RuBP羧化酶活性测定

RuBP羧化活性

一、实验目的

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶(RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco）。Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。在叶绿素间质中浓度300mg/ml。同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。 二、实验原理

Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：

，Mg?2 RuBP+CO2+H2O?RuBPC?????2(3-PGA)

－磷酸甘油激酶??????1,3-二磷酸甘油酸+ADP 3-PGA+ATP?33－磷酸脱氢酶???????3-磷酸甘油醛+NAD++PO4 1,3-二磷酸甘油酸+NADH?甘油醛－－3

通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。 三、实验材料、试剂及仪器

实验材料：新鲜的小麦叶片、新鲜的玉米叶片

实验仪器：匀浆器、研钵，移液管、研钵、冷冻离心机(eppendorf Centrifuge 5417R)、分光光度计(SHIMADZU UVmini-1240)、秒表、石英、微量比色杯等。 反应介质：

1. RuBP羧化酶提取液 2. 反应液

3. 磷酸肌酸激酶溶液 4. 磷酸肌酸溶液

5. 3-磷酸甘油酸激酶溶液 6. 3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液 7. NADH溶液

8. RuBP溶液 9. ATP溶液 四、实验步骤

1.酶粗提液制备。

（1）称取新鲜小麦叶片0.1g； （2）置于研钵中加入1ml提取液； （3）研磨成匀浆后，转移至1mL离心管；

（4）在12000Pa、4℃下离心10min，取上清液，即为酶液； （5）取上清液即为粗酶提取液。置冰上保存备用。

2.叶绿素测定。

（1）称取0.1g叶片剪碎，置于研钵中； （2）加入80％丙酮，研磨成匀浆；

（3）过滤后，置于10mL容量瓶并定容至10mL；

（4）在645nm和663nm处测定吸光值，加入无水丙酮调零； （5）计算叶绿素a、b总含量Ch1(a+b)。

3.活力测定。

各试剂加入量及顺序，按照下表配制反应体系:

试剂 反应液 磷酸肌酸 磷酸肌酸激酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶 3-磷酸甘油酸激酶 ATP RuBp(340nm调零) 酶提取液 NADH 加入体积（ul） 630 50 50 50 50 50 50 20 50 将配好的反应体系摇匀，倒入比色杯中，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上测定340nm处的吸光度，作为零点值。将0.1mlRuBP加入比色杯中，

并立刻计时，每隔5S测定1次吸光度，共测1min。以零点到1min内吸光度下降值计算酶活力。 五、结果计算

1.Rubisco酶活力计算公式

RuBp活力=μmol/(min·mg·chl)

=△A·V（反应）/(2dε·V(样品)·△t·Chl(a+b)·Fw) △A:1min内吸光值变化 d:光径（cm）=0.4 V(反应):反应液体液1mL

ε:μmolNADH在340nm处的摩尔消光系数6.22 △t：时间间隔（min）=1

Fw:叶片鲜重=0.0985g(玉米)、0.0969（小麦） Chl(a+b):叶绿素总含量mg/g V(样品)：酶液总体积（0.02mL）

2为每固定1molCO2有2molNADH被氧化。 2.叶绿素含量计算

Chl(a+b)浓度（mg/L）=（12.72A663-2.59A645）+（22.88A645-4.67A663）

=20.29A645+8.05A663

由实验数据带入公式得出（单位nm)：

小麦叶片叶绿素提取液在645nm和663nm处的吸光值分别是:0.501和1.040 玉米叶片叶绿素提取液在645nm和663nm处的吸光值分别是:0.568和1.173 小麦叶片叶绿素浓度=(20.29*0.501+8.05*1.040)=18.54mg/L 玉米叶片叶绿素浓度=(20.29*0.568+8.05*1.173)=20.97mg/L 叶绿素含量（mg/g）=(Chl(a+b)浓度·V体·稀释倍数)/Fw 其中稀释倍数为1；V体=0.01L；FW小麦=0.1010；FW玉米=0.1001 代入叶绿素含量公式，计算得出

小麦叶绿素含量为1.836mg/g，玉米叶绿素含量为2.095mg/g。

3.实验结果

表为玉米和小麦在1min中吸光度数值的变化过程

样品 小麦 玉米 0s 5s 10s 15s 20s 25s 30s 35s 40s 0.275 0.274 0.272 0.271 0.270 0.268 0.267 0.266 0.265 0.375 0.372 0.369 0.367 0.365 0.363 0.362 0.362 0.362 注意：对小麦吸光度变化的观察中，发现在40s之后数值就不再发生变化。

而玉米吸光度变化的时间更短，在30s之后就不再发生变化。故 小麦△A为0.010，玉米△A为0.013，△t=1min，代入公式 RuBp活力=△A·V（样品）/(2dε·V(反应)·△t·chl(a+b)·Fw)

计算结果得出：

小麦RuBpCase活力=0.226（μmol/min/mg chl（a+b））

玉米RuBpCase活力=0.253（μmol/min/mg chl（a+b））

六、注意事项及讨论

1.RuBP很不稳定，使用过程中注意在PH5.0-6.5范围内，以10mmol/L的浓度保存于-20℃冰箱中。

2.反应液和比色杯保持温度在30℃左右，可把分光光度计样品室内放入装有温水的瓶子保温。

3.叶绿素生理活性不稳定，提取时注意遮光。 4.注意比色杯透光的一面保持清洁，否则影响结果。

5.小麦和玉米在开始的吸光度数值测定变化差异不同，计算RuBP时根据要求代入△A和△t。

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