实验二 细菌抹片的制备及染色

实验二 细菌抹片的制备及染色

一、

提前十分钟进入实验室，抄写板述。上课，点名入座。

板述内容： 一）、目的要求

1、掌握细菌抹片的制备方法 2、掌握细菌的革兰氏染色法 二）、实验内容

1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。

2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。 3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌） 4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教） 三）作业

1、叙述细菌抹片的制备方法 2、叙述革兰氏染色的方法

3、绘出细菌形态图并注明染色方法 二、

总结上次实验作业，有两个突出问题。

1、 多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。 2、 有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。 三、

实验第一部分：抹片的制备

1、 实验的目的和意义

细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。 2、 细菌抹片的制备

进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下： （1）玻片准备

载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如

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有油渍，可按下列方法处理：

A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。

B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。 （2）抹片

所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

C、组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压积或涂抹成一薄片。

如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有秩序地排好，作多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

（3）干燥：上述涂片，应让其自然干燥。 （4）固定：有两类固定方法。

A、火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。

B、化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2-3分钟，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2~3分钟后，自然挥发干燥。抹片如作瑞特氏染色，则必先须作特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。 目的：将抹片固定的目的有如下几种：

①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附玻片，以免水洗时易被冲掉 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力较强。

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③可能杀死抹片中的微生物。

必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片时，应严格慎重处理染色用过残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即可进行各种方法的染色。 四、

实验第二部分：染色

常应用各种染料对细菌进行染色，由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用，以及离子交换，酸碱等化学作用，染料就能使细菌着色，且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而含有不同的染色反应。 常用的细菌染色方法，主要有两种类型： 1、简单染色法

只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。 2、复染色法

应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用。染色后不同的细菌和物体，或者细菌构造的不同部分可以呈现不同的颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆萨染色法。 1）美蓝染色法

在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹点即可）美蓝染色液，经1-3分钟，水洗，干燥（可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干），镜检。

2）革兰氏染色法

A、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2分钟，水洗。

B、加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-2分钟，水洗。 C、加95%酒精于抹片上脱色，约0.5-1分钟，水洗。

D、加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10-30秒，水洗。

E、吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 3）抗酸染色法

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首先在已干燥、固定好的抹片上，滴加较多量的石炭酸复红染色液，在玻片下以酒精灯火焰微微加热至发生蒸气为度（不要煮沸），维持微微发生蒸气，经3-5分钟，水洗。然后用3%盐酸酒精脱色，至标本红色脱出为止，充分水洗。再用碱性美兰染色液复染约1分钟，水洗。最后吸干，镜检。抗酸性细菌呈红色，非抗酸细菌呈蓝色。 4）瑞氏染色法

方法一：抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或者看情况补充滴加，经1-3分钟，再加约与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使与染液混匀，经5分钟左右，直接用水冲洗（不可先将染液倾去），吸干或烘干，镜检。细菌染成蓝色，组织、细胞等物呈其他颜色。

方法二：抹片自然干燥后，按涂抹点大小，盖上一块略大的清洁滤纸片，在其上轻轻滴加染色液，至略浸过滤纸，并看情况补滴，维持不使变干；染色3-5分钟钟，直接以水冲洗，吸干或烘干，镜检。此法的染色液经滤纸滤过，可大大避免沉渣粘附抹片上而影响镜检观察。 5）姬姆萨氏染色法

A、于5毫升新煮过的中性蒸馏水中滴加5-10滴姬姆萨染色液原液，即稀释成常用的姬姆萨染色液。

B、抹片经甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟，或者染色数小时至24小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织、细胞等呈其他颜色，视野常呈红色。 五、作业

1、叙述细菌抹片的制备方法 2、叙述革兰氏染色的方法

3、绘出细菌形态图并注明染色方法 六、实验总结

本次实验的最主要内容是革兰氏染色法，这种方法在以后的实践中十分常用，因此要熟练掌握。值日同学在离开前把实验台及地面打扫干净，注意关好水电门窗。

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七、附：

实验二：细菌抹片的制备及染色

实验所需物品

一、试验材料名称 组别 数量 合计 备注 1、平皿 5 2 10 放擦镜纸、酒精棉球 2、擦镜纸 3、酒精棉球

4、双壁瓶 5 1 5 盛香柏油、二甲苯 5、香柏油 1瓶 6、二甲苯 1瓶

7、标本盒 5 1 5 放标本片

8、载玻片：分5 组，每组 12张（6人每人制2张片），60张片＋20张片（供老师示教和学生选择）

9、染色液（美蓝1瓶、革蓝氏染液1套4瓶）5套（注；提前一周检查和配制染色液） 10、吸水纸 5本

11、下口瓶 5个 提前加入水半瓶 12、废液缸 5个 用后废液注意处理

13、菌 种：大肠杆菌菌液5管、葡萄球菌平板5套（注：提前一周制普通肉汤和普通琼脂并接种）

二、仪器设备名称

显微镜 5组 3台 共 15台

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表1、试验仪器设备统计表

学院牧医工程 实验室名称畜牧微生物 实验名称实验二细菌抹片的制备及染色

仪器设备名称 药品柜 恒温培养箱 烘烤箱 普通水箱 低温水箱（冰柜） 高压灭菌器 流通蒸汽灭菌器 水平式电动离心机 抽水机（真空泵） 赛式细菌滤器 G1-6波动滤器 显微镜 超净台 无菌室 试验台 试验台灯 数量 （台、套） 2个 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1套 1套 32台 1台 1个 7个 7套 设备 现状 有1个 有 已坏 无 无 已坏 无 无 无 无 无 有 无 无 有 已坏4套 备注

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表2、试验试剂消耗情况统计表

学院牧医工程 实验室名称畜牧微生物 实验名称实验二细菌抹片的制备及染色 分类 实组组试蒸单人试再情 验均剂馏价均剂利况内容 人消量水消（用元试剂名称 数数耗耗 香柏油 二甲苯 牛肉膏 氯化钠 蛋白胨 琼脂粉 碱性美兰 KOH 草酸铵 结晶紫 碘片 碘化钾 碱性复红 32 32 培 养 细 菌 染 色 制 备 各 种 标 本 片 6 6 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 5000ml 5000ml ） 合计 7

表3.实验用低值易耗品及实验动物统计表

系别： 牧医 实验室名称： 畜牧微生物 实验名称：实验二细菌抹片的制备及染色

实验人数 玻璃仪器 种类 油壶 平皿 载玻片 乳钵 漏斗 32 量筒 刻度三角瓶 胶塞三角瓶 棕色瓶 大试管 合计

器械（材） 种类 手术剪 手术刀 镊子 标本片盒 接种棒 小瓷盘 大瓷盘 钉书机 数量 2 2 2 20 2 2 2 1 消耗材料 种类 擦镜纸 吸水纸 标签纸 绘图纸 乳胶手套 线手套 毛巾 肥皂 洗衣粉 钉书针 数量 2 5张 20 2 2 2 2 2 2 1盒 实验动物 种类 小白鼠 鸡 数量 6 4 其它 种类 工作服 瓷盆 铝锅 铝壶 拖把 笤帚 垃圾斗 塑料桶 鸡笼子 鼠笼子 数量 2 2 2 1 2 2 2 1 2 2 数量 20 30 10 2 2 2 2 6 20 30 单价 人均（元） 费用 再利用情况 8

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/h565.html