中标国家自然科学基金标书部分内容

肾小管上皮细胞钙通道与尿路结石形成的相关性研究 (限400字)： 尿石症的病因未明，其发病率和复发率较高，防治措施令人不满意。设想某种病理因素使肾小管上皮细胞的钙通道部分或完全失活，肾小管对钙的重吸收减少，导致尿钙的排出增加，可能为尿路结石形成的机制。本实验在既有钙通道与高尿钙相关研究的基础上，进一步摘 研究钙通道与尿路结石形成的相关性。通过制备Vit D缺乏实验动物模型，分别用免疫组化要 技术及荧光探针钙图像技术观察实验模型钙通道表达、钙离子分布的变化与尿路结石形成的关系；比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者肾小管上皮细胞钙通道的表达差异，为寻找尿石症的病因提供实验依据；通过体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，用全细胞膜片钳技术观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为制定尿石症的防治措施提供依据。 关 键 词(用分号分开，最多5个) 钙离子通道；肾结石；肾小管上皮细胞 报告正文

（一）立项依据与研究内容

1.项目的立项依据

泌尿系结石是一个全球性的疾病，是我国最常见的泌尿外科疾病之一。由于当前尿石症的确切病因仍不十分清楚，导致其发病率居高不下，治疗后复发率也很高，预防措施并不令人满意。因此，对尿石症的病因研究具有重要的临床意义。

尿石症的的发病因素包括遗传、环境、饮食、疾病和代谢等多个方面。其发生的机制历史上也经过长期的探索，提出了各式各样的学说。如肾乳头钙化斑学说，基质模板上形成学说，结石首发于肾淋巴系统学说，尿液晶体胶体失衡学说及尿液的过饱和结晶和抑制物学说等。这些学说只在结石形成的某一片段或某一方面阐述结石的形成机制，而且部分机制还未得到全面、深入的研究。

钙代谢异常是近年研究较多的引起尿路结石的重要因素之一。钙是泌尿系结石成分中最主要的阳离子，Daudon等对10617份泌尿系结石标本作红外光谱分析，发现86%的泌尿系结石含有草酸钙，80%含有磷酸钙。文献统计至少40~50%的尿路结石患者合并高钙尿症。我们对84例复杂性肾结石标本进行结石化学成分分析，其中70例（83.3%）为含钙成分的混合结石；而且发现至少19.3%(11/57)的小儿上尿路结石合并高钙尿症。物理化学研究表明，尿液中的草酸钙和磷酸钙的饱和度与尿钙的浓度有关，尿钙增高易于诱发或促进含钙尿路结石的形成。

高钙尿症的病理生理机制的研究，包括甲状旁腺素的作用、高钙饮食、骨代谢异常、细胞因子的作用、遗传因素、钙通道或钙泵等方面。近年来人们对钙通道及钙的机体代谢进行了深入的研究：

血清钙正常水平的维持依赖于肠道对钙的吸收、骨钙的释放、肾对钙的重吸收的调节作用。正常情况下，体内并不存在骨钙的过度释放或沉积过程。体内钙环境的正常维持实际上取决于肠道钙吸收和尿钙排泄的平衡关系。无论在肾脏和在肠道，钙可

通过被动滤过和主动重吸收两种途径进入细胞外液。而钙的主动重吸收由钙调激素包括1,25-二羟维生素D3和甲状旁腺素（PTH）进行调节。钙的主动吸收主要发生在近端小肠与肾的远曲小管（DCT）和集合管（CNT）。

从细胞水平看, 钙的主动吸收过程分为三个步骤:1、钙离子通过管腔膜的钙通道（TRPV5/6）进入小肠或肾小管上皮细胞；2、在细胞内，钙离子与钙结合蛋白结合（包括钙结合蛋白D28K和/或D9K），弥散至基底膜侧；3、钙离子通过钠-钙交换（NCX1）和/或钙-ATP酶主动转运进入细胞间隙。管腔膜的钙通道（TRPV5/6）是钙主动吸收的主要限速步骤，对维持钙的体内平衡至关重要。2004年12月~2005年12月，本课题组进行《二羟吡啶在实验小鼠草酸钙结石形成的抑制作用》研究，发现钙通道兴奋剂二羟吡啶可明显抑制实验小鼠尿钙的排出及肾脏草酸钙结石的形成。

研究离子通道功能最直接方法是用膜片钳技术直接测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电位的变化。膜片钳技术是利用一个玻璃吸管电极完成膜片或全细胞膜电位的监测、钳制和膜电流的记录，通过观测膜电流的变化来分析通道个体或群体的分子活动、探讨离子通道的特性。膜片钳技术的优点就是在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素，研究它们对通道功能的可能影响。通过研究，一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理；另一方面，分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点，提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。

分子生物学技术为离子通道的分子结构分析、基因克隆、功能表达研究提供了有力工具，对于编码离子通道亚单位的基因结构可采用基因定位克隆确定其染色体上的定位，用逆转录-聚合酶链反应、Northern杂交等明确其在器官组织中的分布，用Western杂交检测基因表达产物等。荧光探针钙图像技术为检测细胞内游离钙离子浓度提供了有效手段，常用的荧光探针有Fura-2/AM、Indo-1/AM、Fluo-3/AM、Calcium Green等，常用的检测仪器有双波长显微荧光光度计、激光扫描共聚焦显微镜等，目前国外Olympus、Zeiss、Spex等公司已生产了测定细胞内游离钙离子的显微荧光装置。将离子浓度图像和膜片钳记录结合，同时进行光电联合检测，从离子产生的离子浓度、图像变化和电信号变化多个方面研究离子通道，将获得更多的离子通道功能信息。对获得性离子通道病，主要采取患者血清或提纯的免疫球蛋白被动转移或人工重组抗原主动转移于整体实验动物的免疫方法；或将传代细胞与患者血清或纯化的抗体共同培养，而后对其电生理改变进行检测。通过制备离子通道病研究模型，结合分子生物学、膜片钳记录、荧光探针钙图像分析、细胞内电生理记录、免疫组化等多种技术进行在体和离体实验研究，是目前离子通道病的主要研究策略。

设想在某种因素（包括遗传、激素或饮食因素）使肾小管上皮细胞钙通道部分或完全失活，导致肾小管对钙的重吸收减少，导致尿液钙的排出增加，可能成为高尿钙症和尿路结石形成的机制。本实验在既有钙通道与高尿钙相关研究的基础上，进一步研究钙通道与尿路结石形成的相关性。通过制备Vit D缺乏实验动物模型，分别用免疫组化技术及荧光探针钙图像技术观察实验模型钙通道的表达、钙离子分布的变化与尿路结石形成的关系；比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症

患者及非尿石症患者肾小管上皮细胞钙通道的表达差异，为寻找尿石症的病因提供实验依据；通过体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，用全细胞膜片钳技术观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为制定尿石症的防治措施提供依据。

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2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究目标：

探讨肾小管上皮细胞钙通道的表达与尿路结石形成的相关性,为寻找尿石症的病因和制定尿石症的防治措施提供依据。

研究内容：

１、制备Vit D缺乏实验动物模型，观察实验模型尿路结石的形成情况、观察钙通道在肾单位的分布、测定肾小管上皮细胞内钙离子浓度、观察钙通道mRNA的表达水平及记录小管膜内外钙离子电流的变化。

２、比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者肾小管上皮细胞钙通道的表达差异。

3、通过体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为尿石症的防治提供依据。

拟解决的关键问题：

1、成功制备Vit D缺乏实验动物模型。

2、用抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞 3、熟悉运用荧光探针钙图像技术、免疫组化技术、全细胞膜片钳技术。 4、体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养。

3.拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

研究方法：

一、制备Vit D缺乏组及空白对照组实验动物模型，通过HE染色技术观察尿路结石的形成及肾单位的病理改变情况，通过免疫组化技术观察钙通道在肾单位的分布，通过Fluo 3/Am标记的分子探针技术测定肾小管上皮细胞内钙离子浓度，通过RT-PCR

法观察钙通道mRNA的表达水平，通过全细胞膜片钳记录技术记录小管膜内外钙离子电流的变化。并比较两组各观察指标的差异。

二、选取伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者，采用抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞，用RT-PCR法测定TRPV5和TRPV6 mRNA的表达水平，并比较三组的差异。

三、进行体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，通过全细胞膜片钳记录技术，观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变。

技术路线：

一、动物实验：

②随机分为Vit D缺①选用SD大鼠40只 乏组和空白对照组 ③分别予相应应饲料喂养8周 ⑴HE染色观察肾脏病理与结石形成情况 ⑤取左肾作病理切片 ④断颈处死大鼠，取双肾供实验用 ⑵免疫组化观察TPV5/6在肾脏的分布 ⑶分子探针技术测定小管细胞内钙离子浓度 ⑥取右肾，抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管和集合管上皮细胞 ⑷RT-PCR测定小管TPV5/6的表达水平 二、临床试验：

伴高钙尿的尿石症患者 无伴高钙尿的尿石症患者 无尿石症的原发性UPJ梗阻患者 开放手术同时取小块肾组织 抗 ⑸全细胞膜片钳记录小管细胞生物电改变 Tamm-HorsfallRT-PCR法测定TRPV5和TRPV6 mRNA的表达水平，并比较三组的差异 蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞 三、离体实验：

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