登革2型病毒全长基因组的长链RT_PCR法扩增

中国公共卫生2006年4月第22卷第4期　　ChinJPublicHealthApr2006Vol.22No.

4文章编号:100120580(2006)0420429202　　中图分类号:R373133　　文献标识码:A

429

【论　　著】

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增3

贡树基,赵卫,曹虹,张文炳,周浩,陈丽丹

摘　要:目的　采用长链RT-PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株(NGC)全长基因组。方法　根据登革2

型病毒NGC株基因组全序列设计引物,在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列,下游引物中加入ClaⅠ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果　长链RT-PCR法扩增出约11kb基因片段,经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论　通过长链RT-PCR技术,获得了登革2型病毒NGC株全长基因组性克隆打下基础。

关键词:登革2型病毒;全长cDNA;长链RT-PCR

Amplificationofcompletegenomeofdengue2virusbylongRT-Shuji,,CAOHong,etal.De2partmentofMicrobiology,SchoolofPublicHealth,MedicalUniversity(Guangzhou

510515,China)

Abstract:Objective　ToPCRforamplificationofthecompletegenomeofdengue2virus.accordingtothepublishednucleotidesequenceofDEN2NGCstrain.Sp6wastorestrictionendonucleasesiteforClaⅠwasaddedto3’terminal.AftervirusRNAwasex2tractedfromoftheinfectednew-bornmice,thecompletegenomeofDEN2NGCstrainswasamplifiedbythelongRT-PCR.ofspecificlengthswerere-amplifiedfromPCRproductsforidentification.Results　The11kbfull-lengthgenomeofdengue2viruswasamplifiedsuccessfullybythelongRT-PCR.Conclusion　Thecompletegenomeofdengue2viruswassuccessfultobeamplifiedusingthelongRT-PCR,anditwillbeadvantageousforfurtherconstructinginfectiousclone.

Keywords:dengue2virus;full-lengthcDNA;longRT-PCR

登革病毒(DengueVirus,DEN)属黄病毒科黄病毒属,基因组为单股正链RNA,全长约11kb,包括5’和3’非编码区及一个开放阅读框,共有4个血清型,均可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。通常登革2型病毒(DEN2)的感染较其他血清型更为严重〔1～6〕。本研究利用分子生物学技术扩增DEN2NGC株全长基因组,以进一步构建登革2型病毒感染性克隆。

1　材料与方法

111　病毒RNA制备　DEN2NGC株经乳鼠脑内接种传代

μmol/LdNTPs,最后加焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水至总体积30μl,55℃保温3h进行反转录,反应完毕,70℃灭活15

min。逆转录产物中加入1μl重组RNaseH,37℃温育20min,去除cDNA中混合的RNA。

114　长链PCR反应条件　利用LaTaq酶(日本TaKaRa公

司)进行PCR反应,最终采用30μl反应体系:2μl模板DNA

(250ng/μ015μl)、3μl10×缓冲液(Mg2+25mmol/L)、ldNTP(50mmol/L)、1μlLaTaq酶(5U/μl)、2(+)和2(-)引物各1μl(10μmol/L)、水2115μl。反应条件:94℃2min,94℃15s,60℃1min,72℃8min,扩增30个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物于017%Agarose〔(含015mg/L)溴化乙锭(EB)〕进行电泳。

115　PCR产物的纯化　采用DNA纯化试剂盒(日本TaKaRa公司)纯化DEN2预期长度的PCR产物。-20℃保

后,取1/2发病乳鼠脑,用RNeasyMiniKit(德国QIAGEN公司)提取总RNA,于-70℃保存备用。

112　PCR引物设计(表1)　根据DEN2NGC株基因组全序

列(AF038403),设计扩增全长基因组的上下游引物2(+)、2

(-)。在上游引物2(+)中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心

序列,下游引物2(-)中加入ClaⅠ内切酶位点。由上海博亚生物技术有限公司广州分公司合成。

113　反转录合成cDNA　取15μl总RNA,加入1μl10

存备用。

116　PCR产物的鉴定(表1)　利用DNASTAR软件设计引

物,由上海博亚生物技术有限公司广州分公司合成。分别用于扩增DEN2NGC株基因组中211～213三个基因片段。以纯化的PCR产物为模板,采用LaTaq酶(日本TaKaRa公司)进行扩增。反应条件为:94℃1min,55℃1min,72℃2

min;延伸72℃8min。产物于017%Agarose(含015mg/LEB)进行电泳。2　结　果

211　长链RT-PCR扩增结果(图1)　以提取的总RNA为

μmol/L反向引物,95℃作用3min,随后置冰浴中1min,再加入5μl5×buffer、1μl二硫代苏糖醇(DTT)、1μlRNA抑制剂、2μlSuperScriptⅢ逆转录酶(美国Invitrogen公司)、1μl10

3基金项目:广州市科技攻关计划重点项目(2004Z2-E0214)　作者单位:南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系,广

州510515

　作者简介:贡树基(1978-),男,河北衡水人,硕士在读,主要从事

登革病毒防治研究。

　通讯作者:曹虹

模板,应用长链RT-PCR方法扩增获得约11kbDNA片段,

430中国公共卫生2006年4月第22卷第4期　　ChinJPublicHealthApr2006Vol.22No.4

纯化后保存于-20℃。

212　病毒基因组全长cDNA的鉴定　以纯化的约11kb的PCR产物为模板,利用针对NGC株基因组序列特异的3对

引物进行PCR扩增鉴定。电泳图谱显示,用上述3对引物扩增出的3个片段与预期大小一致。结果证实,扩增出的11kb

cDNA来自DEN2NGC株。

表1　登革2型病毒全长基因组的扩增和鉴定引物

引　物

2(+)2(-)211(+)211(-)212(+)212(-)213(+)213(-)

位置

1～3010724～10695

49～682448～24292160～21814298～42774150～41755840～5815

PCR产物长度

10724

)核苷酸序列(5′→3′

ATTTAGGTGACACTATAGAGTTGTTAGTCTACGTGGACCGACAAAGACATCGATAGAACCTGTTGATTCAACAGCACCATTCCA

2400AAGCTCAACGTAGTTCTAACTTTCCAGCTCACAACGCAAC

2139AGCGAAGA

GAATGGCCATTTTAGCTCTCTCCAGTTCCAAAG

1691GCTATCATGGCAGGGGTGGCGCTCTTCAA　　注:引物2(+)中下划线处为SP6启动子;引物2(-)4〕

,提高产率〔。在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子

核心序列,下游引物中加入ClaⅠ内切酶位点,为以后的体外转录研究和基因重组提供了便利。长链PCR中一般采用较

5〕低的变性温度和较短的变性时间,以减少对模板的损伤〔,每

一循环的变性温度设定为94℃,15s。长链扩增的反应体积也适当缩小,由产品说明书推荐的50μl改为30μl,以达到更好的热传导效率并最终使扩增结果得到优化。反应体系中

Mg2+是Taq酶的活性依赖离子,Mg2+浓度对扩增的影响亦

非常大,如酶活性、引物退火、产物特异性、引物二聚体形成等。常规PCR的Mg2+浓度一般在015～2mmol/L,但长链

PCR体系的Mg2+推荐浓度即为215mmol/L,本实验中此为

优化浓度。

M:DL15000,DL2000;1:登革2型病毒全长基因组PCR产物;

2～4:211～213片段PCR扩增鉴定

参考文献

〔1〕　VaughnDW,GreenS,KalayanaroojS,etal.Dengueviremiatiter,

antibodyresponsepattern,andvirusserotypecorrelatewithdiseaseseverity[J].JInfectDis,2000,181(1):2-9.

图1　登革2型病毒全长基因组扩增结果及PCR鉴定

3　讨　论

以往长链RNA病毒基因组感染性全长cDNA克隆的建立,涉及到许多亚基因组cDNA分子的克隆和连接,较为困难

2,3〕

和繁琐〔。本实验采用SuperScriptⅢ逆转录酶体系,变性

〔2〕　DarA,MunirS,VishwanathanS,etal.Transcriptionalanalysisof

avianembryonictissuesfollowinginfectionwithavianinfectious

bronchitisvirus[J].VirusRes,2005,110(1-2):41-55.

温度改为95℃,逆转录温度改为55℃,以打开RNA链的二级结构,合成长片段的第1链cDNA。逆转录产物用RNaseH处理,去除模板RNA,纯化第1链cDNA,利于随后的PCR反应。本实验中,用LaTaq酶扩增出了11kb左右的目的基因,并且在优化反应条件下,基本没有产生影响实验结果的非特异性杂带。

长链RT-PCR中使用30个左右的核苷酸特异性长引物是关键环节,在反应过程中能减少引物与模板的非特异结合,避免非特异性短片段的产生,同时长引物与模板的结合更稳定,便于以热启动方式打开RNA的二级结构,减少引物错

〔3〕　KhatriM,PalmquistJM,ChaRM,etal.Infectionandactivationof

bursalmacrophagesbyvirulentinfectiousbursaldiseasevirus[J].VirusRes,2005,10:Epubaheadofprint.

〔4〕　ReddyMK,NairS,SoporySK.GlobalamplificationofcDNAfrom

limitingamountsoftissue.Animprovedmethodforgenecloning

andanalysis[J].

MolBiotechnol,2002,22(3):223-230.

〔5〕　TellierR,BukhJ,EmersonSU,etal.LongPCRamplificationof

largefragmentsofviralgenomes:atechnicaloverview[J].MethodsMolBiol,2003,226:167-172.

〔6〕　贡树基,赵卫,曹虹.登革病毒感染实验室诊断的研究进展[J].

中国人兽共患病杂志,2005,21(12):1103-1105.收稿日期:2005210229

(蔡天德编辑　郭长胜校对)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/hc94.html