养。待根长约 5 cm 时，取健壮的根尖 制成临时装片。注意的问题：应选择底盘大的洋葱做生根材料；剥去外层老皮， 用刀削去老根，注意不要削掉四周的根芽；培养时注意每天换水 1～2 次，防止 烂根。选材：应选取有丝分裂旺盛的细胞，如植物根尖分生区的细胞。实验所选取的洋葱应 避免选用新采收的样品，因为新采收的洋葱处于休眠状态，不易生根。
二、装片的制作 1.取材与解离 1.取材与解离 剪取洋葱根尖 2～3 mm，立即放入盛

有 15%盐酸和 95%的酒精混合液（1:1） 的玻璃皿中，在室温下解离 3～5 min。如果要使解离加快，可以把培养皿放在 酒精灯上微微加热（不可煮沸）3～5 min。至根酥软为止。解离中，应注意时 间的把握，不能太长也不能太短。解离太长使细胞的结构破坏，影响制片的效 果，太短则不易使细胞分离，观察时细胞容易重叠。解离后细胞已被盐酸杀死， 解离后细胞已被盐酸杀死， 解离后细胞已被盐酸杀死 不具备活性。 不具备活性。解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的分裂相.
2.漂洗 2.漂洗 把取出的根尖放入清水漂洗约 10min，也可以在培养皿口上蒙上—层纱布， 用自来水细小的水流漂洗 3～5min。 漂洗的目的是洗去根中多余的解离液。如果不把多余的解离液洗去，一方 面会影响染色效果，因为解离液中含有 HCl 溶液，而用来染色的染料呈碱性； 另一方面还会腐蚀显微镜的镜头。 3.染色 3.染色 把漂洗好的根尖置于载玻片上，用镊子头截下长约 3mm 的根尖，其余部分 丢弃，在根尖上滴一滴醋酸洋红染液（或 10%龙胆紫溶液）染色 3～5min。如果 要使染色加快；可把载玻片在酒精灯的火焰上快速过几下（不可煮沸） 。 能被碱性染液染成深色的物质是染色体。染色时，染液的浓度和时间的把 握要好，否则染色过深，不易观察细胞中的染色体。 4.制片 4.制片 先用镊子将根尖弄碎，盖上盖玻片；在盖玻片上加一片载玻片，用拇指轻 压载玻片。压片时用力要适当，过重会将组织压烂，过轻则细胞不易分散。 三、洋葱根尖细胞有丝分裂的观察 1.低倍镜观察 1.低倍镜观察8
在低倍镜下，先找到分生区细胞，观察细胞的形态特点。分生区细胞特点是：细胞呈正方形，排列紧密，有的细胞正在分裂。
2.高倍镜观察 2.高倍镜观察 找到分生区细胞后，把低倍镜移走，换上高倍镜，用细准焦螺旋和反光镜 把视野调整清晰，直到看清细胞物像为止。 在一个视野中不能观察到一个细胞有丝分裂的连续过程，因细胞在解离时 已经被杀死，不再进行细胞分裂了。在一个视野中，我们只能找到某一时期的 细胞图像，要想看全各时期的细胞，应移动装片，在不同的视野中寻找。 处于间期的细胞最多，因间期持续的时间最长。确认细胞周期中各时期的 长短，就看在这一时期中观察到的细胞的多少。 四、绘图 根据自己在实验中观察到的各时期的细胞特点，绘制有丝分裂前期、中期、 后期的简图，并能区分各时期细胞的特点。
取洋葱根尖材料时，应该在洋葱一天之中分裂最活跃的时间，一般在上午 11 点 左右，如果因气温影响或不在上述时间做实验的话，可以

在细胞有丝分裂最旺 盛时取材， 放人盛有固定液的培养皿中固定， 即浸泡半天到一天， 固定后用 70％ 乙醇冲洗几次， 再放入盛有 70％乙醇的小广口瓶中保存。 注意要等根尖长到 1～ 5cm 时才能切取， 而切取的洋葱根尖长度是 2～3mm,， 这是因为， 根据实验得知， 根长到 1～5cm 时，根的长势最佳，此时细胞分裂最旺盛容易找到不同时期的分 裂图像。此时可取生长健壮的根进行观察，切取洋葱根尖 2—3cm,这个长度要 从根的顶端(根冠)开始算起向上的距离，这个长度已将分生区包括了进来。若 长度过长，在低倍镜下寻找分生区就会很困难。 3、解离根尖培养好以后，装片制作是否成功，关键的步骤是解离。10％的盐酸 溶液和 95％的酒精溶液能溶解细胞壁之间的中层物质(胞间质)，使组织中的细 胞相互分开。就是用要药液使组织的细胞相互分离开来，便于最后制片时能被 压成一薄层进行显微观察。解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的 分裂相；而盐酸的作用是使洋葱细胞的细胞壁软化，并使细胞间的中胶层物质9
溶解，从而达到分离细胞的目的。另外解离时间不宜过短，否则根尖未充分解 离，压片时细胞分不开，细胞重叠；但又不能太长，否则使根尖过分酥软，无 法进行漂洗和染色，且染色体成分被破坏。这一步是实验成功与否的关键，在 室温下解离 10 一 15min。解离时间要视室内温度而定，温度低，时间稍长，温 度高，时间短。也可手拿镊子，轻轻按正在解离的根尖，感觉酥软即可。 4、漂洗的目的是去除根中多余的解离液，特别是盐酸，因为染色时用的是碱性 染料龙胆紫，酸与碱发生反应会影响染色效果 5、染色时间亦不能过长，否则会使染色体与周围的其他结构均被着色，这样就 无法形成颜色上的反差，不便于观察。 6、在制片时要用拇指按压盖玻片，目的是使细胞分散，不至于重叠。制片时 也可以，一方面要用镊子把洋葱根尖弄碎，另一方面要压片，这样可以使细胞 分散开来。压片时，在盖玻片上再加一片载玻片的目的，一是避免压碎和污染 盖玻片。二是使压力均匀，从而使组织细胞均匀分散。同时用力必须恰当，过 重时会将组织压烂，过轻则细胞未分散开，二者都将影响观察。 7、显微镜下观察到的细胞被固定在有丝分裂的某个阶段，若在视野中找不到处 于某个时期的细胞时，可以适当移动玻片在显微镜的一个视野中看到的细胞， 多数处于细胞有丝分裂的间期，因为在一个细胞周期中，间期所占的时间占整 个细胞周期的 90％～95％，时间与细胞数目成正比。另外在解离时，细胞已经 被杀死，不能看到一

个细胞的连续变化，因此细胞分裂各期常常在几个视野中 才能找出
观察植物细胞的有丝分裂 1、选材：应选取有丝分裂旺盛的细胞，如植物根尖分生区的细胞 2、 解离就是用要药液使组织的细胞相互分离开来， 便于最后制片时能被压成一薄层进行显 微观察。解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的分裂相；而盐酸的作用是使洋 葱细胞的细胞壁软化，并使细胞间的中胶层物质溶解，从而达到分离细胞的目的。另外解 离时间不宜过短，否则根尖未充分解离，压片时细胞分不开；但又不能太长，否则使根尖 过分酥软，无法进行漂洗和染色，且染色体成分被破坏。这一步是实验成功与否的关键 3、 漂洗的目的是去除根中多余的解离液， 特别是盐酸， 因为染色时用的是碱性染料龙胆紫， 酸与碱发生反应会影响染色效果 4、染色时间亦不能过长，否则会使染色体与周围的其他结构均被着色，这样就无法形成颜 色上的反差，不便于观察。10
5、在制片时要用拇指按压盖玻片，目的是使细胞分散，不至于重叠。 6、 显微镜下观察到的细胞被固定在有丝分裂的某个阶段， 若在视野中找不到处于某个时期 的细胞时，可以适当移动玻片
结晶紫 结晶紫是碱性染料， 能溶于水 （溶解度 9%） 和酒精 （溶解度 8.75%） 。 结晶紫在细胞学、 组织学和细菌学等方面应用极广， 是一种优良的染色剂。 他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋 白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时， 用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染 成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用 结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。 龙胆紫 龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。 在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是 甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。
细胞增殖和遗传的基础。 和遗传的基础。
细胞以分裂的方式进行增殖，细胞增殖是生物体生长、 细胞以分裂的方式进行增殖，细胞增殖是生物体生长、发育 生长
真核细胞分裂方式有：有丝分裂、无丝分裂、减数分裂。 其 真核细胞分裂方式有：有丝分裂、无丝分裂、减数分裂。 方式增加体细胞的数量。
丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式。多细胞生物以有丝分
有丝分裂：遗传物质复制一次，细胞分裂一次， 有丝分裂：遗传物质复制一次，细胞分裂一次，在分裂过程中细胞相同的细胞分裂方式

。 细胞相同的细胞分裂方式。
锤丝的出现和染色体的变化， 锤丝的出现和染色体的变化，所产生的子细胞中遗传物质的含量
细胞周期：连续分裂的细胞， 细胞周期：连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止。 开始，到下一次分裂完成时为止。(体细胞进行有丝 分裂具有周期性。如，在人的一生中，一个正常的体 细胞能够分裂 50-60 次。)11
有丝分裂间期分为 G1、S、G2 三个阶段，其中 G1 期与 G2 期进行 RNA（即 核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S 期进行 DNA 的复制。其中，G1 期主要是染色体蛋白质和 DNA 解旋酶的合成，G2 期主要是细胞分裂期有关 酶与纺锤丝蛋白质的合成。在有丝分裂间期，染色质没有高度螺旋化形成 染色体，而是以染色质的形式进行 DNA（即脱氧核糖核酸）单链复制。有 丝分裂间期是有丝分裂全部过程重要准备过程，是一个重要的基础工作。 前期
自分裂期开始到核膜解体为止的时期。间期细胞进入有丝分裂前期时，核 的体积增大，由染色质构成的细染色线逐渐缩短变粗，形成染色体。因为 染色体在间期中已经复制，所以每条染色体由两条染色单体组成。核仁在 前期的后半渐渐消失。在前期末核膜破裂，于是染色体散于细胞质中。动 物细胞有丝分裂前期时靠近核膜有两个中心体。每个中心体由一对中心粒 和围绕它们的亮域，称为中心质或中心球所组成。由中心体放射出星体丝， 即放射状微管。带有星体丝的两个中心体逐渐分开，移向相对的两极（图 1）。这种分开过程推测是由于两个中心体之间的星体丝微管相互作用， 更快地增长，结果把两个中心体（两对中心粒）推向两极，而于核膜破裂 后终于形成两极之间的纺锤体。 前中期 自核膜破裂起到染色体排列在赤道面上为止。核膜的断片残 留于细胞质中，与内质网不易区别，在纺锤体的周围有时可以看到它们。 前中期的主要过程是纺锤体的最终形成和染色体向赤道面的运动。纺 锤体有两种类型：一为有星纺锤体，即两极各有一个以一对中心粒为核心 的星体，见于绝大多数动物细胞和某些低等植物细胞。一为无星纺锤体。 两极无星体，见于高等植物细胞（图 2）。
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曾经认为有星纺锤体含有三种纺锤丝，即三种微管。一种是星体微管，由 星体散射出的微管；二是极微管，是由两极分别向相对一级方向伸展的微 管，在赤道区来自两极的极微管互相重叠。现在认为极微管可能是由星体 微管伸长形成的。三是着丝点微管，与着丝点联结的微管，亦称着丝点丝 或牵引丝。着丝点是在染色体的着丝粒的两侧发育出的结构。有报

告说着 丝点有使微管蛋白聚合成微管的功能。无星纺锤体只有极微管与着丝点微 管。 核膜破裂后染色体分散于细胞质中。每条染色体的两条染色单体其着 丝点分别通过着丝点与两极相连。由于极微管和着丝微管之间的相互作 用，染色体向赤道面运动。最后各种力达到平衡，染色体乃排列到赤道面 上。 中期 从染色体排列到赤道面上，到它们的染色单体开始分向两极之前，这 段时间称为中期。有时把前中期也包括在中期之内。中期染色体在赤道面 形成所谓赤道板。从一端观察可见这些染色体在赤道面呈放射状排列，这 时它们不是静止不动的，而是处于不断摆动的状态。 中期染色体浓缩变粗， 显示出该物种所特有的数目和形态。因此有丝分裂中期适于做染色体的形 态、结构和数目的研究，适于核型分析。中期时间较短。 后期 每条染色体的两条姊妹染色单体分开并移向两极的时期。分开的染色 体称为子染色体。子染色体到达两极时后期结束。染色单体的分开常从着 丝点处开始，然后两个染色单体的臂逐渐分开。当它们完全分开后就向相 对的两极移动。这种移动的速度依细胞种类而异，大体上在 0.2～5 微米 ／分之间。平均速度为 1 微米／分。同一细胞内的各条染色体都差不多以 同样速度同步地移向两极。子染色体向两极的移动是靠纺锤体的活动实现 的。 末期
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从子染色体到达两极开始至形成两个子细胞为止称为末期。此期的主 要过程是子核的形成和细胞体的分裂。子核的形成大体上是经历一个与前 期相反的过程。到达两极的子染色体首先解螺旋而轮廓消失，全部子染色 体构成一个大染色质块，在其周围集合核膜成分，融合而形成子核的核膜， 随着子细胞核的重新组成，核内出现核仁。核仁的形成与特定染色体上的 核仁组织区的活动有关。
细胞体的分裂称胞质分裂。动物和某些低等植物细胞的胞质分裂是以缢束 或起沟的方式完成的。缢束的动力一般推测是由于赤道区的细胞质周边的 微丝收缩的结果。微丝的紧缩使细胞在此区域产生缢束，缢束逐渐加深使 细胞体最后一分为二。 高等植物细胞的胞质分裂是靠细胞板的形成。在末期，纺锤丝首先在 靠近两极处解体消失，但中间区的纺锤丝保留下来，并且微管增加数量， 向周围扩展，形成桶状结构，称为成膜体。与形成成膜体的同时，来自内 质网和高尔基器的一些小泡和颗粒成分被运输到赤道区，它们经过改组融 合而参加细胞板的形成。细胞板逐渐扩展到原来的细胞壁乃把细胞质一分 为二（图 3）。细胞质中的有关细胞器，如线粒体，叶绿体等不是均等分 配，而是随机

进入两个子细胞中。细胞板由两层薄膜组成，两层薄膜之间 积累果胶质，发育成胞间层，两侧的薄膜积累纤维素，各自发育成子细胞 的初生壁。 【细胞有丝分裂记忆口诀】 有丝分裂并不难 间前中后末相连 间期：复制合成又生长 前期：膜仁消失现两体 中期：形定数晰赤道齐 后期：点裂数加均两极 末期：两消两现重开始（动物） 两消两现新壁建（植物）
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血涂片的制作和血细胞的观察、 实验四 血涂片的制作和血细胞的观察、计数一、实验目的 血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法,应用极广。特别是对各 种血液病的诊断有很大价值。但血片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难， 甚至导致错误结论。染色良好的血片是血液学检查主要基本技术之一。 本实验需掌握血涂片的制作，了解各种血细胞的结构特点；掌握人体微量采 血和用血细胞计数板进行细胞直接镜检计数的方法。 实验原理 二、实验原理 血涂片瑞氏染色法原理： 1.瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。 2.细胞的染色即有物理的吸附作用又有化学的亲和作用。各种细胞和细胞的 各种成份化学性质不同对各种染色料的亲和力也不一样。因此用染色液染色后 在同一血片上可以看到各种不同的色彩。例如红细胞中的血红蛋白为碱性蛋白 质，与酸性染料伊红结合被染成粉红色；而细胞核和淋巴细胞浆为酸性，与碱 性染料美蓝结合，被染成蓝色或紫色；另外嗜中性粒细胞为与伊红和美蓝均可 结合，被染成紫红色。 三、材料和用品 材料：人血或兔血 主要用品：生物显微镜，采血针，双凹载玻片，血细胞计数板 红细胞稀释液（氯化钠、硫酸钠、氯化高汞） 白细胞稀释液（冰醋酸、龙胆紫） 瑞氏（Wright）染液 三、实验内容与方法 （一）血涂片的制作和血细胞的观察 1．血涂片的制作 ．16
用酒精棉球擦拭消毒指尖，用采血针刺破指尖，从采血针眼处挤出绿豆大 小血滴，用清洁玻片面的一端轻轻接触血滴，使血滴附于玻片面上（注意勿触 及皮肤，否则血在玻片上就不能成滴） ，以左手拿该片的两端，迅速用右手拿住 另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成 45° 角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。 （注意：血 膜过厚细胞重叠缩小,血膜太薄白细胞多集中于边缘） 。 血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动,使血膜迅速干燥，以免血细胞皱 缩，之后滴加瑞氏染色液 2-3 滴,使覆盖整个血膜，固定 0.5-1.0 分钟.滴加等量 或稍多的新鲜蒸馏水,与染料混匀染色 5-10 分钟，此时涂片

表面呈现一层古铜 色，用蒸馏水迅速冲洗，见涂片呈粉红色后，自然晾干或用吸水纸吸干,即可置 血涂片于显微镜下进行镜检。 注意： ① 取血滴不宜过多，以免涂片过厚，影响观察。 ② 要使涂片厚薄均匀、拿片角度和速度都要适中，用力要均匀。 ③ 涂片一般在后半部为好，白细胞在边缘和尾端较多。 2．血细胞观察 ． 制作良好的血涂片厚薄适宜，血膜分布均匀，呈粉红色。选一厚薄适宜部 位置显微镜下观察。先用低倍镜观察全片，了解涂片染色、细胞分布情况，再 用油镜观察。 （1）红细胞 数量最多，无核。体积小而圆、均匀分布，呈红色的圆盘状，边 缘厚，着色较深；中央薄，着色较浅。细胞器，胞质内充满血红蛋白。 （2）白细胞 白细胞(淡蓝色,核为深蓝色).白细胞数量较红细胞数量少，但胞 体大，细胞核明显，极易与红细胞区别开。 （3）嗜中性粒细胞 是白细胞中较多的一种，约占白细胞总数 50-70%。体积 比红细胞大，主要的特征是胞质中的特殊颗粒细小，分布均匀，着淡紫红色。 胞核着深紫红色，一般分 3—5 叶，叶间以染色质丝相连。核分叶的多少与该细 胞年龄有关，如核为杆状，则为嗜中性粒细胞的幼稚型。 （4）嗜酸性粒细胞 比中性粒细胞略大，数量少，约占 7%以下。核常分两叶， 着紫蓝色。主要特点是胞质内充满粗大、圆形的颗粒，色鲜红或桔红。17
（5）嗜碱性粒细胞 数量很少，约占 1%以下。在一般血涂片上不易找到，体 积比上述 2 种白细胞稍小。胞质中分散着许多大小不一的深紫蓝色颗粒。胞核 形状不定,圆形或分叶，也染成紫色，但染色略浅，一般都被颗粒遮盖，形状不 清。 （6）淋巴细胞 数量较多，约占 20%-40%，可见中、小型，淋巴细胞。其中 小淋巴细胞最多,略大于红细胞。核大而圆,几乎占据整个细胞，染成深蓝紫色。 胞质极少，仅在核的一侧出现一线状天蓝色或淡蓝色的胞质。中淋巴细胞比红 细胞大，胞质较小淋巴细胞的稍多，着色较浅。核圆形或卵圆形，位于细胞中 部，也染成深蓝紫色。 （7）单核细胞 数量少，约占 2%-8%，是细胞中体积最大的一种，胞核呈肾 形、马蹄形，常在细胞一侧，着色比淋巴细胞浅。 （8）血小板 为形状不规则的细胞小体，其周围部分为浅蓝色，中央有细小的 紫色颗粒，常聚集成群，分布于红细胞之间。高倍镜下一般只能看到成堆的紫 色颗粒，在油镜下才能看到颗粒周围的浅色胞质部分。
（二）血细胞计数 1．血细胞计数板的构造 ． 计数板是一块特制的长方形厚玻璃板，板面的中部有 4 条直槽，内侧两槽 中间有一条横槽把中部隔成二长方形的平台。平台比

整个玻璃板的平面低 0.1mm，当放上盖玻片后，平台与盖玻片之间距离（即高度）为 0.1mm。平台 中心部分各以 3mm 长，3mm 宽精确划分为 9 个大方格，称为计数室，每个大 方格面积为 1mm2，体积为 0.1mm3。四角的大方格，又各分为 16 个中方格，适 用于白细胞计数。中央的大方格则由双线划分为 25 个中方格，每个中方格面积 为 0.04mm2，体积为 0.004mm3。每个中方格又各分成 16 个小方格，适用于红 细胞计数。 2．血细胞计数 ． （1）血液稀释 1.5 ml 塑料离心管：0.38ml 白细胞稀释液放入小试管内 + 0.02 ml 血液 5 ml 塑料离心管：3.98ml 红细胞稀释液＋ 0.02 ml 血液18
血液应加入试管底部，滴入计数室前试管摇振 1-2min。 将盖玻片放在计数板正中，用白色小号 Tip 头吸取摇匀的稀释血液，将一 小滴血液滴在盖玻片边缘的玻片上，使稀释血液借毛细管现象而自动流入计数 室内。 如滴入过多，溢出并流入两侧深槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响 计数结果，需用滤纸片把多余的溶液吸出，以深槽内没有溶液为宜。 如滴入溶液过少，经多次充液，易造成气泡，应洗净计数室，干燥后重做。 红细胞和白细胞的计数，各使用一计数室。 血液稀释液滴入计数室后，须静置 2-3min，然后在低倍显微镜下计数。 （2）血细胞计数 计数白细胞时，数四角 4 个大方格的白细胞总数 计数红细胞时， 数中央大方格的四角的 4 个中方格和中央的一个中方格 （共 5 个中方格）的红细胞总数 计数时应循一定的路径，对横跨刻度上的血细胞，依照“数上不数下，数 左不数右”的原则进行计数。 计数白细胞时，如发现各大格的白细胞数目相差 8 个以上；计数红细胞时， 如各中方格的红细胞数目相差 20 个以上，表示血细胞分布不均匀，必须把稀释 液摇匀后重新计数。计算：血细胞数/mm3＝血细胞计数值÷ 计数体积（mm3）×稀释倍数 (1) 红细胞：加 20μl 血液于 3.98m1 红细胞稀释液中，血液被稀释 200 倍。共计数 5 个中 方格的红细胞总数，一个中方格的容积为 0.2×0.2×0.1，即 0.004 mm3。5 个中方格的总 容积为 0.004×5=0.02mm3，因此，红细胞数／mm3＝5 个中方格中所数的红细胞数÷0.02 ×200。 (2) 白细胞：加 20μl 血液于 0.38m1 白细胞稀释液中，血液被稀释 20 倍。共计数 4 个大方 格的白细胞总数，一个大方格的容积为 1×1×0.1，即 0.1mm3。4 个大方格的总容积为 0.1 ×4=0.4mm3，因此，白细胞数／mm3＝4 个大方格中所数的白细胞数÷0.4×20。
按目前临床上血细胞计数采用的通用单位，将以上所获每 mm3 血液中所含血 细胞数量换算为各血细胞在每升血液中的数量 （毫升=立方厘米， 升=立方分米）
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（

3）清洗血细胞计数板 盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。计数 板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净 为止。 四、作业与思考 1. 将血细胞计数实验结果填入下表：
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2．根据实验体会，分析影响血细胞计数准确性有哪些因素？附】 红细胞稀释液： NaCl （维持渗透压） 0.5 g Na2SO4 （增加溶液比重使红细胞均匀分布，不易下沉） 2.5 g HgCl2 （固定红细胞并防腐） 0.25 g 蒸馏水 加至 100 ml 白细胞稀释液： 冰醋酸 （破坏红细胞） 2.0 ml 1%龙胆紫或 1%美蓝 （染白细胞核成淡蓝色，以便识别） 1.0 ml 蒸馏水 加至 100 ml（过滤后使用）
叶绿体色素的提取、 实验五 叶绿体色素的提取、分离和含量测定 一、叶绿体色素的提取与分离（一）原理 植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶 绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机 溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 色素分离的方法有多种， 纸层析是最简便的一种。 当溶剂 (有机推动剂) 不 断从纸上流过时， 由于混合物 (叶绿素提取液) 中各种成分在固定相 (滤纸纤维 素所吸附的水分) 和流动相 (有机推动剂) 间具有不同的分配系数， 所以移动速 度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 （二）实验材料21
新鲜植物叶片。 （三）仪器设备 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、大试管 (带胶塞)、大头针、天平、量 筒、毛细管、移液管（5ml） 。 分光光度计、 电子天平、 棕色容量瓶 (容量瓶 25ml)、定量滤纸、 吸水 纸、 擦境纸 （四）药品试剂 ① 95％乙醇；② 石英砂（二氧化硅） ；③ 碳酸钙粉； ④ 推动剂： （1）按石油醚：乙醚(4：1)比例配制(V/V) （2）石油醚 20ml+丙酮 2ml+苯 1ml （五）实验步骤 1．叶绿体色素的提取 (1) 取植物新鲜叶片 1g，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放人研钵中。 (2) 研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，2～3mL 100％丙酮，研磨至糊状， 再加 2～3mL 100％丙酮，以漏斗过滤，即得色素提取液。 2．叶绿体色素的分离 (1) 点样。把展层用的滤纸剪成 2×20 cm 的纸条，将其一端剪去两侧，中间 留一长约 1.5 cm，宽约 0.5 cm 的窄条，用毛细管取叶绿素提取液，如图点样于 “色点”处，注意每次所点溶液不可过多，点样后晾干，再重复操作数次。 (2) 分离。在大试管中加入推动剂，然后将滤纸固定于胶塞的小钩上，插入试 管中，使尖端浸入溶剂内 (色点要高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁)，盖 紧胶塞，直立于阴暗处层析。
当推动剂前沿接近滤纸边

缘时（1.5~2cm） ，取出滤纸，风干，观察色带的 分布。四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素（橙黄色）>叶黄素（黄色）> 叶绿素 a (蓝绿色) >叶绿素 b（黄绿色） 。用铅笔标出各种色素的位置和名称。 思考题22
(1) 研磨提取叶绿素时加入 CaCO3 有什么作用? (2) 叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，是什 么原因？
二、叶绿素含量测定（一）原理 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收 曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据 Lambert-Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响， 最后分别得到两种组分的含量。 叶绿素 a、b 在波长方面的最大吸收峰位于 665nm 和 649nm，同时在该波 长时叶绿素 a、b 的比吸收系数 K 为已知，即可以根据 Lambert Beer 定律，列 出浓度 C 与光密度 D 之间的关系式： D665=83.31×Ca+18.60×Cb…………………………….(1) D649=24.54×Ca+44.24×Cb…………………………….(2) (1) (2)式中的 D665、D649 为叶绿素溶液在波长 665nm 和 649nm 时的光密度。 C 为叶绿素 a、b 的浓度、单位为克/升。 82.04、9.27 为叶绿素 a、b 在、在波长 665nm 时的比吸收系数 K。 16.75、45.6 为叶绿素 a、b 在、在波长 649nm 时的比吸收系数 K。 解方程式(1) (2)，则得 ：
Ca= 13.7 D665 - 5.76 D649………………………(3) Cb= 25.8 D649 - 7.6 D665……………………… (4) C = Ca + Cb = 6.10 D665 + 20.04 D649…………(5)此时，C 为总叶绿素浓度，Ca、Cb 为叶绿素 a、b 浓度，单位为毫克/升，利用 上面（3） （4） （5）式，即可以计算叶绿素 a、b 及总叶绿素的总含量。 （二）方法步骤 1．称取 0.5 克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇 10ml 共研磨成匀浆， 再加 5ml 乙醇，以漏斗过滤，最后将滤液用乙醇定容到 25ml。 2．取上述色素提取液 1ml，加入 4ml 乙醇，混匀后转入光径为 1cm 的比色杯， 另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在 721 分光光度计下分别 以 665nm 和 649nm 波长测出该色素液的光密度。 （三）计算结果： 计算结果： 依照公式计算色素提取液中叶绿素 a，b 以及 a+b 的浓度；再根据稀释倍数 分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。23
叶绿素 a 含量（mg/g）=（Ca×提取液体积/1000×稀释倍数）÷样品鲜重 叶绿素 b 含量（mg/g）=（Cb×提取液体积/1000×稀释倍数）÷样品鲜重 叶绿素的总含量（mg/g）=（C×提取液体积/1000×稀释倍数）÷样品鲜重 （四）注意事项： 注意事项： 1、有机溶剂的使用安全 2、分光光度计的正确使用 3、层析时应尽可能不使滤纸边缘贴壁
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