RT-PCR实验步骤

RT-PCR

注意：酶现拿现用，用完放回—20度

先配后加，节约枪头

试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此

一、DNase处理：

1、10ul 体系

Total RNA 1ug（或者2ug）A ul

10*buffer （含Mgcl2 ）1ul

DNase（1U/ul）1ul

DEPC free water补足总体积10ul即为8-A ul

总体积：10ul

37℃，30分钟即DnaseⅠ

2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）

65℃，10min，即DnaseⅡ

备注：这一步后，共有11 ul的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。

二、逆转录

（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）

1、加入，并混匀

1)总RNA（含有1-2ugRNA，或者是10ul的第一步中经过DNase处理的总RNA）

10ul

2)Primer oligo（dt）18 （0.5ug/uL）1ul

3)dNTP（10mM）1ul

总体积：12ul 65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ

2、加入，并混匀

5 x first brand buffer 4ul

0.1M DTT 2ul

RNA酶抑制剂（20U/uL）1ul

总体积：19ul 37℃，5min（若用随机引物，则25℃，5min）即程序cDNAⅡ

3、不等其降到4度，立即加入200U的逆转录酶，Revert Aid TM M—Mulv1ul

总体积：20ul

37℃，60min即程序cDNAⅢ

4、70℃，10min，终止反应，冰上冷却。

注意：

1)RT的步骤中的温浴可以用PCR仪来完成

2)RT每步温浴前要稍微离心

3)推荐的做法是DNase处理完后的RNA留用1ul，用来最后PCR的时候做对照，

以排除可能的DNA污染。

三、PCR

取逆转录的产物做PCR，参照普通的PCR。

regular PCR

备一套新PCR反应管，按顺序加入以下物质

注意：

1)先加H2O 10.6 ul，加样品DNA 2ul/个（普通枪头即可）

2)剩下的全部加在一个普通的EP管内（即除了H2O，DNA外其他的组分先混再加）。

3)每个管里面加入20-10.6-2=7.4ul混合物

或者：

2 x Taq mix 10 ul

DEPC 水7ul

引物2ul（上游引物和下游引物各1ul）DNA模版1ul

程序(约1.5h)：95℃2min—（94℃30s；60℃30s；72℃1min，35cycles) —72℃10min，

4℃∞。

注意：

1)PCR中需要修改的主要是退火温度和延伸时间，

2)退火温度一般为60度，计算可用引物Tm（1mM）值—5度，取所有引物中的最低值；

3)延伸时间一般普通PCR为1min，qPCR为30min

电泳

1.配制凝胶：选择合适的浓度0.8-1.5%(1Kbp质粒-300bpPCR产物)

如0.6%凝胶：0.3g agarose + 50ml 0.5 TBE

2.煮胶（中火3min，放置到室温约40度）（中高火2min）

3.灌胶：选择合适的孔道数，在胶中加入EB替代物（母液为1万X ），混匀后加入板中，

不要产生气泡。

4.上样：样品中加入6 X loading dye，混匀后加入孔道中，另外需要加入DNA marker

5.跑胶：根据目的不同，选择时间，电压通常是150（小槽），180大槽，从黑色负极向红

色正极跑。

6.到时间后，加入凝胶成像仪进行照相，观看，分析等操作。（跑胶时，用专用的透明手

套和垃圾桶）

注意：

如果使用Taq mix 跑PCR，则不需要加loading buffer。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/hgch.html