生物技术制药重点简答总结

生物技术制药概论

1、 生物技术制药过程包括哪些内容（P5） 第一阶段：实验室研究阶段，也称为发现或探索研究，属于应用基础研究阶段;

第二阶段：产品开发阶段，属于应用阶段，与第一阶段统称为研发阶段，即临床前研究; 第三阶段：商业化阶段，是将产品推向市场的过程。

2、详细说明下面专业英语的含义：

Target identification and validation：靶基因的发现和证实

Assay development：建立检验方法 Proof of concept: 理论验证 High throughput: 高通量筛选

Lead generation: 先导化合物的发现 Lead optimization: 先导化合物的优化 System biology：系统生物学 Therapeutics: 治疗学

Commercialization : 商业化

First human dose：人类第一剂量

基因工程制药

3、有哪些方法合成第二链cDNA?

第一：自我引导合成法，（Self priming）：RNaseH 消化 mRNA 摸板 ；cDNA 3’ 形成发夹结构 （loop）；发夹作为引物合成第二链；需要酶：klenow 和 S1。 第二：大肠杆菌RNaseH酶降解取代法（Replacement synthesis）：RNaseH 在RNA摸板上形成缺口或空隙，从而形成RNA引物； 在E.coli DNA polymerase 的驱动下合成非连续性第二链，需要T4 连接酶接合形成完整第二链。

4、有哪些引物用来合成cDNA第一链？

Oligo dT (T=12-18),；随机引物 (n=6) ； 基因特异性引物(n=18-25)

5、建立cDNA 文库有什么好处？（书）

cDNA文库代表生物某一特定器官或组织在某一特定的发育时期，细胞转录水平上的基因群体。因为基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同的环境条件、不同的分化时期，故基因表达的种类和强度也不尽相同，因此cDNA文库具有组织特异性。一旦获得含有某种组织器官cDNA信息文库，就可用于筛选目的基因、大规模次序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。 6、判定从cDNA文库质量的标准？

（1）cDNA的数量: 1-2 million （2） cDNA 的平均长度: 1.5-2.0 kb

（3） 全长cDNA的含量: about 50% （4） 空载体, 源于ribosomal RNA的 cDNA 的数<10%

（5）是否含有目的基因

7、什么是基因表达？

外源基因(exogenous gene)在生物体内的转录(transcription)，翻译(translation) 和加工过程(post translation modification)的过程。

8、选择表达宿主细胞的原则

生长快，成本低，表达产量高，表达产物的生物活性，容易分离和纯化， 无毒。

9、大肠杆菌作为表达宿主的优缺点

优点：遗传性状清楚、操作简单、生长快、成本低、种类多、很多表达载体可供使用。成功生产了很多治疗性外源蛋白。

缺点：不能糖基化，产生内毒素，不能正确折叠形成核内包涵体（inclusion bodies)。

10、大肠杆菌遗传标记recA是什么意思？ Homologous recombination abolished, desirable for sequences containing direct repeats （同源重组的废除，获得包括直接重复的序列）

11、表达载体应具备的特点, 克隆载体应具备的条件

表达载体应具有的特征：

① 能够独立地复制（origin of replication）； ② 应具有灵活的克隆位点（multiple cloning site or polylinker）；

③ 具有方便的筛选标记（selectable marker），有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选； ④ 如果在大肠杆菌中表达，则应具有很强的启动子（promoter），能为大肠杆菌的 RNA 聚

合酶所识别；

⑤ 应具有阻遏子（suppressor），使启动子受到

控制，只有当诱导时才能进行转录； ⑥ 应具有很强的终止子（terminator）；

⑦ 所产生的 mRNA 必须具有翻译的起始信

号，即起始密码AUG（start codon）和核糖体结合位点。

克隆载体应具有的特征：

① 能够独立地复制（origin of replication）； ② 应具有灵活的克隆位点（multiple cloning site or polylinker）；

③ 具有方便的筛选标记（selectable marker），有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选； 12.、 pLac, LacI和IPTG的关系

pLac启动子受Lac I负调控，IPTG解除LacI的抑制作用

13、T7 启动子的工作原理。

工作原理：两个表达载体系统，一个表达T7RNA 聚

合酶，另一个含有T7启动子。T7聚合

酶为lacUV5 启动子所驱动。 lacUV5 为IPTG所诱导。

14、影响大肠杆菌表达的因素。

1、外源基因的拷贝数，即载体的拷贝数，取决于plasmid origin of replication 2、外源基因的表达效率

a 启动子的强弱,lac trp,tac,T7 b 核糖体结合位点的有效性 c SD序列和起始密码ATG的间距 d密码子codon preference, e.g.,

UCU,UCC,UCA,UGG 全都编码丝氨酸

3、表达产物的稳定性, 蛋白的半衰期，dimer (二聚体）较单体稳定，

4、细胞的代谢负荷，控制外源蛋白的表达，（tight control, without leaking). 改变宿主菌 5、工程菌的培养条件

15、基因体外表达好坏的重要参数

产量（yield)、生物活性(bioactivity)、理化性状、可溶性(solubility)等

16、基因体外移包涵体形式表达的优缺点

包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种

由不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体结构物。 优点：产量高、易纯化、抗蛋白酶、保护宿主 缺点：空间构型错误-无活性

17 、在哺乳动物细胞中表达常用的启动子 病毒源性和细胞源性强启动子，如mCMV、hCMV、hEF-1α、人的c-fos、鸡胞浆β肌动蛋白等启动子 18 、有哪些转染哺乳动物细胞的方法？ 一：病毒介导的转染方法；

二：非病毒介导的转染方法，包括：脂质体法、磷酸钙共沉淀法、鸡DEAE-葡聚糖法（常用） 钙转染法：原理是沉淀， 廉价

DEAE-葡聚糖转染技术

(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA

电转染(electroporation) 是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，可以促使细胞吸收外界环境中的DNA分子

压缩DNA转染法：原理是将DNA压缩成微小颗粒 ；

利用细胞周期转染法 ：原理是利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的孔隙增大的原理 ；

提高转染率 ：（chloroquine) 原理是提高细胞内lysosome 的pH

显微注射法 ：直接将目的基因通过注射器倒入受

体细胞中；DNA分布在细胞周围，让它通过穿刺形成的孔洞或跟随穿刺的针头进入细胞

19、 用逆转录病毒介导DNA的过程。

逆转录病毒载体是单链RNA病毒，进入细胞后逆转录为双链DNA并整合在细胞染色体，以此为模板合成病毒基因及子代RNA，再装配成病毒颗粒。载体分为两部分: 增殖性载体和非增殖性载体。 20、 逆转录病毒载体的主要结构。 一：携带目的基因、标记基因的载体。

二：以反式提供逆转录病毒蛋白的包装细胞系，这种辅助细胞含顺式功能有缺陷的逆转录病毒，其RNA不能被包装配成病毒颗粒，但能表达所有病毒蛋白，反式补偿进入包装细胞的载体所缺失的基因，将重组逆转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染力的复制缺陷型病毒，病毒转染细胞使外源基因稳定插入靶细胞染色体。（增殖性载体和非增殖性载体）

21. 什么是装配细胞？装配细胞的主要特点。 （1）装配细胞：是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gap、pol、evw所编码的蛋白质，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒

提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不同产生任何形式的病毒颗粒。 （ 2 ）含顺式功能有缺陷的逆转录病毒，其 RNA不能被包装配成病毒颗粒，但能表达所有病毒蛋白，反式补偿进入包装细胞的载体所缺失的基因，将重组逆转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染力的复制缺陷型病毒，病毒转染细胞使外源基因稳定插入靶细胞染色体。

22、 脂质体转染的原理。

脂质体使一种人造的脂质小泡，外周使脂双层，内部使水腔，形成双层质膜包埋DNA如 FuGene (Roche) LipoFectaimine (Invitrogen)，把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。

23、酵母表达载体的类型

根据载体的复制序列，载体可分为四类： A、 YEp类（yeast episomal plasmid （游离质粒）,酵母附加体质粒） 含有酵母自然质粒2? 的复制中心REp3 的载体，可独立增殖 ；拷贝数：低拷贝每个细胞5-50个质粒， 高拷贝数：100-200；转化率：103-105/ ?g DNA；不稳定：每代质粒丢失率10-2。

B、 YRp类（ yeast replication plasmid, 酵母复制型质粒）

含有酵母自然增殖中心ARS，由于质粒丢失率非常高10%，所以很少应用。

C、YCp类 (yeast centromeric plasmid,酵母着丝

型质粒）含有着丝点顺序和增殖中心ARS，可独立增殖，拷贝数特别低，每个细胞1-3拷贝。不稳定：每代质粒丢失率10-2ideal for cloning genomic DNA libraries

D、Yip 类 (yeast integrative plasmid,孝母整合型质粒）无增殖中心，不能独立增殖，但可通过同源DNA顺序整合到酵母基因组

24、杆状病毒表达系统的特点

1、安全性，杆状病毒具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物；

2、 容量大，杆状病毒基因组较大，具有多个天然启动子，可实现多基因表达；

3、 表达效率高，表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50%;

4、 表达产物具有活性， 昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应；

5、具有完整的感染性，昆虫病毒载体的重组区是基因组的非必需区，即使缺失也不会影响病毒的复制和表达，保持了昆虫杆状病毒载体的完整感染性；

6、标记显著。在多角体蛋白基因区插入外源基因后，失去了多角体蛋白的空斑较易辨认；

7、细胞可连续传代，25-30℃培养无需二氧化碳。可悬浮培养，适于规模化；

8、可用于有细胞毒作用的重组蛋白表达，当宿主细胞死亡后它可以感染另外的昆虫细胞。

25、哺乳动物细胞病毒载体有哪些？

（1）腺病毒载体(AV)：双链无包膜病毒，基因组大小为36 kb，其中4、7型AV在美国已使用多年，证明对人无害，AV有较大的宿主范围，可感染非分裂细胞。由于AV感染细胞时其DNA不整合至宿主细胞染色体，因此无潜在致癌危险。 (2) 腺相关病毒载体(AAV)。它是目前动物病毒中最简单的一类单链线状病毒，基因组仅5kb，是缺损型病毒，需辅助病毒如腺病毒、痘苗病毒存在才能进行有效复制和产生溶细胞性感染。AAV的最大特点是可以定点整合。

(3) 逆转录病毒载体：单链RNA病毒，进入细胞后逆转录为双链DNA并整合在细胞染色体，以此为模板合成病毒基因及子代RNA，再装配成病毒颗粒。载体分为两部分: 增殖性载体和非增殖性载体。 (4) 痘苗病毒载体(VV)：线性双链DNA，长180-200kb，其载体特点是：容量大，可插入25-40kh的外源基因；能同时插入多个外源基因；能在多种细胞中生长繁殖；

26、有哪些酵母用于重组蛋白的体外表达

酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis) 裂殖酵母（S．pombe）

甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast） 多形汉逊酵母 （Hansenula Plymorpha）糖基化位点：Asn-X-Thr 与哺乳动物糖基化位点相同

巴氏毕赤酵母 （Pichia Pastoris） 27、酵母表达系统的优点（书）

酵母表达系统的主要优势在于：它既具有真核细胞的特性又具有类似原核细胞的生长特点。

（1）与原核细胞相比酵母是真核生物，可对表达的蛋白进行修饰，有利于保持生物产品的活性和稳定性；

（2）可将表达的蛋白分泌到胞外不仅有利于产品的纯化，还避免了表达产物的过度积累对宿主产生不利影响;

(3)与哺乳动物细胞表达系统相比酵母更易于培养，可进行大规模的发酵生产，故在表达外源蛋白，特别是大分子真核生物蛋白方面得到了广泛的应用。

28、哺乳动物细胞表达系统的优缺点 优点：(1)哺乳动物细胞能精确有效的识别真核蛋白

合成、加工和分泌的信号并且能识别和剪

切外源基因中的内含子并加工为成熟的mRNA；

(2)可以指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N连接的糖基化和精确的O连接的糖基化等多种翻译后加工功能；

(3)哺乳动物细胞可以作为基因表达宿主细胞的有293、CHO、COS、BHK、SP2 /0、N IH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响； (4)信号多肽（signal peptide) 工作正常，形成分泌蛋白。可溶性蛋白，容易提纯；

缺点：培养液昂，贵产量低，容易污染。细部生长周期长，转化细胞产物令人担忧 29. 腺病毒能感染非分裂细胞吗？ 能

30、整合质粒和附加质粒的定义

整合型质粒 （integration plasmid)：整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在

附加型质粒 (episome plasmid)：附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。

附加体型载体在细胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白 31、Kozak序列的作用

Kozak系统分析了mRNA的5’端的序列翻译效率的关系。结果表明：最有效的翻译起始的共有序列是:5’-CCA/GCCATGG -3‘ (画线处为起始密码子)，而且最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的G。 32、描述载体的结构

（1）启动子：真核启动子都含有两个基本组成部分，TATA框和上游的富含GC的序列。启动子往往具有组织特异性。（猴病毒40(SV40)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；腺病毒晚期启动子(MLP)） （2）转录终止信号和高效多聚腺苷酸(polyA)加尾信号：强转录终止信号和加尾信号可以提高重组蛋白的表达水平。多聚腺苷酸(polyA)加尾信号：AAUAAA 位于polyA上游11-30个核苷酸处 （3）选择标记基因：如His， HA等 （4）核糖体结合位点 33、pCDNA3

PCNA基因启动子 34、瞬时表达

瞬时表达的特点：目的基因不整合到转化植物的基因组中，表达速度快。

35、在CHO (dhfr-) 细胞中筛选高效表达外源基因的原理

原理：CHO (dhfr-) 是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株，自身无法合成四氢叶酸，当携带dhfr基因的质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-dhfr-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆。 36、 什么是转染？

把基因的自然状态和突变体导入各种细胞来分析它的功能特点，这种将DNA导入哺乳动物细胞核内的过程称之为转染

37、 有哪些转染哺乳动物细胞的方法？

（1）非病毒性介导：钙转染法；脂质体转染法； DEAE-葡聚糖转染技术

(diethyl-aminoethyl-dextran)；电转染(electroporation) ；压缩DNA转染法；利用细胞周期转染法；提高转染率；显微注射法。

（2）病毒介导：逆转录病毒载体；腺病毒载体(AV) 38、 利用细胞周期转染法时在那个周期转染？ 利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的孔隙增大的原理

39、列举两个报告基因并说明原理。

报告基因（Reporter Gene）：载体分子上的一种特殊基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来，这种基因就是报告基因。

（1）β-半乳糖苷酶基因（lacZ）：能够催化乳糖水解为单糖，产物可使X-gal底物变蓝色。

（2）绿莹光蛋白基因 （GFP Gene）：稳定可溶性的蛋白，能持续发出绿色荧光。 40、有哪些溶解包涵体的方法。

包含体溶解使用的变性剂通常为：表面活性剂SDS（1-2％）、盐酸胍（5-8mol/L）和尿素（6-8mol/L）。SDS主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用, 盐酸胍和尿素破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的变性。

41、用什么化学物质溶解包涵体,包涵体复性有哪些方法，不同方法的优缺点

（1）包含体溶解使用的变性剂通常为：表面活性剂SDS（1-2％）、盐酸胍（5-8mol/L）和尿素（6-8mol/L）。 复性技优点 缺点 术 透析 简单 慢、使用大量的缓冲液 稀释 简单 慢、蛋白浓度会稀释到很低浓度 凝胶过在一步操作中直接进行自滤 动化复性并纯化 样品体积受限 亲和层直接进行自动化复性并纯析 化对样品体积没有要求 需要带有标签（如His） 42、His标签的结构、用途与工作原理 聚组氨酸标签（polyhistidine-tag，His-tag） 结构：常用由6个组氨酸组成的标签

用途：固定化金属离子亲和层析来进行纯化和固定

化，可与金属离子鳌合来分离和纯化，常用镍离子纯化。

原理：组氨酸咪唑环上的电子供体可与固定化的过

渡金属形成配位键，所以用咪唑竞争洗脱 43、几丁质结构域标签的用途与工作原理

用途：包含51个氨基酸，表达的融合蛋白可以用几丁质亲和层析纯化。

原理：利用内涵肽的特异性原位剪切直接获得目标

蛋白。（1）巯基诱导的N端剪切系统，将最后一个氨基酸进行了N454A突变；（2）巯基

诱导的C 端剪切；（3）pH诱导剪切，在pH6-7情况下剪切，在pH8的情况下剪切被停止；（4）可用于蛋白质环化的双内含肽系统。

44、谷胱甘肽转移酶标签的用途与工作原理

用途：GST的分子量约为26kD，用固相谷胱甘肽亲和层析分离融合蛋白

工作原理：与目的蛋白融合来纯化蛋白，用10mM

谷胱甘肽在非变性的条件下洗脱，用3C

蛋白酶切除GST

45、小泛素相贯修饰物标签的用途与工作原理 用途：核质转运、细胞周期调控、新号转导、转录活性调控。

工作原理：SUMO含有95-103个氨基酸，分子量

约为12kD ，结合于目的蛋白的氨基端，

常与His标签相连，用SUMO蛋白酶-1切除SUMO标签，切除后不留任何残基

46胰岛素的结构

胰岛素有51 AA，6kd，胰岛素由二个多肽链组成，即A链和B链（A链= 21 AA，B链=30 AA），二个多肽链由二个二硫键连接（二硫键：A7-B7 和A20-B19）；第三个二硫键 由A链之间的A6-A11组成。

47、胰岛素的主要功能

? 促进合成代谢，调节血糖稳定，主要靶器

官为肝脏、脂肪组织、骨骼肌。

? 对糖代谢的调节：吸收血糖、合成糖原。 ? 对脂肪代谢的调节：加速葡萄糖转变成脂肪酸。

? 对蛋白质代谢的调节：增加蛋白合成、抑

制蛋白分解。

48、调节胰岛素分泌的主要物资

（1）血糖的作用：血糖浓度是调节胰岛素分泌的最重要因素。胰岛素分泌的三个阶段：

（2）氨基酸和脂肪酸的作用：氨基酸促进血糖刺激胰岛素分泌的作用，以精氨酸和赖氨酸的作用最强 。

（3）脂肪酸和酮体大量增加时，也可促进胰岛素分泌。

（4）激素的作用：胃肠激素，如胃泌素、促胰液素、胆囊收缩素和抑胃肽，都有促胰岛素分泌的作用

49、锌离子在胰岛素制剂中的作用

胰岛素易形成多聚体，发生沉淀。锌离子可起到稳定所用。胰岛素制剂加约0.4% 锌使其成为稳定多六聚体，注射后解离，成为单体或二聚体被吸收。 50、加精氨酸延长胰岛素的药效的原理

胰岛素富含酸性氨基酸，可与碱性蛋白如精氨酸结合。形成大分子复合物这种复合物注射皮下或肌肉，吸收较慢，成为长效胰岛素。

51、甘精胰岛素（insulin glargine）的分子特征 分子特征：A链第21位上的氨基酸以甘氨酸（GIy）

替代丙氨酸（Ala）并且在B链的C末

端加上两个精氨酸。

52、門冬胰岛素（insulin aspart）的分子特征 分子特征：在B28位上以天冬氨酸替代脯氨酸，降低了该分子形成六聚体的能力。分子量为5.8 kDa。 53、胰高血糖素的主要功能

生理功能：与胰岛素的作用相反，胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素。胰高血糖素具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化。

54、胰高血糖素样肽的生理效应

GLP-1能够促进胰岛素分泌，其与胰岛β细胞细胞膜上的受体结合，激活腺苷酸环化酶，通过磷脂酶C途径刺激胰岛素从细胞排出。刺激胰岛β细胞增生， 抑制其凋亡。

55、干扰素的三个主要亚型

αβγ

56干扰素α-n1 （Wellferon）合成方法 用仙台病毒感染成淋巴细胞系而合成的α 干扰素 57、干扰素的三大功能

抗病毒、抗肿瘤、免疫调节

58、合成红细胞生成素的主要器官 在人类胎儿和新生儿时期，肝脏是产生EPO的主要器官。成年期，EPO主要产生于肾脏。 59、红细胞生成素的主要生理功能 调节红系祖细胞、红细胞生成的主要激素

抗体工程

60、 ADCC解释

抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc片段直接杀伤被抗体包被的靶细胞 61、名词解释： VL 轻链可变区 CL 轻链恒定区 VH 重链可变区 CH1 重链恒定区 1 CH2 重链恒定区 2 CH3 重链恒定区 3 CDR互补决定区

62、 CDR的数量和功能

轻链有三个CDR，重链有三个CDR。CDR的氨基酸顺序决定抗体的特异性

63、 说说抗体的结构

由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链内二硫键连接而成的四肽链结构，重链和轻链靠近N端为可变区（包括高变区和骨架区），靠近C端为恒定区（不同Ig长度不一由CH1到CH4），CH1与CH2为铰链区

64、 Fab和F（ab)2 的区别

Fab 是由木瓜蛋白酶水解IgG铰链区二硫键连接的2条重链近N端得到的

F（ab)2是由胃蛋白酶水解IgG铰链区二硫键近C端得到的

65、 抗体糖基化的部位 CH2

66、 什么叫HAMA反应？

人抗鼠抗体反应，鼠源的单抗对人体而言具有较强的免疫原性，因而人体产生抗抗体 67、 有哪些办法解决HAMA反应？

减少单克隆抗体的鼠源部分，如嵌合抗体、单克隆抗体的人源化、改型抗体、CDR移植 68、 为什么要人源化鼠抗体？ 减少HAMA反应

69、 重链和轻链基因片段的区别 轻链抗体基因片段：

V基因片段：85 J 基因片段：5 C基因片段：1 重链抗体基因片段：

V基因片段：300 D基因片段： 12 J 基因片段：4 C基因片段：1

70、 重组抗体与单克隆抗体的区别

单克隆抗体是B细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞融合后所产生的单克隆细胞系所分泌的抗体。 重组抗体就是按不同的目的和需要，对抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达得到的抗体分子。 重组抗体涉及到对抗体基因的改造

71、 制备单克隆抗体的原理

一个淋巴细胞只接受一个抗原决定簇刺激并经过扩增产生均一的同质抗体，将B细胞与缺乏HGPRT的骨髓瘤细胞融合并在HAT培养基上进行筛选就可获得具有无限繁殖能力并可分泌均质抗体的杂交瘤细胞，

72、 纯化抗体常用的方法

蛋白A（proteinA) 亲和层析提纯抗体：蛋白A特异性结合某些动物的抗体Fc 从而将抗体与其他杂蛋白分开

73、抗体可变区的结构

由N端到C端为FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

74、克隆抗体可变区的方法

采用RT-PCR的方法从mRNA分离可变区基因。利用抗体可变区框架区保守的特性引物，

75、克隆抗体可变区引物设计的原则

引物的设计允许有一定的简并性。5′末端引物可以设计在第一框架区，3′末端的引物可以设计在保守的恒定区或J链区。

76、简并引物（degenerated primer）

序列中含一定的有简并性、可与多个碱基配对的碱基的引物

77、ScFv 抗体的结构

由完整的轻链和重链的VH+CH1组成 78、Fab 抗体的结构

由完整的轻链和重链的VH+CH1组成 79、Fv 抗体的结构

由VL 和 VH组成，VL VH由非共价性结合 80、单域抗体的结构 由一条VH或VL构成 81、轻链的种类

κ型和λ型

82、有哪些鼠抗体人源化的方法 嵌合抗体、改形抗体、表位印迹选择 83、人-鼠嵌合抗体的结构

将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达。80﹪的成分是人源性的。

84、人-鼠嵌合抗体的优缺点

优点：效应功能部分可按照需要进行改造，如人的IgGl和IgG3激发的补体或细胞介导的裂解反应是最强烈。嵌合抗体人源的恒定区在治疗中能避免抗同种型抗体的产生，这也是它明显的优点。 缺点：与人单克隆抗体相比，它也会引发HAMA反应；抗体分子质量较大，在体内存在的时间较长，可能引发不良反应；不容易渗透到实体瘤等目的组织；不容易大量表达，且生产成本高等。 85、什么是改型抗体

将人抗体可变区中互补决定簇序列改换成鼠源单抗CDR序列。主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体”

86、小分子抗体的种类和优点

种类：

1 Fab 2 Fv 3 ScFv 4 单域抗体 5 最小识别单位（MRU） 优点

1） 减少非特异性，肿瘤显像清楚

2） 增加渗透性，增加对肿瘤的治疗效果， 3）容易与杀伤性物资连接

87、有哪些筛选阳性抗体克隆的展示技术？

1） 醋酸纤维膜杂交法 2） 噬菌体展示法 3）核糖体展示法 4）酵母展示法

5）大肠杆菌展示法

6）质粒展示技术

88、展示技术的共同特点是什么？ 高通量 高容量 高敏感度

容易回收抗体基因

89、噬菌体展示技术的特点。

将外源蛋白质或多肽的基因与噬菌体衣壳蛋白(PIII，PⅧ等)的基因进行融合，制造出有扩增能力且在噬菌体表面表达某一外源性蛋白质或短肽的融合噬菌体，并且其遗传密码信息稳定整合到个体噬菌体的基因组中

90、在噬菌体展示技术中可与外源因融合的噬菌体基因是哪些？

将抗体基因与pIII或pVIII 基因相融合。 91酵母展示技术的原理。

a 凝集素-目的蛋白表面展示系统：将目的蛋白作为C 端与a 凝集素 Aga2p 亚基的N 端融合的表面展示系统。a 凝集素有两个糖蛋白亚单位。含有725 个氨基酸残基的Aga1p亚单位通过β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上, 含有69个氨基酸残基的Aga2p亚单位通过两对二硫键与Aga1p 亚单位相连接。

92、核糖体展示技术的原理。

核糖体展示法是一种筛选蛋白或多肽的无细胞系统，

原理是利用蛋白合成后仍与mRNA 相联系，形成稳定的

蛋白-核糖体- mRNA复合物（PRM）的现象，可用配体亲

和力的方法筛选功能蛋白并同时分离编码该蛋白的mRNA。

进而用RT-PCR的方法 获得目的基因

93、在核糖体展示技术中稳定蛋白-核糖体-mRNA复合物的方法

1） 加入抗菌素， 如在原核系统中加入 利福平（rifampicin）或氯霉素（ chloramphenicol ）； 在真核系统中加入cytoheximide 蛋白合成抑制剂,目的是终止翻译。

2 ）删除终止密码（Stap Codon），正常情况下终止密码会使新合成的多肽解离mRNA，使核糖体在mRNA 的末端终止 94、细菌展示技术的原理。

细菌展示技术又称以细胞内膜为基础的细胞间质表达技术（anchored periplasma expression technology, APEx)（图3-39和图3-40）。技术特点是以特定的埋藏在细胞内膜的信号肽诱导ScFv定位于细胞间质，外膜被酶消化后，ScFv 可与培养液中标记的抗原相结合。阳性克隆可用流式细胞分离仪分离，用FCR技术分离阳性ScFv 基因 95、质粒展示技术的原理。

质粒展示技术是以“蛋白质-DNA复合物”形成为基础，将随机多肽与DNA结合蛋白以融合蛋白的形式

表达。由于在细胞内表达的融合蛋白及其相应的编码质粒结合在一起，通过筛选可以得到目的蛋白及其编码的基因序列。质粒展示技术的应用是建立在LacI和Lac操纵子 (LacO)可控结合的基础之上，用于蛋白质展示的质粒既包括LacI的可读框，也包含LacO的基因序列。

96、在噬菌体展示中哪些蛋白可与展示多肽融合，并说明道理。

外壳蛋白III和VIII，III在一端，VIII为主体而且数量多

97、谈谈工程抗体的应用。 1 中和抗体

2 抗器官移植反映抗体 3 肿瘤显像

4 肿瘤治疗-放射性免疫疗法（生物导弹） 5 抗炎症反应和自身免疫病抗体

6 根据配体/受体复合物可进入细胞内（Internalization）从而降解细胞受体的原理，介导细胞表面受体进入细胞。可利用这一现象达到如下目的：

1） 通过促进受体细胞内部化减少引起细胞过度生长的生长受体，如EGF受体，FGF受体等，从而减弱配体促进细胞生长的速度。 2 ）借助抗体/受体复合物细胞内部化的机会，携带毒素，RNA酶，同位素等。

98、用于肿瘤显像的抗肿瘤抗原的抗体是怎么结合同位素锝的？

1）在抗体分子的C端加一个半胱氨酸（Cysteine）与锝形成二硫键。

2）抗体分子与金属结合蛋白融合，如金属硫因蛋白

metallothionein ，从而连接锝。

3） 在抗体分子C端加上六个组氨酸（histidine),通过鏊合作用于锝结合。

99、 Rituximab的治疗机理。

Rituximab能够特异性地结合抗原CD20，CD20在90％以上的非霍奇金淋巴瘤的B细胞上都有表达，但在造血干细胞、原B细胞、正常的浆细胞或其他组织并未被发现。Rituximab的Fab结构域结合到B淋巴细胞的CD20抗原上，Fc结构域介导溶解B细胞的免疫效应功能。细胞溶解的可能机制包括补体介导和抗体介导的细胞毒作用。 100、Infliximab 的治疗机理。

Infliximab通过与可溶性的穿膜炎症细胞因子的高亲和力结合，中和TNF-α的生物学活性，并且抑制TNF-α与其受体的结合（TNF-α可诱导前炎症细胞因子，增强白细胞的迁移，活化嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的活性，诱导急性期反应）。

101、 Etanercept的设计和治疗机理。

与Infliximab类似，均是抗TNF-α的抗体，中和TNF-α的生物学活性，以降低滑膜和关节损伤。 102、 Bevacizumab的治疗机理

一般认为癌細胞血管新生的目的在于向宿主吸收养份，并可透过新生的血管转移至其他部位。因此若能有效抑制癌细胞的血管新生，应可压制癌细胞的生长，并减少转移。目前已经知道癌细胞的血管新生牵涉到多种细胞激素的分泌，其中血管內皮细胞生长因子（VEGF)为最主要的调控因子。研究发现VEGF在多种肿瘤，如脑瘤、肺癌、乳癌、消化道肿瘤及泌尿道肿瘤等均有过度表达的现象。這种情形也见于血液恶性疾病，如淋巴瘤、多发性骨髓瘤及白血病。VEGF抗体可以减少肿瘤引起的血管新生。因此VEGF是一個理想的肿瘤“標靶”。Avastin可有效抑制多种癌症细胞株的生长，而且和化学治疗合用有加乘效果。 103、拮抗药（agonist）策略

答：1 显性阴性作用（dominant negative)， 如 IL-1ra

2 可溶性受体 （soluble receptors) ，如 VEGF 受体Flit

3 中和作用因子抗体

4 中和受体抗体

的毒性

107、N-linked 糖基化位点的氨基酸结构 N-糖肽键连接的Asn，经常处于多肽链的Asn-X-Thr/Ser序列中，其中X为除脯胺酸外的任一氨基酸残基。

108、O-linked糖基化位点的氨基酸结构

O-糖肽键大多连接在脯胺酸附近的Ser 或 Thr上。

基因工程药物设计

104、复制蛋白药物的困难

大多数蛋白药品是人的同源蛋白，注射后患者表现正常的免疫耐受性。对这类药物，污染物 （如宿主蛋白、宿主细胞DNA等）或分子多聚体是破坏免疫耐受性主要原因

105、改进现有蛋白药物的方法

1 根据理论有目的突变

2 增加二硫键，改变分子稳定性 3 随机突变，高通量筛选

4 增加或减少糖基化位点和种类

5 与IgGFc融合增加蛋白药物的可溶性 6 与聚乙烯二醇化增加小分子量蛋白药物的半衰期

7 改变 codon preference (密码偏爱性）增加表达量

8 剂型改变，给药途径改变方便病人

106、蛋白药物聚乙烯而醇化（pegylation）的作用

延长蛋白药物在血浆中半衰期， 增加药物的可溶性，减少酶降解，掩盖药物的抗原性。减少药物

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