植物细胞组织培养的基本技术(总结版)
更新时间:2023-03-09 20:40:01 阅读量: 综合文库 文档下载
本章主要内容
? 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 ? 培养基及其配制 ? 外植体的选择与培养 ? 试管苗的驯化与移载
第一节 商业性组织培养实验室和小工厂
的设计与主要设备
? 培养皿的清洗;
? 培养基的配制、分装和高压灭菌; ? 无菌操作——材料的表面灭菌和接种; ? 将培养物放到培养室培养;
? 试管苗的驯化、移栽和初期管理。
(一)、洗涤室(cleaning room)
? 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 ? 室内配备:
? 大型水槽,最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿,可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 ? 备有塑料筐,用于运输培养器皿。
? 备有干燥架,用于放置干燥涮净的培养器皿。
(二)、准备室(repairing room)
? 完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 ? 如果房间较多,可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与
培养器皿的清洗工作;配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。
(三)、缓冲室
? 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋,戴上口罩。 ? 应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。
(四)、无菌操作室(transfering room)
? 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏
对组织培养成功与否起重要作用。 ? 配置:
? 在工作方便的前提下,接种室宜小不宜大,一般7-8m2,要求地面、天花板及四壁
尽可能密闭光滑,易于清洁和消毒。配置拉动门,以减少开关门时的空气扰动。 ? 接种室要求干爽安静,清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯,用以照射
灭菌。最好安装一小型空调,使室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与外界空气对流。
(五)、培养室(culturing room)
? 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、
数目、及其他附属设备而定。 ? 设计原则:
? 充分利用空间和节省 ? 能源
? 高度比培养架略高为 ? 宜
? 周围墙壁要求有绝热 防火的性能。
(五)、培养室(culturing room) ? 培养架大多由金属制成。 ? 规格:
? 一般设5层,最低一层离地高约10 cm,其他每层间隔30cm左右,培养架即高1.7m左
右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计,如采用40W日光灯,则长1.3 m,30 W的长1m,宽度一般为60cm。
? 培养室最重要的因子是温度,一般保持在20-27℃左右,具备产热装置,并安装窗式或
立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度,最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在70%-80%为好,可安装加湿器。 ? 控制日光照时间可安装定时开
关钟,一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活。
(六)、驯化室
? 驯化室要求清洁无菌,配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、
通风口以及必要的杀菌剂。
(七)、温室
? 应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必
要的杀菌杀虫装置及相应药剂。
二、仪器设备和器皿用具 ? 常见仪器设备
? 1、超净台 ? 2、无菌箱 ? 3、空调机
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4、除湿机 5、恒温箱 6、烘箱
7、高压灭菌锅 8、冰箱
9、电子分析天平和托盘天平 10、显微镜及解剖镜 11、水浴锅 12、摇床与转床 13、磁力搅拌器 14、电蒸馏水器 15、酸度计 16、离心机
1、超净台和无菌箱
? 1、超净台,优点是操作方便自如,比较舒适,工作效率高,准备时间短。开机10分钟
即可操作,可进行长时间使用。在工厂化生产中,接种工作量很大,需要经常长久地工作时,超净台是很理想的设备。
? 2、无菌箱,在投资少的情况下,可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂
熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制,准备时间长,工作效率低。
工作原理
? 超净台功率在145-260W左右,它装有小型鼓风机,使空气穿过一个前置过滤器,在这
里把大部分空气尘埃先过滤掉,然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器,它除去了大于0.3um的尘埃、细菌和真菌孢子等,最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m,这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染,这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作,就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。
? 根据风幕形成的方式,超净台可分为水平式和垂直式二种型号。
(二)各类玻璃器皿
1、培养器皿 2、分注器 3、离心管 4、刻度移液管 5、细菌过滤器 6、实验器皿
1、培养器皿
? 1、培养器皿:在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶
解度小的硬质玻璃制成,以保证长期贮存药品及培养的效果;培养用的还要求透光度好,能耐高压高温,能方便放入培养基和培养材料的器皿,根据培养的目的和要求,可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。 ? 最常使用的是
? 三角瓶
? 培养皿(9、12cm直径)用于:游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、
无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。
? 试管(18mmXl80mm或20mmX200mm)用于:培养较高的试管苗。
? 工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶,加盖半透明的塑料盖,由于瓶口大,所以大量
繁殖时操作方便、工作效率高,也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。
瓶口封塞
? 瓶口封塞可用多种方法,要具有一定的通气性和密闭性,以防止培养基干燥和杂菌污染。 ? 以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染,且不易保持培养基的湿度。现在多
采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性,可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便,且通气好。也可采用专用的封口膜。
5、细菌过滤器
? 用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭
菌。包括滤头,注射器或采用抽滤装置:真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。
6、实验器皿
? 在组织培养中配制培养基,贮藏母液,材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿,
包括:
? 100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯; ? l0ml、l00ml、1000ml量筒;
? l00ml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。
(三)、器械用具(P13)
? 1.镊子类:尖头和枪形 ? 2.剪刀类 ? 3.解剖刀 ? 4.解剖针
? 5、接种工具:接种针、接种钩及接种铲(由白金丝或镍丝制成) ? 6、钻孔器
? 7、其它:酒精灯,电炉,试管架,搪瓷盘等
第二节 培养基及其配置 ? 目的要求:
? (1)一般掌握培养基的种类、特点; ? (2)掌握基本培养基的配方;
? (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量;
? (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤; ? (5)熟练掌握培养基的灭菌方法; ? (6)一般掌握培养基的筛选办法。
培养基及其配制 ? 培养基的种类
? 培养基的成分 ? 培养基配制
1.培养基的种类 ? 按成分分类:
? MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。 ? 按状态: 液体,固体。
(1)MS培养基(Murashige and Skoog Medium) MS培养基(Murashige and Skoog Medium)
? Toshio Murashige, Folke Skoog. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays
with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962,15:473-497. ? 植物组织培养中常用的一种培养基。
? 离子浓度较高,硝酸盐含量较其他培养基高。 ? 器官,花药,细胞,原生质体培养。
(2)B5培养基(B5 Medium)
? Gamborg, O. L.; Miller, R. A.; Ojima, K. Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151–158; 1968.
B5培养基(B5 Medium) ? 铵含量较低
? 木本植物,十字花科植物
(3)White培养基(White Medium)
? White, P. R. Handbook of plant tissue culture. New York: The Ronald Press Co.;
1943. White, P. R.; Grove, A. R. Proceedings, International Conference on Plant ? Tissue Culture (1963: University Park, PA). Berkeley, CA: McCutchan Pub. Corp.;
1965:553 pp. ? 无机盐含量低 ? 生根培养
(4)NT培养基(NT Medium) ? 1970
? 烟草叶肉原生质体培养
(5)KM-8培养基(KM-8 Medium) ? 1974
? 有机成分复杂,包括所有单糖和维生素,呼吸代谢主要有机酸 ? 原生质体和融合体培养
(6)N6培养基(N6 Medium) ? 1974,朱至清等。
? 成分简单,KNO3和(NH4)2SO4含量高 ? 小麦,水稻及其他植物花药培养和组织培养
2.培养基的成分 ? 水
? 无机营养成分 ? 有机营养成分 ? 植物生长调节剂 ? 附加成分
(1)水
? 培养基的主要组分
? 水是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒,是生命活动过程中不
可缺少的物质。
? 配制培养基母液时要用蒸馏水,以保持母液及培养基成分的精确性,防止储藏过程发霉
变质。大规模生产时可用自来水。
(2)无机营养组分 ? 作用
? 满足植物对各矿质元素的需求。 ? 大量元素,6种 ? 微量元素,7种 ? 非必须元素,6种
铁采用螯合铁,FeSO4加EDTA
(3)有机营养成分 ? 碳源 ? 蔗糖 ? 维生素类
? 硫胺素(B1),烟酸(B3),吡哆醇(B6),泛酸钙(B5),肌醇。 ? 氨基酸
? 蛋白质组成成分,促进细胞生长。 ? 其他有机附加物
? 椰子汁,酵母提取物,马铃薯,水解酪蛋白等。可以促进组织生长。 ? 椰子汁
? 椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在
10%-20%。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。 ? 马铃薯
去掉皮和芽后,加水煮30分钟,再经过过滤,取其滤液使用。对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。 其他
? 酵母提取物,香蕉,水解酪蛋白等。
(4)植物生长调节物质 ? 生长素 ? 细胞分裂素 ? 赤霉素 ? 乙烯
生长素﹑赤霉素﹑细胞分裂素﹑ 脱落酸﹑乙烯
-------植物激素“五兄弟” ? 生长素(auxin)的发现
向光性:在单侧光的照射下,植物朝向光源方向生长的现象。
1、19世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验 实验材料:胚芽鞘
总结上述三个实验,达尔文提出:
胚芽鞘尖端受单侧光刺激后, 就向下面的伸长区传递影响,造成伸长区背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。
2.1910年詹森(B.Jensen)的实验
琼脂片
云母片
结论:胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。
3.1914年拜尔(Paal)的实验
结论:胚芽鞘的弯曲生长,是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。
4、1928年(F.W.Went)温特的实验
结论:胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的,并命名为生长素。
? 1934年从人尿分离出具有生长素效应的物质——吲哚乙酸。
? 1942年从高等植物中分离出生长素,并确认是IAA。
? 在植物体内,具有促进植物生长的功能,除了吲哚乙酸(IAA)外,还有苯乙酸(PAA)
和吲哚丁酸(IBA)。
生长素生理作用的应用 ? 顶端优势
? 植物的向光性
? 根的向重力性(向地性)
? 茎的背重力性(背地性)
顶端优势:
植物的顶芽优先生长,而侧芽生长受抑制的现象。
形成原因:
顶芽产生的生长素向下运输,大量地积累在侧芽部位,侧芽对生长素浓度又比较敏感,使侧芽的生长受到抑制。
茎的背地性和根的向地性生长
植物向光性
在单侧光线照射下,
背光侧>向光侧,背光侧细胞生长快 结果使茎朝向光源一侧弯曲
生长素类似物的应用 (1) 促进扦插的枝条生根
(2) 促进果实发育(培育无籽果实) (3) 防止落花落果,疏花疏果 (4)用作除草剂
1、促进扦插枝条生根
用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。
2、生长素促进果实发育(无籽果实)
传粉受精后,胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素,促进子房发育成果实。
如何培育无籽果实?
在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物,使子房正常发育为果实,因为没有受精,果实内没有种子。
3、防止落花落果
农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株,可以达到保蕾保铃的效果。
4、杂草的除草剂
如(2,4-D),适用于麦田、稻田,双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感,用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物(杂草)的生长。
生长素(auxin) ? 吲哚乙酸(IAA,天然),奈乙酸(NAA),二氯苯氧乙酸(2,4-D),吲哚丁酸(IBA),2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)。 ? 促进细胞分裂与根分化
? 2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力,但抑制器官分化
细胞分裂素(cytokinin) ? 激动素 (KT),6-苄基腺嘌呤(6-BA),玉米素 (ZT),异戊烯氨基嘌呤( 2IP) ? 刺激细胞分裂,诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高,抑制根的生长。 ? 细胞分裂素常与生长素相互配合,用以调节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化和器官形成。
细胞分裂素主要作用:促进细胞分裂
细胞分裂素与生长素相互作用
? 生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”,决定着发育的方向。
? 当生长素含量高于细胞分裂素时,主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成 ? 当细胞分裂素的效应高于生长素时,主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。
生长素含量高于细胞分裂素
2,4-D 1mg∕L +6-BA 0.1mg∕L
生长素含量低于细胞分裂素
赤霉素(gibberelin acid) ? GA3
? 促进细胞生长
? 刺激不定胚发育成正常小植株
病苗细长,叶色淡绿,比健苗高,病株节间伸长,茎节上逆生不定根,茎杆逐渐变褐,腐烂,其内有白色蜘蛛丝状菌丝。
将赤霉菌培养基的滤液喷洒稻健康水稻幼苗上不感染赤霉菌,却有恶苗病的症状。 1935年科学家从培养基滤液中分离出赤霉素(GA)
GA3诱导甘蓝茎的伸长 ,产生超长茎 GA3 对矮生型豌豆的效应对照
主要作用
促进细胞伸长 促进种子萌发
果实发育 合成部位
幼叶、幼芽、幼根、未成熟的种子
乙烯在常温下是气体。作为生长调节剂用的是乙烯利。 促进果实着色和成熟
乙烯(ethylene)
? 对芽的诱导具有一定作用
? 在生理环境的温度和压力下,是一种气体,比空气轻,实验中很难掌握用量,所以一般
不使用
? 培养的植物组织也会产生乙烯,如果封口用的是不透气的塑料膜,容器内就会逐渐积累
乙烯,严重时可引起培养物的死亡 ? AgNO3可逆转乙烯的抑制作用
(5)附加组分
? 活性炭 ? 渗压剂 ? 硝酸银 ? 抗生素 ? 凝固剂
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