R023A PrimeScriptTM High Fidelity RT-PCR Kit

Code No. R023A

研究用 PrimeScript? Ⅱ High Fidelity RT-PCR Kit

说明书

v201211Da

目 录

内 容

● 制品内容 ● 保 存 ● RNA样品制备 ● 试剂盒原理 ● 试剂盒特点 ● 使用注意

● 实验操作（2 Step RT-PCR） ● 实验例（2 Step RT-PCR） ● 实验操作（1 Step RT-PCR） ● 实验例（1 Step RT-PCR）

● PCR扩增产物的电泳、克隆和测序相关说明 ● 关联产品

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PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种使用两种引物扩增目的DNA的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用将RNA反转录成cDNA后扩增（RT-PCR），PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit是一种对长链RNA及富含GC序列的RNA合成cDNA时具有高保真性的RT-PCR用试剂盒。

本试剂盒中使用的PrimeScript II反转录酶是改良型的PrimeScript RTase，可在合成长链cDNA时发挥效力，同时PCR时使用了对长链及富含GC序列的cDNA扩增时具有高保真性的DNA聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。因PrimeScript II RTase可最大限度地抑制由于引物错配引起的非特异性扩增，即使使用高浓度的Oligo dT Primer进行反转录反应也不会导致cDNA合成时的阻害作用，因此使用高浓度的RNA作为模板也可进行良好的反转录反应。

本试剂盒中使用PrimeScript II RTase与RNase Inhibitor的混合型PrimeScript II RT Enzyme Mix。另外，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase克服了以往的高保真酶由于核酸浓度过高而存在的反应阻害性，在高浓度核酸存在条件下也能发挥其效力，可以在更宽广的RNA模板范围内获得cDNA扩增产物。 本试剂盒具有以下优点:

1. 能够从长链RNA及富含GC序列的RNA中获得错配率很低的cDNA扩增产物。 2. 在42℃条件下反转录反应也可以使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸。 3. 反应体系中Total RNA的使用范围非常宽广，便于使用。

本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需要的全部试剂。并且，也可以进行1 Step RT-PCR反应。

● 制品内容（50次量*1）

1.PrimeScript II RT Enzyme Mix 2.5×PrimeScript II Buffer 3.dNTP Mixture（10 mM each） 4.Oligo dT Primer（50 μM） 5.Random 6 mers（20 μM） 6.PrimeSTAR GXL for RT-PCR 7.5×PrimeSTAR GXL Buffer 8.Control F-1 Primer*2（20 μM） 9.Control R-1 Primer*3（20 μM）

10.Positive Control RNA（2×105 copies/μl）

11. RNase Free dH2O

*1反转录反应20 μl、PCR反应50 μl，2 Step RT-PCR时可使用50次。 *2 Positive Control RNA用上游引物。 *3 Positive Control RNA用下游引物。

【各种引物序列】

引物名称 Random 6 mers Oligo dT Primer Control F-1 Primer

Control R-1 Primer 各引物序列 pd (N) 6 Takara独自开发的dT区域的序列 5＇-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3＇ 5＇-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3＇ -1-

50 μl 200 μl 100 μl 50 μl 50 μl 100 μl 500 μl 10 μl 10 μl 20 μl 1 ml

【Positive Control RNA】

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。

图1. Control RNA: 使用Control Primer时所能扩增的DNA片段

【试剂盒以外必需试剂及仪器】

1. 基因扩增系统（authorized instruments）

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（Code No. TP600 / TP650）等 2. Agarose Gel

Agarose L03（Code No. 5003） NuSieve? 3：1 Agarose等 3. 电泳装置

Mupid? -2plus（Takara Code: M-2P） Mupid? -exU（Takara Code: EXU-1）等 4. 微型离心机

5. micropipette及tip（经高压灭菌处理后的）

● 保 存： -20℃

● RNA样品制备

本试剂盒是将RNA合成cDNA，然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。 （2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

另外，试验台、实验器具、tube等可使用RNase-OFF（Code No. 9037）去除RNase。RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。

【制备方法】

从培养细胞、组织中提取高纯度RNA时，可以使用柱子法NucleoSpin? RNA II（Code No. 740955.10/.50/.250）和AGPC法的简便试剂RNAiso Plus（Code No. 9108/9109）。

● 试剂盒原理

PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit的标准操作流程（2 Step RT-PCR）：首先使用PrimeScript II RT Enzyme Mix将RNA合成cDNA，再取cDNA合成液的一部分作为模板，由PrimeSTAR GXL DNA Polymerase进行PCR扩增。

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将RNA反转录成cDNA的引物可以使用Random 6 mers或Oligo dT Primer及基因特异性下游引物。 选择使用1 Step RT-PCR时，在一个反应体系中同时加入PrimeScript II RT Enzyme Mix 和PrimeSTAR GXL for RT-PCR，先将RNA合成cDNA后，再进行PCR扩增反应。 将RNA反转录成cDNA的引物可以使用PCR时的下游引物。

● 试剂盒特点

使用2 Step RT-PCR标准操作流程时。

RNA模板 适用于所有RNA

使用1 Step RT-PCR操作流程时。

RNA模板 适用于所有RNA

扩增片段大小 反转录酶 DNA Polymerase RNase Inhibitor 1st Strand cDNA合成用引物 操作 ～6 kb PrimeScript II RTase（使用温度45℃） PrimeSTAR GXL for RT-PCR 必须使用（PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有） 使用特异性下游引物（PCR扩增反应用反义链引物） （不可使用Random 6 mers及Oligo dT Primer） 在同一个反应管中可连续进行RT-PCR反应

1st Strand cDNA合成用引物 扩增片段大小 反转录酶 DNA Polymerase RNase Inhibitor ～13.5 kb PrimeScript II RTase（反转录反应最适温度42℃） PrimeSTAR GXL for RT-PCR 必须使用（PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有） Random 6 mers Oligo dT Primer 可供选择 特异性下游引物

● 使用注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1） 当同时需要进行多个RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括RNase

Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2） 使用PrimeScript II RT Enzyme Mix、PrimeSTAR GXL for RT-PCR等酶类产品时，应轻轻混匀，

避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

3） 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放入-20℃保存。

4） 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～

-80℃。

5） 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。

【2 Step RT-PCR时引物的选择】

反转录反应引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用。一般情况下反转录引物的选择请参考以下说明。

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上述反应条件下扩增效率不良时，请进行如下研讨： ＜扩增产物出现Smear及非特异性扩增时＞ ① 将退火温度每次间隔2℃上升至63℃。 ② 使用2 Step PCR。

③ 引物的Tm值在50℃以下时，退火温度尝试在50～55℃之间选择。

＜无扩增产物或扩增产物少时＞ ① 模板使用量根据推荐量来添加。 ② 增加PCR循环圈数至40~50 Cycles。

③ 尝试每次间隔2℃下降退火温度。

* 使用本试剂盒进行PCR反应时不能用dUTP替代dTTP（反应效果明显下降）。此外，请尽量避免使用

含有次黄嘌呤的引物。

● 实验例（1 Step RT-PCR）

1 . 扩增片段长度确认

，用1 Step RT-PCR对不同① 以人心脏total RNA和HL60 total RNA为模板（100 ng/50 μl反应体系）

长度的目的片段进行扩增。 ② PCR反应条件如下：

45℃ 94℃

98℃

60 or 55℃ 68℃

30 min 2 min

10 sec

15 sec 30 Cycles 1 min/kb

③ 可以扩增0.5-6 kb的片段。

M1 1 2 3 4 5 6 M2

1: TFR 0.5 kb 2: Dystrophin 1 kb* 3: Dystrophin 2 kb* 4: CCND2 2.8 kb 5: TFR 4.4 kb 6: Dystrophin 6 kb* M1: pHY Marker

M2: λ-Hind III digest

* Dystrophin基因扩增使用人心脏Total RNA为模板，其他使用HL60 Total RNA为模板。

2 . 灵敏度检测。

① 以不同量的HL60 total RNA为模板，以428 bp的GAPDH基因为目的基因，进行1 Step RT-PCR反

应检测灵敏度。 ② PCR反应条件如下：

45℃ 94℃

30 min 2 min

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③ Total RNA使用量为10 pg，30 Cycles时可以确认到428 bp的扩增片段；Total RNA使用量为1 pg，40 Cycles时可以确认到428 bp的扩增片段。 30 Cycles

98℃

55℃ 68℃ 10 sec

15 sec 30 or 40 Cycles 30 sec

40 Cycles

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

Total RNA使用量 1: 1 pg 2: 10 pg 3: 100 pg 4: 1 ng 5: 10 ng 6: 100 ng 7: 1 μg 8: 2 μg 9: 4 μg

M: pHY Marker

● PCR扩增产物的电泳、克隆和测序相关说明

1 . 扩增产物的电泳。

使用本试剂盒扩增得到的PCR产物进行电泳时，推荐使用TAE Buffer。使用TBE Buffer进行电泳有时结果不好。 2 . PCR产物的克隆。

使用本试剂盒扩增得到的PCR产物几乎都是平滑末端，可以直接（必要时PCR产物经磷酸化）与平滑末端的去磷酸化载体进行连接。平滑末端载体的克隆可通过Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)（Code No. 6027）实现。

使用本制品扩增的PCR产物不能直接与T-Vector连接，需要在3’末端加dA。此时，可使用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR（Code No. 6019）。 3 . PCR产物的限制酶酶切。

PCR产物要进行限制酶酶切时，需要先进行苯酚/氯仿抽提或使用回收试剂盒等除去体系中的蛋白质。特别是在使用形成3’突出末端的限制酶（如Pst Ⅰ等）时，如果有PrimeSTAR GXL for RT-PCR的3’→5’ Exonuclease活性残留时，能将3’突出末端切掉。 4 . PCR产物的直接测序。

使用本试剂盒扩增得到的PCR产物直接进行测序时，由于PrimeSTAR GXL for RT-PCR具有3’→5’外切酶活性，建议先进行苯酚/氯仿抽提或使用回收试剂盒等除去蛋白质。

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● 关联产品

PrimeScript? Reverse Transcriptase（Code No. 2680A/B/C） PrimeSTAR? Max DNA Polymerase（Code No. R045A） PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（Code No. R050A/B） PrimeScript? RT-PCR Kit（Code No. RR014A/B）

PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2（Code No. RR055A/B） PrimeScript? High Fidelity RT-PCR Kit（Code No. R022A/B）

PrimeScript? II High Fidelity One Step RT-PCR Kit（Code No. R026A/B） TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice? Gradient（Code No. TP600） Agarose L03「TAKARA」（Code No. 5003/5003B） NuSieve? 3:1 Agarose（Code No. 50090/50091/50094） RNase-OFF?（Code No. 9037）

NucleoSpin? RNA II（Code No. 740955.10/.50/.250） RNAiso Plus（Code No. 9108/9109）

Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?（Code No. 6019） Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)（Code No. 6027）

NucleoSpin? Gel and PCR Clean-up（Code No. 740609.10/.50/.250）

NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE

[M54] PrimeSTAR HS DNA Polymerase

This product is covered by the claims of U.S. Patent No. 7,704,713 and its foreign counterparts.

[L15] Hot Start PCR

Licensed under U.S. Patent No. 5,338,671 and 5,587,287 and corresponding patents in other countries. Note

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