基因工程中常用的酶及其功能分析

基因工程中常用的酶及其功能分析

[摘 要] 酶是活细胞所产生的一种具有特殊催化功能的蛋白质,在生物工程中应用非常广泛,如食品、医药、废水处理等方面.基因工程中常用的酶主要包括核酸酶、连接酶、聚合酶和修饰酶,分别发挥着不同的功能.

[关键词] 基因工程;基因克隆;DNA.

外源基因通过体外重组后需要导入受体细胞内,在受体细胞内复制、转录、翻译并表达的操作过程称为基因工程(Gene Engineering)[1].其中基因克隆是不可缺少的步骤.在基因克隆过程中,当目的DNA样品制备好之后,需要对DNA分子进行进一步的处理,包括对目的基因片段的取得、连接、转化等操作.而这些操作过程必须借助酶(enzyme)的重要作用才可完成.由于研究方向及目的不同,现在对酶的分类方法也各不相同.结合实验,从基因工程的角度可将酶分为如下几类:①核酸酶,②连接酶,③聚合酶,④修饰酶. 1 核酸酶

核酸酶(nuclease)是一类以核酸为底物的水解酶,它可以打断核酸链中的磷酸二酯键,因而在基因工程中应用非常广泛.按底物专一性可以将核酸酶分为核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase),非专一性核酸酶等.其中RNase降解RNA分子,DNase降解DNA分子.但它们都可以分为两类:核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease).

(1)核酸外切酶:从DNA两端向中间切割,可分为2种情况:一种是切下一条链的末端,另一种情况是从两端同时向中间切.

(2)核酸内切酶:从DNA链的内部进行切割,分为限制性内切酶和非限制性内切酶.2种酶由于识别的目的片段不同,因此功能有差异.现在这2种酶在基因工程中的作用都很大,例如非限制性内切酶中的DNaseI,它对单双链都很敏感,可以在DNA中任何部位切断磷酸二酯键,无特异识别位点.限制性内切酶(restriction endonucleae)是一种能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶,多在原核生物中存在,在基因工程中的主要用途是通过切割DNA分子,对含有特定基因的序列进行分离进而分析.它分为3类:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类.对于Ⅰ和Ⅲ类酶,在同一蛋白中兼有甲基化酶的功能并依赖于ATP限制性内切酶的活性.其中Ⅲ类酶在其识别位点上切割DNA,然后从底物上解离下来;Ⅰ类酶结合于特定识别位点,但酶切位点不是十分固定,对其识别位点进行随意切割,因此在基因工程中应用范围非常有限[2].在基因工程中应用广泛的是第Ⅱ类,Ⅱ类限制-修饰酶系统是由2种酶分子组成的二元酶系统:一种为限制性内切酶,一种为独立的甲基化酶,它修饰与限制性内切酶识别位点相重叠的序列.具有如下特点:

(1)识别特异核苷酸序列,起长度为4或5个,但有少数酶识别更长的序列或兼并序列.

(2)具有特定酶切位点,在其特定的识别位点对DNA进行限制性内切.在进行酶切时,可产生特殊的平端和粘性末端,可以通过碱基配对连在一起,在基因工程中有重要的意义.但限制性内切酶在应用时受很多条件的限制,如DNA纯度、DNA甲基化程度、反应温度的影响[3]. 2 连接酶

连接酶(ligase)一般用于将两段或数段DNA片段拼接起来,基因工程中最常用的连接酶是T4 DNA连接酶、E.Coli DNA连接酶和T4 RNA连接酶.其中又以T4 DNA连接酶最重要,DNA5’端磷酸基与3’端羟基之间形成磷酸二酯键[4].其主要用途为:

(1)连接带匹配粘性末端的DNA分子.DNA重组实验中,往往优先选择粘性连接.如果得到的DNA片段不是粘性末端,可采用如衔接体技术、接合体技术等方法使之成为粘性末端,然后再进行连接,以提高反应效率.

(2)使平端的双链DNA分子相互连接或与已合成的寡聚核苷酸接头相连,但这个反应连接效率要低一些.同样对连接酶来说影响因素也很多,实际最佳连接温度要比理论连接温度低得多.在实验中可根据实际情况(如G+C的含量)适当改变连接温度. 3 聚合酶

聚合酶(polymerase)以DNA或RNA为模板催化合成互补新链,需要相应的一个引物来引起聚

合反应.目前基因工程中主要应用的酶有4种.

(1)大肠杆菌聚合酶Ⅰ:具有5’→3’聚合酶活性,同时具有3’→5’及5’→3’外切核酸酶的活性.

(2) Klenow片段:是改良的DNA聚合酶Ⅰ,具有5’→3’聚合酶活性,同时具有3’→5’外切酶活性.

(3) T4噬菌体DNA聚合酶(DNA polymerase):不从单链DNA模板上置换寡聚核苷酸引物,因此在体外诱变反应中,T4噬菌体DNA聚合酶具有更大的效率.

(4)反转录酶(reverse transcription):依赖于RNA的DNA聚合酶,既可以用DNA为模板,也可以用RNA为模板进行互补链的合成.基因工程中主要功能是利用真核mRNA为模板反转录cDNA,用来建立cDNA文库,进而分离为特定蛋白质编码的基因.近年来,利用mRNA反转录和PCR技术结合产生了一个新的技术:RT-PCR(反转录PCR)技术,使真核基因分离更加高效.根据以上几种DNA聚合酶的不同特性,基因工程中建立了2种不同的体外快速扩增目的序列片段的技术:

(1) PCR技术:应用TaqDNA聚合酶合成新的DNA序列.但由于Taq酶不具校对功能,所合成的产物含有错配的碱基.

(2) NASBA技术:利用T7RNA聚合酶,效率比PCR技术要高得多[5]. 4 修饰酶

DNA修饰酶(DNAmodification enzyme)是指对DNA分子进行修饰的酶,目前基因工程中常用的酶有:

(1)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase):与多核苷酸激酶功能相反,去除DNA5’端磷酸基因,防止在重组中自身环化,从而提高重组效率;在γ-32PATP标记的DNA或RNA的5’端前,去除RNA或DNA的非标记片段.

(2)末端转移酶(terminal tranferase):可以把多个核苷酸加到DNA分子3’端末尾,在同聚体技术中

(3)甲基化酶(methylase):可以使某些核苷酸甲基化,保护某些片段不被酶切.现在已经在基因工程中得到应用,如通过DNA甲基化作用对限制性酶切位点进行修饰.许多Ⅱ类限制性内切酶已分离到与其对应的甲基化酶.这些甲基化酶可以通过甲基化作用修饰限制酶识别序列,使之不被酶切.在构建基因组DNA文库及cDNA文库时,已用上述策略.除此以外,还有其它的一些修饰酶.目前随着对酶研究的逐步深入,酶在基因工程中的应用也越来越广泛,并且起着非常重要的作用.可以说它的发展决定着基因工程的进步与否,是人们认识生物微观世界的有力“武器”之一,必将在未来生物工程中得到更大的发展.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/hc1t.html