植物细胞组织培养的基本技术（总结版）

本章主要内容

? 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 ? 培养基及其配制 ? 外植体的选择与培养 ? 试管苗的驯化与移载

第一节 商业性组织培养实验室和小工厂

的设计与主要设备

? 培养皿的清洗；

? 培养基的配制、分装和高压灭菌； ? 无菌操作——材料的表面灭菌和接种； ? 将培养物放到培养室培养；

? 试管苗的驯化、移栽和初期管理。

(一)、洗涤室(cleaning room)

? 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 ? 室内配备：

? 大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 ? 备有塑料筐，用于运输培养器皿。

? 备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。

(二)、准备室(repairing room)

? 完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 ? 如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与

培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。

(三)、缓冲室

? 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 ? 应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。

(四)、无菌操作室(transfering room)

? 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏

对组织培养成功与否起重要作用。 ? 配置：

? 在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁

尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 ? 接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射

灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。

(五)、培养室(culturing room)

? 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、

数目、及其他附属设备而定。 ? 设计原则：

? 充分利用空间和节省 ? 能源

? 高度比培养架略高为 ? 宜

? 周围墙壁要求有绝热 防火的性能。

(五)、培养室(culturing room) ? 培养架大多由金属制成。 ? 规格：

? 一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左

右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W的长1m，宽度一般为60cm。

? 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或

立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。 ? 控制日光照时间可安装定时开

关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。

(六)、驯化室

? 驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、

通风口以及必要的杀菌剂。

(七)、温室

? 应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必

要的杀菌杀虫装置及相应药剂。

二、仪器设备和器皿用具 ? 常见仪器设备

? 1、超净台 ? 2、无菌箱 ? 3、空调机

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4、除湿机 5、恒温箱 6、烘箱

7、高压灭菌锅 8、冰箱

9、电子分析天平和托盘天平 10、显微镜及解剖镜 11、水浴锅 12、摇床与转床 13、磁力搅拌器 14、电蒸馏水器 15、酸度计 16、离心机

1、超净台和无菌箱

? 1、超净台，优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟

即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。

? 2、无菌箱，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂

熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。

工作原理

? 超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这

里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0．3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。

? 根据风幕形成的方式，超净台可分为水平式和垂直式二种型号。

（二）各类玻璃器皿

1、培养器皿 2、分注器 3、离心管 4、刻度移液管 5、细菌过滤器 6、实验器皿

1、培养器皿

? 1、培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶

解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。 ? 最常使用的是

? 三角瓶

? 培养皿（9、12cm直径）用于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、

无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。

? 试管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：培养较高的试管苗。

? 工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量

繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。

瓶口封塞

? 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。 ? 以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多

采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。

5、细菌过滤器

? 用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭

菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。

6、实验器皿

? 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，

包括:

? 100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯； ? l0ml、l00ml、1000ml量筒；

? l00ml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。

（三）、器械用具（P13）

? 1．镊子类：尖头和枪形 ? 2．剪刀类 ? 3．解剖刀 ? 4．解剖针

? 5、接种工具：接种针、接种钩及接种铲（由白金丝或镍丝制成） ? 6、钻孔器

? 7、其它：酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等

第二节 培养基及其配置 ? 目的要求：

? (1)一般掌握培养基的种类、特点； ? (2)掌握基本培养基的配方；

? (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；

? (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤； ? (5)熟练掌握培养基的灭菌方法； ? (6)一般掌握培养基的筛选办法。

培养基及其配制 ? 培养基的种类

? 培养基的成分 ? 培养基配制

1.培养基的种类 ? 按成分分类:

? MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。 ? 按状态： 液体，固体。

（1）MS培养基（Murashige and Skoog Medium） MS培养基（Murashige and Skoog Medium）

? Toshio Murashige, Folke Skoog. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays

with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962,15:473-497. ? 植物组织培养中常用的一种培养基。

? 离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基高。 ? 器官，花药，细胞，原生质体培养。

（2）B5培养基（B5 Medium）

? Gamborg, O. L.; Miller, R. A.; Ojima, K. Nutrient requirements of suspension

cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151–158; 1968.

B5培养基（B5 Medium） ? 铵含量较低

? 木本植物，十字花科植物

（3）White培养基（White Medium）

? White, P. R. Handbook of plant tissue culture. New York: The Ronald Press Co.;

1943. White, P. R.; Grove, A. R. Proceedings, International Conference on Plant ? Tissue Culture (1963: University Park, PA). Berkeley, CA: McCutchan Pub. Corp.;

1965:553 pp. ? 无机盐含量低 ? 生根培养

（4）NT培养基（NT Medium） ? 1970

? 烟草叶肉原生质体培养

（5）KM-8培养基（KM-8 Medium） ? 1974

? 有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸 ? 原生质体和融合体培养

（6）N6培养基（N6 Medium） ? 1974，朱至清等。

? 成分简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高 ? 小麦，水稻及其他植物花药培养和组织培养

2.培养基的成分 ? 水

? 无机营养成分 ? 有机营养成分 ? 植物生长调节剂 ? 附加成分

（1）水

? 培养基的主要组分

? 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不

可缺少的物质。

? 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉

变质。大规模生产时可用自来水。

（2）无机营养组分 ? 作用

? 满足植物对各矿质元素的需求。 ? 大量元素，6种 ? 微量元素，7种 ? 非必须元素，6种

铁采用螯合铁，FeSO4加EDTA

（3）有机营养成分 ? 碳源 ? 蔗糖 ? 维生素类

? 硫胺素（B1），烟酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸钙（B5），肌醇。 ? 氨基酸

? 蛋白质组成成分，促进细胞生长。 ? 其他有机附加物

? 椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。可以促进组织生长。 ? 椰子汁

? 椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在

10%-20%。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。 ? 马铃薯

去掉皮和芽后，加水煮30分钟，再经过过滤，取其滤液使用。对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。 其他

? 酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。

（4）植物生长调节物质 ? 生长素 ? 细胞分裂素 ? 赤霉素 ? 乙烯

生长素﹑赤霉素﹑细胞分裂素﹑ 脱落酸﹑乙烯

-------植物激素“五兄弟” ? 生长素（auxin）的发现

向光性：在单侧光的照射下，植物朝向光源方向生长的现象。

1、19世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验 实验材料：胚芽鞘

总结上述三个实验,达尔文提出:

胚芽鞘尖端受单侧光刺激后, 就向下面的伸长区传递影响，造成伸长区背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。

2.1910年詹森（B.Jensen）的实验

琼脂片

云母片

结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。

3.1914年拜尔（Paal）的实验

结论：胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。

4、1928年（F.W.Went）温特的实验

结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。

? 1934年从人尿分离出具有生长素效应的物质——吲哚乙酸。

? 1942年从高等植物中分离出生长素，并确认是IAA。

? 在植物体内，具有促进植物生长的功能，除了吲哚乙酸（IAA）外，还有苯乙酸（PAA）

和吲哚丁酸（IBA）。

生长素生理作用的应用 ? 顶端优势

? 植物的向光性

? 根的向重力性（向地性）

? 茎的背重力性（背地性）

顶端优势：

植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。

形成原因：

顶芽产生的生长素向下运输，大量地积累在侧芽部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使侧芽的生长受到抑制。

茎的背地性和根的向地性生长

植物向光性

在单侧光线照射下，

背光侧>向光侧，背光侧细胞生长快 结果使茎朝向光源一侧弯曲

生长素类似物的应用 (1) 促进扦插的枝条生根

(2) 促进果实发育（培育无籽果实） (3) 防止落花落果，疏花疏果 （4）用作除草剂

1、促进扦插枝条生根

用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。

2、生长素促进果实发育（无籽果实）

传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。

如何培育无籽果实？

在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物，使子房正常发育为果实，因为没有受精，果实内没有种子。

3、防止落花落果

农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的效果。

4、杂草的除草剂

如(2，4-D)，适用于麦田、稻田，双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感，用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物（杂草）的生长。

生长素（auxin） ? 吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。 ? 促进细胞分裂与根分化

? 2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力，但抑制器官分化

细胞分裂素（cytokinin） ? 激动素 （KT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），玉米素 （ZT），异戊烯氨基嘌呤（ 2IP） ? 刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 ? 细胞分裂素常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。

细胞分裂素主要作用：促进细胞分裂

细胞分裂素与生长素相互作用

? 生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”，决定着发育的方向。

? 当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成 ? 当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。

生长素含量高于细胞分裂素

2,4-D 1mg∕L +6-BA 0.1mg∕L

生长素含量低于细胞分裂素

赤霉素（gibberelin acid） ? GA3

? 促进细胞生长

? 刺激不定胚发育成正常小植株

病苗细长，叶色淡绿，比健苗高，病株节间伸长，茎节上逆生不定根，茎杆逐渐变褐，腐烂，其内有白色蜘蛛丝状菌丝。

将赤霉菌培养基的滤液喷洒稻健康水稻幼苗上不感染赤霉菌，却有恶苗病的症状。 1935年科学家从培养基滤液中分离出赤霉素（GA）

GA3诱导甘蓝茎的伸长 ，产生超长茎 GA3 对矮生型豌豆的效应对照

主要作用

促进细胞伸长 促进种子萌发

果实发育 合成部位

幼叶、幼芽、幼根、未成熟的种子

乙烯在常温下是气体。作为生长调节剂用的是乙烯利。 促进果实着色和成熟

乙烯（ethylene）

? 对芽的诱导具有一定作用

? 在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻，实验中很难掌握用量，所以一般

不使用

? 培养的植物组织也会产生乙烯，如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累

乙烯，严重时可引起培养物的死亡 ? AgNO3可逆转乙烯的抑制作用

（5）附加组分

? 活性炭 ? 渗压剂 ? 硝酸银 ? 抗生素 ? 凝固剂

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