荧光光谱分析讲义03 - 图文

理解分子荧光分析的基本原理

理解激发光谱发射光谱 同步光谱 三维荧光光谱的含义 掌握分子荧光发射光谱的特性

了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用

掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素 了解光谱分析法的应用范围

第一章 分子荧光光谱分析

1概述

分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。

当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10-9-10-6 S）停止;

当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10-1-10 S）;

磷光和荧光的发光机理是不同的。

由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。

2荧光分析的原理 2.1分子荧光发生过程 2.1.1荧光与磷光

2.1.1.1 分子的电子能级与激发过程

分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。.

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图1 分子电子能级，振动能级和转动能级示意图

室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能， 光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。

每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用S0 S1 Sn表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第N电子激发的单线态。T1表示第一电子激发的三线态。

电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。

电子能态的的多重性用M= 2S+1表示 , S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量

最低的各个轨道中。根据Pauli不相容原理,一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为1/2和-1/2，其总自旋量子数S=0，就是说基态没有净自旋。分子的多重度M=1，该分子体系便处于单线态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单线态的。

基态分子在吸收光能后其价电子从成键轨道或非成键轨道跃迁到高能量的反键轨道上，产生激发态分子，此为分子光吸收过程。但是激发态分子不稳定，通常很快失去能量回到基态。如果激发态分子在返回基态时以光辐射的形式失去能量，这种光辐射过程叫做光致发光。分子吸收能量后，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，这时分子处于激发的单线态。分子吸收能量后如果电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子。即S=1，分子的多重度M= 2*1+1=3，这时分子处于激发的三线态，用符号T表示。处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋比成对自旋更稳定些（洪特规则）。因此三线态的能级总是比相应的单线态能级略低。

单线基态 激发单线态 激发三线态

图 2 单线态和三线态

2.1.1.2 荧光的产生

根据波滋曼分布(Boltzmann distribution ) 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动-转动能级，根据自旋禁率, 不能直接跃迁到激发三线态的振动-转动能级。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等多种

分子内去活化过程释放多余的能量而返回基态，发射荧光是其中途径之一。下面几种方式为基本去活化过程；

振动弛豫：(VR vibrational relaxation ) 在溶液中的物质分子受入射光激发后形成的激发态分子，通过与溶剂分子碰撞，将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回同一电子激发态的最低振动能级。在这个过程中，分子被激发时吸收的能量不是以发出光辐射的形式耗散，因而属于无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级进行，所需时间约为10-8秒数量级。

内转换：(IC Internal conversion): 指相同多重态电子能级中等能级间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子激发态之间能量相差较小，以至其振动能级有重叠时，则可能发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低电子能级的激发态。上述的振动能级之间很接近时，内部能量转换容易发生。

外转换（Ecexternal conversion）： 溶液中激发态分子与溶剂分子及其他溶质分子之间发生碰撞而消耗能量，所消耗的能量转换为热能。外转换常发生在第一激发单线态或第一激发三线态的最低振动能级向基态转换的过程中。转换时间为10-9---10-7秒，其发生可以降低荧光强度，这一现象叫荧光熄灭或猝灭。 系间跨越 (Intersystem crossing, ISC)： 系间跨越指不同多重度状态之间的一种无辐射跃迁过程。它涉及到受激电子自旋状态的改变S1?T1，使原来两个自旋配对的两个电子不再配对，这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子的能级的振动能级有较大的重叠时，例如激发单线态S1的最低振动能级与激发三线态T1的较高振动能级重叠, 则可能通过自旋-轨道耦合等作用使S1态转入T1态的某一振动能级.。系间跨越可以使荧光强度减弱或熄灭。

荧光发射： （Fluorescence emission）.当分子被激发到任意一个激发单线态，并通过内转换及振动弛豫返回到第一激发单线态的最低振动能级后， 再以辐射形式发射光量子并返回到基态的各个不同的振动能级上，在这个过程中发射的光量子即称作荧光。由于从较高的激发态的振动能级返回到第一激发单线态的最低 振动能级耗散了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，所以发射荧光的波长比

激发光的波长要长。发射荧光的过程约需10-9—10-7秒，电子返回到基态时可以停留在基态的任意振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个互相靠近的峰。通过进一步振动弛豫，这些电子很快回到基态的最低振动能级。根据kasha 规则，荧光多为S1?S0跃迁。 荧光产生的过程和条件：

荧光物质产生荧光的过程可以分为4个步骤

1 处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；

2被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，返回到第一电子激发态的最低振动能级；

3返回到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；

4 到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后返回的基态的最低振动能级。

磷光发射 激发态分子通过振动弛豫下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过体系间跨越转移到激发三线态的高振动能级上。从单线态到三线态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而达到三线态的最低振动能级上。分子在三线态的最低振动能级可以停留一段时间，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射叫磷光。

磷光与荧光的根本区别是荧光是由激发单线态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的。由于激发三线态的最低振动能级比激发单线态的最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，亦即磷光的波长比荧光更长。从紫外光照射到发射荧光的时间约为10 –8秒～10 –5秒，而发射磷光则更迟一些，约在照射后10 –4秒～10秒。

某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用发生了电子转移反应，引起荧光猝灭。如甲基蓝溶液的荧光被Fe2+ 离子猝灭就是这种情况。其他的I- 、Br—、 CNS-—

、S2O32- 等易给出电子的阴离子，对奎宁，罗丹明及荧光素钠的物质的荧光也

会发生猝灭作用。 荧光物质的自猝灭：

在浓度较高的荧光物质溶液中往往会发生自猝灭现象。其原因是单线激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光分子碰撞引起自熄灭，如蒽和苯。有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体，使其吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。解决方法： 稀释样品； 标准加入法。 Stop 2.3.5散射光的干扰

当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。

瑞利散射：当光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量交换，仅仅是光子的运动方向发生改变，这种散射叫瑞利散射光。其波长与入射光波长相同。 拉曼散射：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换。光子把部分能量转给物质分子后，在一定条件下，分子所获得的能量使得围绕其中某一健分布的电子云产生瞬时弹性变形，这时辐射能量暂时保留在变形的极化分子的一个虚态上。这个虚态并不存在常规电子能级图中，电子在那里只能保持10-15-10-14秒时间，随后回到其电子能态基态的不同振动能级上，发射出比入射波长长或稍短的光，称为拉曼光。

散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，因为一般同时产生的多条拉曼辐射线，可以复合成一个覆盖一定波长范围的较宽的带，如果这种辐射带正好和荧光辐射的波长相近，就会对荧光测定产生干扰。因此在荧光测定中必须采取措施避免这种干扰。

选择适当的激发波长可以消除拉曼光的干扰。以硫酸奎宁为例。从图4可见，无论选320nm或者350nm 为激发光,荧光峰总是在448 nm。分别在320nm和350nm激发光下测定空白溶剂的发射光谱， （这种情况下并没有发生荧光发

射，得到的是拉曼散射光）。从图b 可见， 当激发波长为320 nm 时瑞利光波长是320 nm ，拉曼光波长是360 nm ，拉曼光对荧光无影响；。当激发波长为350 nm 时瑞利光波长是350 nm ，拉曼光波长是 400 nm ，拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。

图4 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱

水， 乙醇，环己烷，四氯化碳，氯仿这5种溶剂是最常用的溶剂，他们自身都能发射拉曼散射光，从而可能干扰荧光测定。表2 列出了不同波长激发光照射下的拉曼辐射波长，可供选择激发波长或溶剂时参考。

表2 不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长

溶剂 激发波长

248 313 365 405 436 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 水 271 350 416 469 511 乙醇 267 344 409 459 500 环己烷 267 344 408 458 499 四氯化碳 -- 320 375 418 450 氯仿 -- 346 410 461 502

2.3.6 内滤光作用和自吸收现象

溶液中如果存在着能吸收激发或荧光物质所发射的光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用“。例如在1ng/ml的色氨酸溶液中如果有重铬酸钾存在，由于在色氨酸的激发和发射峰附近正好是重铬酸钾的两个吸收峰，吸收了色氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光，使测得的色氨酸荧光大大降低。

内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱短波长一端与与该物质的吸收光谱的长波长的一端有重叠。

在溶液浓度较大时一部分荧光发射被自身吸收，产生所谓自吸收现象，降低了溶液的荧光强度。

3定量分析方法

3.1强度与浓度的关系

由于荧光物质是在吸收光能被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。溶液中荧光物质被入射光（I0）激发后可以在溶液的各个方向观察荧光强度（F）。.但由于激发光有部分透过（I），这部分透过的入射光会干扰对荧光的测定，因此应该在与激发光源垂直的方向进行测定。设溶液中荧光物质的浓度为C，液层厚度为L，荧光强度F正比于被荧光物质吸收的光强度，即： F ? (I0— It) ，F ? Ia

F= K’ Ia, 公式中K’为常数, 其数值取决于荧光效率。

根据Lambert –Beer定律

Ia= I0 —It=I0 (1—10-ECL) = I0 (1—e -2.3ECL)

e -2.3ECL =1+ (-2.3ECL)1/1! +(-2.3ECL)2/2!+(-2.3ECL)3/3! +(-2.3ECL)4/4!+…….. 若浓度很小，ECL值也很小，ECL<0.05时 ，式中第二项以后的各项可以省略，

于是

e -2.3ECL =1— 2.3ECL F = K’ Ia = K’ I0 (1—e -2.3ECL)

= 2.3 K’ I0 ECL

当入射光光强度和液层厚度一定，上式简写为

F= KC

在低浓度时溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。荧光分析方法定量的依据是荧光强度与荧光物质的浓度的线性关系，而荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度，即只要改进光电倍增管和放大系统使极弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液的浓度，因此荧光分析法的灵敏度很高。

3.2定量分析方法

标准曲线法：浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制工作曲线，在同样实验条件下测定样品溶液。

在绘制工作曲线时常采用系列中某一个标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调到0% 将该标准溶液的荧光强度调到100%或50%。在实际工作中当仪器调零之后先测定空白溶液的荧光强度，然后再测定标准溶液的荧光强度, 从后者减去前者即可, 然后绘制标准曲线。

为了使在不同时间所绘制的标准曲线能够一致，在每次绘制曲线时均采用同一个标准溶液对仪器进行校正。如果试样在紫外光下不稳定，可以改用另一种稳定的标准溶液作为基准，只要其荧光峰和试样溶液的荧光峰相近似，例如测定维生素B1时，可采用硫酸奎宁作为基准。

在使用工曲线法定量时须注意

荧光分析所用的试剂标准品一定要纯，样品池要清洁。

被分析的样品不能用激发光长时间照射，以免荧光物质发生分解。 标准溶液样品溶液应该在同一条件进行测定荧光强度。

荧光猝灭法； 在一般荧光分析方法中一些荧光猝灭剂应该事先分离。但也可以利用猝灭现象用于荧光分析。若某一物质本身不会发射荧光，也不与其他物质形成荧光物质，但他们会使另一种发射荧光的物质荧光强度下降，下降程度与该物质的浓度成比例，以次建立的荧光分析方法叫荧光猝灭法。例如氟离子会使铝-八羟基喹啉洛和物的荧光强度下降，在适当条件下荧光强度与氟离子的浓度成反比例，可用于痕量氟的测定。 动力学荧光分析法

化学反应时其中反应物或产物中有荧光物质，随着反应的进行，因为浓度变化引起荧光强度随时间的变化，可以求出物质的含量，以此建立动力学荧光分析法。

例如Fe(III) pH=3.4时，1，4二氨基-2，3二氢蒽醌（A）与其发生氧化还原反应，产生深绿色荧光产物（B）, (?ex =400nm, ?em= 470nm), 反应式

Fe(III) + H+ +A Fe(II) + B

当pH值一定时

d[B]/dt = ?[A] [Fe(III)]

式中t 为时间； ?为比例常数。在反应初期可以认为[A]不变，并对上式进行积分，则

[B]= ?? ‘[Fe(III)]t

又由于IFB = k[B]， 公式中IFB为荧光物质的发射强度，则有

IFB = ?? [Fe(III)] t

或 IFB /t= ?? [Fe(III)]

通过测量不同[Fe(III)]下的标准系列浓度，由[Fe(III)]对IFB /t作图，得到工作曲线。

如果有些化学反应的产物虽能够产生荧光但反应进行缓慢，而在加入某些微量金属离子的催化作用下，反应速率加快，荧光强度随之增强，那麽反应速率与该痕量金属离子浓度存在着定量关系，以此可以测量作为催化剂的痕量金属，此法成为催化荧光测定方法。

直接比较法

也叫比例法。如果荧光分析方法的标准曲线通过原点，就可以选择其线性范围，用比例法进行测定。取一个标准溶液使其浓度在线性范围内,测定其荧光强度Fs。之后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx， 然后计算物质的含量。空白溶液的荧光强度调不到0%，必须从标准和试样的值扣除空白溶液的荧光强度F0，然后计算。

Fs —F0 =K Cs Fx — F0 =K Cx

对于同一荧光物质，常数K相同

（Fs —F0 ）/（Fx — F0）= Cs /Cx Cx =（Fx — F0）/（Fs —F0 ）* Cx

多分混合物分析.:

如果不同组分的荧光光谱相互重叠可以考虑利用荧光强度的加合性质在适宜的波长处测定混合物的荧光强度，再根据被测各个组分的各自在适当的荧光波长处的荧光强度 列联立方程求出各自含量。 导数荧光光谱分析法

也叫微分荧光光谱分析法，用物质荧光强度对对其荧光波长的导数值与其对应波长作图可得导数荧光光谱。

dI/d?— ? 曲线 一阶导数荧光光谱

随着导数阶数的增加，荧光峰的尖锐程度增大，带宽减少，分辨率提高。将靠的很近的，重叠的荧光峰分别开来，还可以清楚地辨认陡坡上的弱小峰肩蜂，宽峰可以准确给出峰位。提供更多的结构信息，用于定性。用荧光导数值与样品浓度值呈线性关系可以用导数荧光光谱分析法定量。

4荧光分析方法的特点

灵敏度高 与紫外可见分光光度法法比较,荧光是从与入射光成直角方向检测，即在黑背景下（有很小的噪声背景）检测荧光发射信号。所以可以用增强入射光强度或增大荧光放大倍数来提高灵敏度；在吸收光度法中不但要测定透过试

样的光强度I，还要测量入射光强度I0. 当试样浓度很低，吸收微弱，I 和I0非常接近，检测器很难区分两个较大信号之间的微小差别。此外在分光光度法中如果增加入射光强度I0，I也按比例变化，若提高检测器信号的放大倍数，其放大作用I0和I是同样的。因此荧光分析的灵敏度要比分光光度法光高2-4个数量级。测定下限在0.1-0.001ng/ml之间。紫外可见分光光度法的灵敏度为10-7g/ml 而荧光光度法测定的灵敏度在 10-10 –10-12g/ml之间。

选择性好 既可根据特征发射又可以根据特征吸收来鉴定物质。如果某几个物质的发射光谱相似，可以从其激发光谱的差异将其区分开来。而如果他们的吸收光谱相同，则使用发射光谱将其区分。

所需样品量少，方法简便

提供较多的物理参数 可以提供激发光谱，发射光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命，荧光偏振等参数，可以从不同角度反映荧光物质分子的各种特性，并通过这些物理参数得到被研究的物质的更多的信息。

缺点 应用范围不够广泛，本身能够发射荧光的物质较少，加入某种试剂经衍生化后才能测定的物质也不是很多。

由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素敏感，干扰因素较多。如温度 溶剂，酸度，散射光等。

5 荧光分析仪

5．1 仪器组成

用于荧光测定的仪器由以下四个部件组成： 激发光源；样品池，单色器，检测器（图 5）。由光源发出的光经过第一单色器得到所需要的激发光波长，激发光通过样品池，荧光物质被激发后发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响通常在与激发光垂直的方向上测定荧光。为了消除可能存在的其他光的干扰，如激发光产生的反射光，瑞利散射光和拉曼散射以及溶液中杂质产生的荧光，以便获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二个单色器，荧光作用于检测器上，记录相应的电信号。经过放大被记录下来。

图5 荧光光度计基本组成框图

图6 F-4500荧光光度计光路图

激发光源 在紫外可见光范围， 常用的光源是高压氙灯和高压汞灯。氙灯内装有氙气，氙灯发射的光谱强度大，而且是连续光谱分布在200-700nm 范围内，并且在300-400 波长之间的强度几乎相等。目前大多数荧光计使用它作光源。

高压氙灯是一种气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温下压力0.5Mpa (5 atm) ，工作时压力为2Mpa (20 atm)。氙灯内充气总是处于高压状态先灯寿命约为2000小时，在安装或更换时要戴上防护镜或者严格按照操作规程进行以便防

止以外发生。由于氙灯的启动电压在 20-40 KV，，不仅人体要注意安全，在仪器配有计算机是，应先点着氙灯带稳定后再开计算机。

样品池 液体样品池通常用石英材料制成，形状以方型或者长方形为好，因为这种形状散射光干扰较少。固体样品用可用样品架。

单色器 包括色散元件和狭缝。较高级的单色器采用光栅。其优点是在所有波长都能够色散而且色散均匀，有相同的分辨率。入射光的80%能量在一级光谱中。第一单色器用于选择所需要的激发波长第二单色器用于分离出荧光发射波长。

狭缝关系到单色器分辨率的优劣， 用于控制谱带宽度和光强度。一般说来，狭缝越窄单色性越好。但光强随之减小而降低灵敏度。在实际使用时应该两者兼顾。

检测器要求有较高的灵敏度，一般应用光电倍增管作检测器。

5．2仪器的校正

灵敏度校正

荧光光度计的灵敏度可以用被检测出的最低信号来表示，通常以硫酸奎宁的检出限或者以纯水的的拉曼峰的信噪比（S/N）表示。

荧光光度计的灵敏度与光源强度，单色器（包括透镜，反射镜）的性能，放大系统的特征，和光电倍增管的灵敏度有关；

与所选用的波长，狭缝宽度有关。

与被测空白溶剂的拉曼散射，激发光，杂质荧光有关。

由于影响因素多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器在不同时间操作，所测得的结果也不尽相同。因而在每次测定时，在选定波长和狭缝宽度的条件下，先用一种荧光性质稳定，浓度固定的标准液进行校正，将每次所测得的荧光强度调整到相同数值（50%或100%）。如果被测定的物质所产生的荧光很稳定，自身就可以作为标准溶液。紫外可见范围内最常用的是1?g/ml（0.05mol/l 硫酸中）硫酸奎宁标准溶液。因为其产生的荧光十分稳定。

波长校正

荧光分光光度计的波长出厂前都经过了校正，若仪器的光学系统和检测器有所变动，或较长时间使用后，或在重要部件更换后，有必要用汞灯的标准谱线对单色器刻度重新校正，这一点在要求较高的测定工作中尤为重要。

激发光谱和荧光光谱的校正

荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱往往随着仪器不同而不同。 原因：

单色器波长的准确度，拉曼散射光的影响，以及狭缝宽度等。

其最主要的原因有光源的强度随波长变化 ，检测器对不同波长光的接受敏感程度不同，检测器的响应与光强不成线性。

由于以上原因，在用单光束仪器测定激发和发射光谱时，因为不能用参比溶液进行相对校正，误差较大。尤其是当波长处于检测器灵敏度曲线的陡坡时得到的“表观光谱”中的值之间的相对关系不能反映真实情况，产生了显著误差。因此可先用仪器上附有的校正装置将每一个波长的光源强度调整到一致，然后根据表观光谱每一个波长的强度除以检测器对每一个波长的感应强度进行校正以消除误差。

目前生产的光度计大都是双光束光路，可以用参比光束抵消误差。

5.3 荧光分析仪器的维护

要正确提供主机及附件所需的供电电压和频率，不可接错电源。

拿灯时不要碰窗口，如果不小心碰触，及时用无水乙醇擦净，灯源不稳定或强度太弱而影响测定时，应换灯；

不要用肉眼直视灯源，以免损伤眼睛。

单色器不得轻易拆卸，保持内部干燥，以防色散元件和反射镜受潮。 放样品池时要固定一个方向，免得液池各透光面被池架的弹簧片擦坏，增加散射。液池要洗净，不得留有痕迹影响测定。

新的液池常常挂水，可用3mol/l 盐酸和50%乙醇等量混合液浸泡。 保持光电倍增管室干燥，保证绝缘良好，光电倍增管通电后避免不必要的爆光 要养成随时关闭光闸的习惯，以免损坏光电倍增管，或因为“疲劳”降低灵敏度。

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