高变异药物生物等效性评价中多组试验的设计及统计分析 - 张煊

·1115·

◇定量药理学◇

中国临床药理学与治疗学

中国药理学会主办

CN34-1206/Ｒ，ISSN1009-2501

http：//www．cjcpt．com

2015Oct；20（10）：1115－1121

高变异药物生物等效性评价中多组试验的设计及统计分析

1112

闫冬，高静，谢小青张煊，

1

辽宁亿灵科创生物医药科技有限公司，本溪117004，辽宁；

2

沈阳亿灵医药科技有限公司，沈阳110179，辽宁

难

［2］

摘要目的：评价高变异药物的生物等效性。方

法：首先综述了目前高变异药物生物等效性评价的试验设计特点，然后采用多组试验设计方法进行高变异药物生物等效性评价，结合一个实例详细给出统计模型及统计分析方法，计算了90%置信区间及个体内变异系数及把握度等参数，并提供了用SAS分析的程序代码。结果：根据实例统计分析的90%置信区间为84．79%～104．17%，把握度为82．46%。结论：多组试验设计方法具有增加把握度及便于试验管理等方面的优点，且统计模型也适合两阶段设计或多中心设计等其他生物等效性试验设计。

生物等效性；高变异药物；多组试验；两

阶段设计；置信区间；把握度关键词

中图分类号：Ｒ969．1文献标志码：A

2501（2015）10-1115-07文章编号：1009-近年来，随着仿制药物的快速发展，高变异药

物的生物等效性评价越来越引起广泛的关注，由于个体内变异系数的增大，需要增加受试者例［1］

数。虽然可以采用重复交叉设计、成组序贯设计（groupsequentialdesign），或统计时放宽等效性的界限如比例标化平均生物等效性法（SABE）等试验设计或统计方法，但都存在着一定的困

2015-03-07收稿2015-06-15修回

“重大新药创制”国家科技重大专项（2014ZX09201002）张煊，男，博士，主要从事临床药代动力学及生物等效性研究工作。

Tel：024-45864101E-mail：Williamzhang@Inpharm-tech．com

。本文介绍一种适合于高变异药物生物等

效性评价的多组试验设计方法，结合实例详细给

出统计模型及统计分析结果，并对相关影响因素进行讨论，以促进新药临床试验的发展。

1

目前高变异药物的生物等效性试验设计特点

药代动力学参数（一般指Cmax及AUC）的个

体内变异系数（intrasubjectCV%）大于30%者为

［3］

高变异药物。生物等效性试验设计受试者的

［4］

例数一般为18～24例，对于个体内变异性大的

18～24例已经无法满足统计功效药物来说，

（power）的要求，有些高变异的药物，在采用标准

的交叉试验设计时，当药物个体内变异系数为30%时，如果两制剂的差异为5%，至少需要38例受试者才能获得80%的把握度；个体内变异系数为40%时，至少需要68例；个体内变异系数为

［1］50%时，至少需要106例。

采用重复交叉设计实验（如2×4交叉，采用TＲTＲ或ＲTＲT的顺序），受试者服药4个周期，

且采血量也非常大，容易发生脱落的情况，脱落率也较高，脱落一例相当于传统双交叉的两例，而且实际例数并未减少。在放宽等效性判断限值

FDA是接受放宽等效性判断范围的，的方法中，

而欧洲医药管理局（EMA）认为Cmax差异较大对

于临床的影响不大且基于临床的充分理由时，则可以放宽接受范围（最宽为69．84%～143．19%），标准范围（仍为不接受AUC的放宽，

80．00%～125．00%）［5］。成组序贯设计，适用于事先不知道制剂的变异情况。且如果期中分析不等效，则受试者人数追加，可能与经典设计的人数

［2］

·1116·

stagedesign）是成组序。两阶段设计（two-贯设计的特例，相当于两组分两个阶段进行，相当

EMA指导原则中接受此项设计，只是需要事先在

［5］

方案中规定。这种设计容易增加发生I类错误

［6］

的概率，有文献报道控制总体I类错误的各种

［2］

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试验，例如前文提到的个体内变异系数为50%时

的106例受试者，假设分成3组时每组约为36人（或分成4组每组27人）。这样试验设计的优点一是每组的人员数量可以根据研究机构的试验能力进行调整，二是分几个时期完成不同的试验组别，试验管理也容易，受试者的脱落情况也容易控制，最终也能够完成总例数较多的试验，从而增加了把握度，而且如果产品真实等效的话，可以有更大的概率通过等效的置信区间。

从多组试验的设计来看，与成组序贯试验（或两阶段试验）及追加试验（add-on）等设计相比，其本质都是分成两组（阶段）或多组（阶段），

区都是采用相同的试验方案在同一地点进行等，别在于多组试验是最后合并多组数据后一次统计

分析，而成组序贯（或两阶段试验）需要进行预先的显著性水平设定和期中分析，达到预先的结果可以停止试验，而追加试验是在第一次试验统计功效小于80%时（几何均值比仍在等效范围内），通过计算样本量后重新增加例数而进行的一组试验，最后再合并分析。

方法，但未见发布相关的指导原则。最近几年，

FDA和EMA采用了比例标化平均生物等效性法（SABE）评价高变异药物的生物等效性并用于药

［7-8］，品的注册审批其一般采用半重复或完全重复的交叉试验设计，受试者样本量一般不少于24

例，根据参比制剂的个体内变异，成比例放宽等效性判断的限值。

对于高变异的药物的生物等效性评价，增加

［1］

受试者例数仍然是最简单和有效的方法。但存在操作难度增大，及伦理学和试验管理等问题。生物等效性试验通常在一个研究机构实施，所有受试者为一组进行招募入组和试验。由于一期临床试验研究机构的实验能力有限，一般一次能够试验的最大受试者数量约在25～50人之间。但对于某些高变异药物，在例数非常大的时侯，如上面提到个体内变异系数为50%时的106例，研究机构是无法按传统的双交叉设计完成试验的。即使采用重复交叉的设计，也至少需要53例受试者，对于普通的研究机构也是难以完成的。

3

多组试验设计的统计模型及置信区间

计算

所因为最后的评价是根据多组的合并结果，

以统计模型应该反映多组的特性。参考EMA的

2生物等效性多组试验设计

如果是两种标准的生物等效性的试验设计，

制剂比较，一般为双处理、双周期，两序列的交叉设计。受试对象随机分为两组，按一定顺序处理，一组受试者先服用受试制剂，后服用参比制剂；另一组则相反。由于自身交叉对照，将制剂因素对药物吸收的影响与其他因素区分开来，减少了不

［3］同试验周期和个体间差异对试验结果的影响。FDA的生物等效性统计方法指导原则中提到了

［10］

关于两阶段设计的统计模型，与标准的双交叉相比，多了一个组别（阶段）的因素。为了反映出

第一组的周期与第二组的周期时间上是不同的，所以采用嵌套在组别中的周期，在方差分析中还需分析处理与组别的交互作用项（FDA在当各组不是来自同一群体或给药时间离得比较长时要求

［9，11］

）等。药代参数进行对数转换后，此项方差分析模型中（参考FDA的推荐，采用一般线性模型［9］

程序GLM），顺序、处理、嵌套固定效应为组别、在组别中的周期、组别与顺序交互作用项和组别与处理交互作用项，随机效应为嵌套在组别和顺序中的受试者。然后用双单侧t检验和计算90%置信区间的统计分析方法来评价和判断药物间的

［12］

生物等效性。Tmax采用非参数检验（Wilcoxon符号秩检验），比较总体的处理之间的Tmax是否具有显著性差异。

（1－2α）%置信区间的上下限的计算公式为

多组试验设计方法（multiplegroups）：在一次研究的受试者数量有限，可以实施两组或多组的试验

［9］

。在不同的时间，在同一试验研究机构按相

同的实验方案（如相同的制剂、相同的采血点等）进行多组的标准双交叉生物等效性试验，就像多个单独的试验，分组试验完成后统一进行样品分析，合并各组的数据后统计，最后的评价是根据多组的合并结果。这样设计比较适合样本量很大的

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·1117·

x～t非中心t分布的随机变量（非中心参数nc），

（df，nc），则x的累积分布函数CDF（t，df，nc）=Pr（x≤t），df，则把握度1－β=CDF（t1－α，df，nc1）－CDF（t1－α，df，df，nc2），其中nc1=XT－XＲ－Ln（0．8）XT－XＲ－Ln（1．25）

，nc2=，

DiffSEDiffSEt1－α，df是误差自由度df下t分布密度函数的100（1－α）%点。

100×e（XT－XＲ）

（XT－XＲ）为对数，其中，

转换后受试制剂和参比制剂均数之差；e为自然

DiffSE为均数差异对数的底数；df为残差自由度，

subjectCV）=的标准误。个体内变异系数（Intra-2

±t0．1，df×DiffSE

2

100×槡es－1，其中S为以e为底自然对数转换后的药代动力学参数，经上述合并结果方差分析

［6，12］

。得到的残差（MSE）

把握度Power的计算，采用Schuirmann双单

［6，13］

，假设x是自由度df下服从侧t检验的方法

表1

多组试验的GLM方差分析表

变异来源

嵌套在组别和顺序中的受试者

顺序

嵌套在组别中的周期

处理组别

组别与顺序交互作用项组别与处理交互作用项

残差总变异

这m组的总受试者数量为n。注：假设组别共m组，

模型表示

Subject（Sequence*Group）

SequencePeriod（Group）TreatmentGroupSequence*GroupGroup*TreatmentＲesidualerror

Total

自由度n－4121m－1m－1m－1n－3m+22n－1

4实例分析

行试验（每组分别入选34例和32例），第一组双

交叉试验结束一周后，再开始第二组双交叉试验，试验结束后，一起进行样品分析和统计。在给药

64位受试者完成了研究（两组的66位受试者中，

分别完成34例和30例）。数据如表2所示（以

AUC的为例，Cmax的统计方法也是相同的，未列入）：

某个体内变异性较大的药物进行生物等效性

评价，通过预试验估计正式试验的例数，如果两制剂的差异小于5%，把握度大于80%，则正式试验有效例数约在55～62例的范围。因此，考虑到脱落因素，入选66例，随机分成两组按相同方案进

表2

多组试验中64名受试者的参比制剂和受试制剂AUC结果

服药顺序TＲＲTＲTＲTTＲTＲTＲＲTTＲＲTTＲ

分组11111111111

参比制剂1832．802769．8612220．962568．3110352．133899．114521．353054．005659．746154．715790．11

受试制剂5580．623271．7711917．703141．509351．002589．444208．783509．772792．764652．074246．79

受试者3536373839414243444546

服药顺序ＲTＲTＲTTＲＲTTＲＲTTＲTＲＲTTＲ

分组22222222222

参比制剂7503．324245．5711836．242062．435532．146689．155502．756811．398951．166623．954627．72

受试制剂3989．165665．9114108．114775．084665．2311326．467906．5712872．089674．136695．223019．02续下表

受试者1234567891011

·1118·

接上表受试者1213141516171819202122232425262728293031323334

服药顺序ＲTTＲTＲＲTTＲＲTＲTTＲＲTＲTＲTTＲTＲＲTTＲＲTＲTTＲTＲＲTTＲTＲTＲ

分组11111111111111111111111

参比制剂6859．945001．0213071．724566．484286．764920．066475．7711453．946114．0911715．502127．311131．493021．986208．242498．415777．8114638．519602．917725．9712755．623957．739191．684141．44

受试制剂3726．288259．374112．524921．673665．342518．523091．984999．533883．178251．202783．881869．464067．888434．588877．485760．056509．973766．589386．635613．342704．208459．892806．12

受试者47484950515253545556575960616263646566

ChinJClinPharmacolTher2015Oct；20（10）

服药顺序ＲTＲTTＲＲTTＲＲTTＲＲTＲTTＲＲTＲTTＲTＲＲTＲTTＲTＲＲT

分组2222222222222222222

参比制剂6133．616267．679102．964079．718359．113100．235768．587461．887201．124532．753489．745038．404368．884653．665819．425468．944244．253620．125855．17

受试制剂7616．266382．695105．213409．799202．944478．103994．965995．2011398．666858．792940．534091．944107．732289．329910．684991．353325．822862．749213．27

5结果6讨论

有文献报道

［11］

64名健康受试者口服受试制剂和参比制剂

后，平均血药浓度-时间曲线见图1。

因素水平表及方差分析结果如表3和表4所示，置信区间及个体内变异系数及把握度等参数见表5所示。

，当处理与组别的交互作用项

在方差分析的检验显著时，则从统计学上来说合并各组数据是不合适的。在交互作用项显著的情况下，即使合并分析通过了等效标准，结果可能会有所争议。EMA的指导原则中

［10］

，两阶段等效

法的统计模型中不包括处理与阶段的交互作用项。因此，在当处理与组别的交互作用项不显著时，建议使用去掉此交互作用项后的模型重新进行统计（本例中未列出去除交互项后的统计结果）以决定可接受性。如果混合组（没有交互作用项）通过了等效标准或在存在处理与组别交互作用项时任何单一一组满足生物等效，则说明受

［11］

试制剂可以满足生物等效性。还有文献报，发现两阶段等效法中的阶段与顺序交互作用项一般也不显著。道

多组试验统计模型，同样适用于两阶段设计合并各组后的生物等效性统计。将其中的group

［14］

图164名受试者口服受试制剂和参比制剂后平均血药

浓度-时间曲线图（x±s，n=64）

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项不显著。本试验设计的一个不足之处是采用多组试验，试验的周期较长。如果想缩短试验周期或某些采用患者进行等效试验但是招募困难的项目，可考虑进行多中心试验并采用上述统计模型。另外，由于本试验设计的周期偏长，在血样采集前，应在生物样品分析时充分考察长期稳定性，以保证样品的稳定。

换为stage即可。同样，将group因素换为因素，

center，也适用于多中心生物等效性评价。参考EMA对于两阶段等效中每个阶段的例数规［10］定，建议不少于12对于多组试验中每组例数，例。而且考虑到试验组间均衡性的问题，建议多组试验中各组试验的例数应相近，以保证各组别间的差异尽量小，也可以使处理与组别交互作用

表3

因素水平表因素SubjectSequenceGroupPeriodTreatment表4

水平642222

值

12345678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637383941424344454647484950515253545556575960616263646566ＲTTＲ1212ＲT

注：NumberofObservations128。

方差分析结果表

Source

DF676012711160211

SS24．61007．181431．79140．41530．31530．003423．27280．09560．12140．2937

0．41530．31530．00340．38790．04780．12140．2937

3．472．630．033．240．401．012．45

0．06740．10980．8669＜．00010．67260．31790．1225

MeanSquare0．36730．1197

FValue3．07

Pr＞F＜．0001

ModelError

CorrectedTotalGroupSequenceSequence*GroupSubject（Sequence*Group）Period（Group）TreatmentGroup*Treatment

注：NumberofObservations128。

表5多组试验中AUC生物等效性评价的有关结果

受试制剂几何均数5091．81

参比制剂几何均数5417．81

几何均值比（%）93．98

90%置信区间84．79～104．17

个体内变异系数（%）35．66

把握度（%）82．46

药代参数Log（AUC）

90%置信区间在80%～125%之内，AUC符合等效标准，结果表明，且把握度大于80%，可满足统计要求。

7SAS统计代码

1

16666

dataBioequivalence；/*建立数据集Bioequiv-alence*/

inputSubjectSequence$GroupTreatment$PeriodAUC；

logAUC=log（AUC）；/*对AUC进行对数转换*/

datalines；

TＲTＲ……ＲTＲT

1122

ＲTＲT

2112

1832．805580．625855．179213．27

；/*数据录入，包括每个受试者的入选号、服药顺序、组别、处理及周期等*/

procglmdata=Bioequivalenceoutstat=Tano-va；/*GLM方差分析结果输出到数据集Tanova*/

·1120·

classSubjectSequenceGroupPeriodTreat-ment；

modellogAUC=GroupSequenceGroup*Se-quenceSubject（Group*Sequence）Period（Group）TreatmentGroup*Treatment/ss3solutionp；

randomSubject（Group*Sequence）/test；outputout=predp=yhatr=residstudent=stresid；

lsmeansTreatment/stderrpdiffalpha=0．10clout=lsmean；/*最小二乘均数输出到数据集lsmean*/

procprintdata=tanova；procprintdata=lsmean；

procsortdata=Bioequivalence；bySequencegroupsubjectTreatment；/*数据集按顺序、组别、受试者和制剂排序*/

procprintdata=Bioequivalence；/*输出数据集*/

procmeansndata=Bioequivalence；bySe-quenceGroup；varAUC；outputout=non=n；

dataerror；settanova；if_SOUＲCE_=＇EＲ-ＲOＲ＇；/*方差分析结果残差的计算*/

MSE=ss/df；sse=ss；id=1；keepidmsessedf；procsortdata=error；byid；

dataSubSeq；settanova；if_SOUＲCE_=＇Sub-jec（Sequen*Group）＇and_TYPE_=＇SS3＇；

MSB=ss/df；ssb=ss；id=1；keepidMSBssbdf；procsortdata=SubSeq；byid；

datano1rt；setno；ifGroup=1andsequence=＇ＲT＇；n1rt=n/2；id=1；keepn1rtid；procsortdata=no1rt；byid；

datano2rt；setno；ifGroup=2andsequence=＇ＲT＇；n2rt=n/2；id=1；keepn2rtid；procsortdata=no2rt；byid；

datano1tr；setno；ifGroup=1andsequence=＇TＲ＇；n1tr=n/2；id=1；keepn1trid；procsortdata=no1tr；byid；

datano2tr；setno；ifGroup=2andsequence=＇TＲ＇；n2tr=n/2；id=1；keepn2trid；procsortdata=no2tr；byid；

datalsmeanＲ；setlsmean；ifTreatment=＇Ｒ＇；/*参比制剂最小二乘均数ＲefLSM的计算*/

ChinJClinPharmacolTher2015Oct；20（10）

ＲefLSM=lsmean；id=1；keepidＲefLSM；procsortdata=lsmeanＲ；byid；

datalsmeanT；setlsmean；ifTreatment=＇T＇；/*受试制剂最小二乘均数TestLSM的计算*/

TestLSM=lsmean；id=1；keepidTestLSM；procsortdata=lsmeanT；byid；

dataTwoside；mergelsmeanＲlsmeanTno1rtno2rtno1trno2trerrorSubSeq；byid；

n1=n1rt+n2rt；n2=n1tr+n2tr；

spool=MSE*（（1/n1tr）+（1/n2tr）+（1/n1rt）+（1/n2rt））*0．125；DiffSE=sqrt（spool）；

IntraSubjectCV=100*sqrt（exp（MSE）－1）；/*个体内变异系数的计算*/

InterSubjectCV=100*sqrt（exp（（MSB－MSE）/2）*/

ＲefGeoLSM=EXP（ＲefLSM）；TestGeoLSM=EXP（TestLSM）；Difference=TestLSM－Ｒe-fLSM；

Ｒatio=100*EXP（Difference）；/*对数转换后受试与参比均数之差及平均比值*/

t=（TestLSM－ＲefLSM）/DiffSE；

t1=

（（TestLSM－ＲefLSM）－LOG（0．8））/DiffSE；t2=（（TestLSM－ＲefLSM）－LOG（1．25））/DiffSE；/*双单侧t检验的低限和高限界值*/

ct90=tinv（0．95，df）；absct90=abs（ct90）；lower90=（TestLSM－ＲefLSM）－（absct90*DiffSE）；upper90=（TestLSM－ＲefLSM）+（ab-sct90*DiffSE）；CI90_lower=EXP（lower90）*100；CI90_upper=EXP（upper90）*100；/*90%置信区间上下限计算*/

prob1=probt（ct90，df，t1）；prob2=probt（－ct90，df，t2）；Power=（prob2－prob1）*100；/*把握度Power的计算*/

procprint；varIntraSubjectCVInterSubjectCVDiffSEＲefLSMTestLSMＲefGeoLSMTestGeoLSMn1n2dfMSEMSBdifferenceＲatiott1t2ct90ab-sct90lower90upper90CI90_lowerCI90_upperPow-er；run；

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two-stagedesignsinbioequivalenceassessment［J］．JPharmPharmacol，2014，66（1）：48-52．

［2］

［3］

［4］

［5］

［6］

［7］

Clinicaltrialsdesignandstatisticalanalysisofmultiplegroupsforthe

bioequivalenceevaluationofthehighly-variabledrugs

ZHANGXuan1，YANDong1，GAOJing1，XIEXiao-qing2

1

LiaoningElivingBiomedicaloTechnologyCO．，Ltd，Benxi117004，Liaoning，China；PharmaceuticalCO．，Ltd，Shenyang110179，Liaoning，China

2

ShenyangE-living

ABSTＲACTAIM：Toevaluatetheaveragebio-equivalenceofhighly-variabledrugs．METHODS：

Thepaperreviewedthefeatureofthepresentdesignsoftheaveragebioequivalenceofhighly-variable

drugsfirst，theninvestigatedthemultiplegroupsde-signstoevaluatetheaveragebioequivalenceofhigh-ly-variabledrugs，andcombinedtogetherwithoneexample，discussedtheapplicationofthestatisticalmodelandcalculatedthe90%confidenceintervalandthepower，finallyprovidedthecodesoftheSASsoftware．ＲESULTS：Basedonexamples，the90%

confidenceintervalwas84．79%-104．17%andthe

powerwas82．46%．CONCLUSION：Thedesignofmultiplegrouptrialshascharacteristicofincreas-ingpowerandmanagementfacility，andthestatisti-calmodelissuitablefortwo-stageandmultiple-cen-tertrialsdesignsofbioequivalence．KEYWOＲDSbioequivalence；highly-variabledrugs；multiplegroups；two-stagedesign；confi-denceinterval；power

本文编辑：李娟

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