分子生物学实验报告 陈倩倩 - 图文

质粒DNA的提取，纯化及验证

陈倩倩 学号：118627140313

一，实验目的：1，掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。

2，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二，实验原理：碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 三，实验仪器试剂和材料：

恒温振荡培养箱， 高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管等

菌体：E.coli DH5α受体菌

试剂：LB培养基，氨苄青霉素，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液。

四，实验步骤及现象 ① 准备灭菌

㈠ LB培养基20ml/100ml ，50ml/300ml， ㈡ 枪尖：1000μl,200μl,20μl ㈢ 离心管1.5ml/500ml,50ml×2 ㈣ 吸管：10ml

② 质粒的提取。 步骤 1，E.coli DH5×﹙Puc19﹚在20ml培养基中培养过夜，转接到50ml培养基37 度培养四到五小时，7000rpm离心五分钟，称量空管重量。 备注 1，溶液装入离心管时，要使液面离管顶至少1cm 2，在接菌时，将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触，然后轻轻摇动三角瓶，让液体的LB培养基轻轻冲刷菌体，当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时，接菌成功，再轻轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中 空管质量为13.877g 2，弃上清，加5ml溶液Ι，加入溶液Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振打散菌泥洗涤，再离心干燥，荡，无白色菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。 称重。 称重后其菌泥质量不足200mg，按200mg计算 3，每100mg菌泥加溶液Ι1ml打散混匀，冰溶5min 1，避免破壁后的的染色体断裂，并且此时出现粘稠透明的胶状物 2，冰浴的目的即为降低酶的活性，防止酶将质粒DNA降解。 溶液Ⅱ为强碱性溶液，目的是使细胞破裂，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂。在加溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，此时，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状。 4，按量加入溶液Ⅱ2ml，轻加轻摇混匀。 5，按量加入溶液Ⅲ1.5ml,轻加轻摇，冰浴十分钟。 溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。 6,12000rpm离心15min，上由于DNA带负电荷，加入NaAc的作用就是是中和DNA清液轻轻转入新管，再加入所带的负电荷，使DNA之间的排斥力减小，有助于DNA十分之一3mol/lNaAc，混匀。 的沉淀 7，加入两倍体积冰无水乙醇，混匀。零下20度沉淀 无水乙醇的作用是沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂 70％乙醇的作用一方面是继续沉淀DNA，另一方面可以除去上一步骤中溶解在溶液中的盐离子 用记号笔在沉淀周围做好记号 8,12000rpm离心15min，弃上清加入3ml70%乙醇，不打散沉淀洗涤一遍 9,12000rpm离心5min﹙注意沉淀位置﹚弃上清，干燥，加入1mlTE溶解。 ③ 质粒纯化 加入RNaseA使其终浓度为50微克每毫RNA酶分解掉RNA 升，37度0.5至1h，平分为两个小管。 1， 加等体积的Tris饱和苯酚溶液混匀7000rmp离心15min，上清液转入新管。 2， 加等体积的苯酚：氯仿（1:1）混匀7000rmp离心15min，上清液转入新管。 3， 加等体积的氯仿混匀7000rmp离心15min，上清液转入新管。 4， 12000rpm离心15min，上清液轻轻转入新管，再加入十分之一苯酚具有强氧化性，在此步骤中是使蛋白质变性，从而使蛋白质沉淀下来 其中是24：1的氯仿和异戊醇，异戊醇的作用有消泡，以及其自身的颜色利于分相，此步骤用于抽提酚和酯以及去蛋白 确保酚被抽提干净，此三个步骤，可以根据具体情况适当重复，省简。 3mol/lNaAc，混匀。 5， 加入两倍体积冰无水乙醇，混匀。零下20度沉淀0.5h以上 6， 12000rpm离心15min，弃上清加入300微升70%乙醇，不打散沉淀洗涤一遍 7， 12000rpm离心5min﹙注意沉淀位置﹚弃上清，干燥，加入100微升TE溶解至一个管。 先在其中一个管中加入50微升TE然后带起溶解倒入另一管，用剩下的50微升TE洗涤第一管，再倒入另一管。 ④ 质粒检测

用0.9%的琼脂糖电泳检测：

1， 称重0.28g琼脂糖，用40ml1×TAE微波炉加热，制平板 2， 取三微升质检样品与1微升电泳载样液混匀点样电泳1h 3， 加入溴化乙锭染色10min凝胶成像仪观察记录结果。 五，实验结果及分析 实验点样电泳结果 染色体DNA条带 Puc19电泳结果 λDNA/ HindⅢ Puc19超螺旋质粒 λDNA hindⅢ RNA条带或开环质粒DNA或DNA断片 一， 我们组的实验结果所得的质粒DNA纯度还算理想。本实验电泳条带清晰：染色体DNA的含量很低，说明提取样品的纯度较高；没有开环的DNA，可能与过程中振荡的剧烈程度，保温时间有一定关系。但是仍有不足之处，蛋白质杂质含量较多，其原因较多，一个是由于我们未用平衡酚去除蛋白质，而是使用了酚、氯仿、异戊醇的混合液，致使蛋白质残留较多。另外，电泳条带中参照物的条带只有六条，

少了两条，可能是由于电泳我们组一共跑出三条带，分别为DNA,超螺旋Puc19质粒DNA,RNA。

二，超螺旋状态的pUC19质粒，书上查得其质粒大小2.69Kbp，与标准的对比由

亮度可知，我们提取的量大体上还不错。

三，对于出现RNA条带可能的原因是RNase处理时间不够，而如果是开环的DNA

或染色体DNA断片则可能是震荡过激烈。

四，而对于染色体DNA 的条带亮度比较暗淡来说，我们组分离掉的染色体还很

成功。

五，点样处有亮带，说明有杂质蛋白质的存在 六，注意事项

一，酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，

应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

二，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要

快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。

三，溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱

基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。

四，沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀

完全。除用乙醇沉淀DNA外，还可使用0．6倍体积的异丙醇，但异丙醇也能将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进行，并且时间不宜太长(限20 min内)。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。

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