土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选

一 实验目的

1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。 2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。 3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。 二 实验原理

在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

三 实验器材与材料 3.1 实验仪器：

培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。 3.2 实验材料：

1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。

2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml 3.3 ：其它

棉花、棉绳、纱布等 3.4土壤采集：

采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点 土样采集时间：2012年5月12日

土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围 四 实验步骤 4.1 实验流程：

配制培养基 → 土样采集 → 制备菌悬液 → 菌株的初选（涂布平板）→ 鉴定 → 平板划线纯化 → 选育 → 筛选高产淀粉酶菌株

4.2初选：

4.2.1 淀粉培养基的配制

分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。

4.2.2灭菌

将准备好的8支试管（装有9ml自来水）、移液管、涂布棒、培养皿等包扎好，与配制好的淀粉培养基一起放入灭菌锅中在120℃高压下灭菌20min。

4. 2.3倒平板

将灭完菌的培养基放置于无菌工作台（紫外灯照射30min）上，待冷却到55℃左右后（不烫手即可），在酒精等下，倒入灭菌后的平板中，每个平板中约15-20ml，之后待冷却凝固。

4. 2.4 菌悬液的配制：

将采集好的土样称取10.0g，装入盛有90.0ml无菌水，含有3至5粒玻璃珠的三角瓶中，放在150转的摇床上20min后静置至上清液澄清，上清液进行下一步稀释。

4. 2.5 菌悬液浓度的稀释：

取1ml上清液加入装有9ml无菌水的试管中，摇匀，然后依次取1ml加入下一个试管中，依次稀释到10-8，待用。

4. 2.6 涂布平板：

用移液管分别在10、10、10、10浓度梯度下各取0.2ml土壤稀释液倒入已冷却的平板中，用涂布器涂布均匀，在平板上标注土样的浓度。把标注好的培养皿倒置放入37 ℃ 的恒温培养箱中培养 24 h 。

4.3分离、纯化

在无菌工作台上，向培养了24小时的培养皿中加入碘液，观察菌落的形态，由于产淀粉酶菌株菌落周围有明显的透明圈，所以可得到产淀粉酶菌株。用灭过菌的接种针挑菌株周围出现透明圈的菌落于新的培养基上划线，标注。重复以上步骤3次，以得到较纯的菌株。

4.4 菌落的形态观察及革兰氏染色

将纯化的菌株进行制片，在显微镜下观察菌落的形态并进行细菌的革兰氏染色，判断菌体是革兰氏阳性菌还是阴性菌。

4.5菌体及菌落直径测量

将纯化好的菌株用接种针进行点种，然后培养24h。再在无菌操作台上向点种的平板上加入碘液，观察，然后用毫米刻度尺测量菌体的直径以及菌落透明圈的直径，并进行计算记录。

4.6保存菌种

在无菌工作台下，将纯化后的菌株用灭过菌的接种环挑去后在试管斜面上划线，包扎。培养24小时候后放在4℃的冰箱中保存，以备下次实验使用。 五 高活力淀粉酶菌株的筛选 5.1菌悬液的配制：

取出保存菌株的试管，挑选生长较好的菌株，向里面加入无菌水5ml，用接种针

-5

-6

-7

-8

轻轻挑取菌落，将液体倒入盛有无菌水的100ml三角瓶中（内装有玻璃珠）,洗脱3次，定容至50ml。放置在摇床上震荡20min。 5.2 接种

将菌悬液按5%的接种量接入装有20ml的不加琼脂的液体培养基中，培养2h。

5.3计数

取液体培养基中的菌液稀释，取稀释好的菌悬液0.2ml制成片在显微镜下选择一定区域数出总的细菌数。随机选择三片区域进行选择，分别数出这三片区域的细菌数。 5.5 鉴定

将配置好的质量分数为2％淀粉溶液中加入离心后的上清液1ml，于37 ℃水浴10 min然后沸水浴5 min，终止反应，再加入,2ml碘液，沸水浴5 min后，迅速冷却观察颜色。，同时也在2％淀粉溶液中加入2ml碘液作为对照，按上步奏反应。与对照比较观察颜色变化较大的说明酶活力较高。反之亦然。 六 实验结果

待做 七 实验评估

在自然界的土壤中存在能产生淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土样悬

液、杀死非芽孢细菌、平板分离可获得疑似芽胞杆菌的单菌落，将单菌落点接含有淀粉的平板，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围也会出现水解圈，但肉眼不易分辨，用碘液染色法染色后显现出透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。由此可将产淀粉酶能力的菌株分离。透明圈与菌落直径比值的大小在一定程度上反映了菌落纯度和产淀粉酶的活力

菌株产生淀粉酶的能力：前者与后者的比值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉的能力也就越强。

在菌落的初选过程中可在培养基上长出大量各种各样的菌落，经过初步鉴定，可大致选出产淀粉酶的菌落，在平板划线时，把平板分四区，达到逐步稀释的效果，第一区的菌落密度较稠，随着逐渐的稀释，在第四区可能会出现单菌落，经过再次鉴定后，在线面划线挑取菌落时，尽可能的挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的单菌落，这样可以得到较纯的菌株。 八 注意事项

1、在操作过程中，必须保证为无菌操作，避免造成污染。

2、分离纯化时尽量选择单菌落进行纯化。 3、鉴定中的冷却必须是迅速冷却，减少误差。 九 参考文献

[ 1 ] 宋欣,微生物酶转化技术[M].北京：化学工业出版社，2004：13,17,158-159. [ 2 ] 王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学[M].北京:高等教育出版社.2002.9(第三版):42-44.

[ 3 ] 胡欣洁,邓斌,胡承.微生物α—淀粉酶的研究进[J].中国防伪2005.9:58-60. [ 4 ] 陈波,李大力,杨树林.酸性α—淀粉酶生产菌的筛选和酶的纯化及酶的性质研究[J].食品科学.2005,26(5):119- 121.

[ 5 ] 张亚川,马文,冯一兵.淀粉酶的研究最新状况[J].肉品卫生,1998,182(8):10,14.

[ 6 ] 曹雪莲,刘均洪,真菌葡糖淀粉酶的研究进展[J],化工生产技术.2006,13(5):50—52.

[ 7] 王弋博,李博,李三相,张海林等.异淀粉酶生产菌的分离纯化以及生长特性[J].青海师范大学学报.2003,1:181-85.

[8] 马晓军,张晓君,王锐等.碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究[J].西北植物学报2002,22(4):883-888.

[9] 翁庆北,赵维娜,万晴姣.习酒酒曲中产淀粉酶细菌分离及性质研究[J].酿酒科技.2006.139(1):21-22.

[10] 朱学军, 孟庆繁,滕利荣,张应玖等.高产新型淀粉酶菌株MS511的选育及最适产酶条件[J]. 吉林大学学报(理学版). 2002,140(2):196-199.

[11] 曲音波,林建强,肖敏.微生物技术开发原理. 北京：化学工业出版社，2005,3:46.

[12] 杨文博.微生物学实验[M].北京:化学工业出版社.2004.9:44-48,221. [13] 钱存柔,黄仪秀,微生物实验教程[M].北京:北京大学出版社,2001: 17-22,66-69.

[14] 刘泽军.淀粉酶测定进展[J ].国外医学临床生物化学与检验学分册.1992,13: 15-21.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/h942.html