分子标记辅助选择 - 图文

第十七章 分子标记辅助选择育种

传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。

育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选

择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。

第一节 分子标记的类型和作用原理

一、分子标记的类型和特点

按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×10拷贝。按照PCR所需引物类型

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又可分为：①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记(Random别amplification polymorphism DNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标记(1nter-simple sequence repeats polymorphisms，ISSR)等技术；②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3'端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记(Simple sequence repeats，SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术)和序标位(Sequence—tagged sites，简称STS)等。第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。表达序列标签(Expressed sequences tags，EST)是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序(Singlepass sequence)而产生的300～500bp的核苷酸片段。

应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表17—1。

分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不是太高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 二、分子标记的原理和遗传特性

(一)RFLP

发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在20世纪70年代已被发现。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。目前，该技术已广泛用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记等。

1．RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插人、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，

用放射性同位素(如

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P)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的

DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的

探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况(图17—2)。

对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。

RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。

2．RFLP标记的特点 RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F，中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。

RFLP标记所需DNA量大(5～15鹏)，检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素(通常为少')，易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于育种上利用。 (二)RAPD标记

1．RAPD标记的原理 Williams等(1990)以DNA聚合酶链式反应为基础而提出的。所谓RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为10个核苷酸)通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。RAPD标记的原理同PCR技术，但又有别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：·①引物。常规的PCR反应所用的是一对引物，长度通常为20bp(碱基对)左右；RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp。②反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般为55—60℃，而RAPD的复性温度仅为36℃左右。③扩增产物。常规PCR产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核

苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。

原理上与RAPD相似的还有AP—PCR(Arbitrarily primed polymerae chain reaction)。AP—PCR指在PCR反应中使用的引物长度与一般PCR反应中的引物相当，但在反应开始阶段退火温度较低，允许大量错配，因此可引发随机的扩增。一般在AP—PCR反应中应用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影，检测其多态性。

2．RAPD标记的特点 如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。若PCR产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标记，通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。RAPD标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性标记指的是F1的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为“有／无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。

RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种

质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。因此RAPD也是一种潜力很大的分子标记。

由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探针制备、同位素标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。RAPD分析所需DNA样品量少(一般5～10ng)，对DNA质量要求较RFLP低。同时，RAPD标记还可转化为RFLP探针，SCAR及STS等表现为共显性和显性的分子标记。

RAPD最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg浓度等。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。 3．SCAR标记 在RAPD技术的基础上，1993年，Paran等提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。它的基本原理是： 目标DNA经RAPD分析后，将RAPD多态片段克隆一对克隆片段两端测序一根据测序结果设计长为18～24bp的引物，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段，由于Taq酶可使PCR产物3，末端带上A尾巴，人工设计的克隆载体5，末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物，PCR扩增，检测是否还能扩增出

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原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。 (三)AFLP

它是荷兰Keygene公司科学家Marc ＆ Pieter l993年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100—150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。

1．AFLP标记的原理 首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequent cutter)，另一种为酶切频率较低的酶(rare cutter)。用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易于扩增的，且可在测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA片段的数量。AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制内切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。将酶切片段和含有与其黏性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1～3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP的原理示意图见图17—3。AFLP分析的基本步骤可以概括为：

(1)将基因组DNA同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，在这些DNA片段两端连接上特定的寡核苷酸接头(oligo nucleotide adapters)。

(2)通过接头序列和PCR引物3'末端的识别，对限制性片段进行选择扩增。一般PCR引物用同位素P或P标记。 (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。 (4)将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理。

(5)在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。

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为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。

2.AFLP标记的特点 AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。

AFLP多态性远远超过其他分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50—100条AFLP扩增产物，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。

AFLP标记多数具有共显性表达、无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。

该技术受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格较贵，分析成本高；对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这也是它的不足之处。 (四)SSR

1987年，Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，他们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR(Variable量number tande repeat)。VNTR标记包括小卫星(minisatellites)和微卫星(mierosatellites)标记两种。微卫星标记，即SSR标记，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置(图17—4A)。如(CA)n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重复，其中n代表重复次数，其大小在10～60之间。这类序列的重复长度具有高度

变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组研究。目前植物SSR研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已明确在植物核基因组中，各种SSR数量从大到小依次为(AT)n、An、Tn、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTI)n、(AC)n、(GT)n等。

1．SSR标记的原理 尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。

建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般程序(图17—4A)如下：①建立基因组DNA的质粒文库；②根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲获得(AT)I／(TA)nSSR则可合成G(AT)n作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆；③对阳性克隆DNA插人序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；⑥高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。

目前，SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制及品种纯度检测，以及目标性状基因标记等领域。特别在人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，已成为取代RFLP标记的第二代分子标记。

2．SSR标记的特点 SSR的检测是依据其两侧特定的引物进行PCR扩增，因此是基于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳它可检测出单拷贝差异。它兼具PCR反应的优点，所需DNA样品量少，对DNA质量要求不太高。

使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。这可以在其他种的DNA数据库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，因此微卫星标记的开发成本高。

3．ISSR标记 在SSR标记的基础上开发的ISSR(inter-simple sequence repeat polymorphicDNA)分子标记是用两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间单拷贝序列，通过电泳检测其扩增产物的多态性。引物设计采用二个核苷酸、三个核苷酸或四个核苷酸序列为基元(motifs)，以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物，从而保证引物与基因组DNA中SSR的5'或3'末端结合，通过PCR反应扩增两个SSR之间的DNA片段。如(AC)nX，(TG)nX，(ATG)nX，(CTC)nX，(GAA)nX等(X代表非重复的锚定碱基)。Naganka等(1997)已

在小麦的ISSR标记研究中发现ISSR标记可获得数倍于RAPD标记的信息量。由于ISSR标记不像RFLP标记一样步骤繁琐，且不需同位素标记，因此，针对重复序列含量高的物种，利用ISSR法可与RFLP，RAPD等分子标记相媲美。它对填充遗传连锁图上大的不饱和区段，富集有用的理想标记具有重要意义。

(五)其他标记

1．CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence—tagged sites) CAPs技术又称为PCR—RFLP。用特异设计的PCR引物扩增目

标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很小，以至无多态性出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性(Akopyanz等，1992)。其基本步骤是：先利用特定引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，溴化乙锭(EB)染色，观察其多态性。与RFLP技术一样，CAPs技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。Talbert等(1994)在小麦中将RFLP标记转化为STS标记过程中，有些STS标记无多态，但酶切后又出现多态性。CAPs作为一种分子标记，有以下几个优点：①引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析。②在真核生物中，CAPs标记呈共显性。③所需DNA量少。④结果稳定可靠。⑤操作简便、快捷、自动化程度高。CAPs标记最成功的应用是构建拟南芥遗传图谱。Konieczny等(1993)将RFLP探针两端测序，合成PCR引物，在拟南芥基因组DNA中进行扩增，之后用一系列4碱基识别序列的限制性内切酶酶切扩增产物，产生了很多CAPs标记，并且只用了28个巧植株，就将这些CAPs标记定位在各染色体上并构建了遗传图谱。I-tittalmani(1995)等找到了一个抗稻瘟病基因Pi—2(t)的CAPs标记。总之，CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。但在多倍体植物中的应用有一定局性。另外，CAPs标记需使用内切酶，这又增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。

2．STS(Sequence—tagged sites) STS是序列标签位点或序标位的简称。它是指基因组中长度为200～500bp，且核苷酸／顷序已

知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。1989年，华盛顿大学的Olson等人利用STS单拷贝序列作为染色体特异的界标(Landmark)，即利用不同STS的排列顺序和它们之间的间隔距离构成STS图谱，作为该物种的染色体框架图(Framework map)，它对基因组研究和新基因的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。STS引物的获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列，微卫星序列。其中，最富信息和多态性的STS标记应该是扩增含有微卫星重复顺序的DNA区域所获得的STS标记。

迄今为止，STS引物的设计主要依据单拷贝的RFLP探针，根据已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增。与RFLP相比，STS标记最大的优势在于不需要保存探针克隆等活体物质，只需从有关数据库中调出其相关信息即可。最近，随着人类基因组研究的深入，表达序列标定(expressed sequence tags，ESTs)应运而生。由于它直接与一个表达基因相关，很易于转变成STS。

STS标记表现共显性遗传，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介，它的实用价值很具吸引力。但是，与SSR标记一样，STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，目前仍显成本太高。目前，国际上已开始收集STS信息，并建立起相应的信息库，以便于各国同行随时调用。

第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术

MAS育种不仅可以通过与目标基因紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进行选择，同时，也可以利用分子标记对轮回亲本的背景进行选择。目标基因的标记筛选(gene taggmg)是进行MAS育种的基础。用于MAS育种的分子标记需具备3个条件：①分子标记与目标基因紧密连锁(最好lcM或更小，或共分离)；②标记适用性强，重复性好，而且能经济简便地检测大量个体(当前以PCR为基础)；③不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。

一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记

通过建立分子遗传图谱，可同时对许多重要农艺性状基因进行标记。许多农作物上已构建了以分子标记为基础的遗传图谱。这些图谱在重要农艺性状基因的标记和定位、基因的图位克隆、比较作图以及MAS育种等方面都是非常有意义的。但是由于分子标记数目的限制，目前作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较少，这样使遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记筛选割裂开来。因此，根据育种目标选用两个特殊栽培品种作为亲本来构建作物的品种——品种图谱，将作物图谱构建和寻找与农艺性状基因紧密连锁的分子标记有机结合起来。

遗传作图的原理与经典连锁测验一致，即基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期Ⅰ非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组。用重组率来表示基因间的遗传距离，图距单位

用厘摩(centi—Morgan，cM)表示，一个cM的大小大致符合1％的重组率。遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反映DNA的实际长度。

遗传图谱构建的主要环节为：①根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体；②群体中不同植株的标记基因型分析；③借助计算机程序构建连锁群。因此，要构建好的遗传图谱，首先应选择合适的亲本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易程度，遗传图谱的准确性及所建图谱的适用性。亲本间的差异不宜过大，否则会降低后代的结实率及所建图谱的准确度。而亲本间适度的差异范围因不同物种而异，通常多态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂交亲本，而多态性低的自交作物则需选择不同种间或亚种间品种作杂交亲本。如玉米的多态性极好，一般品种间配制的群体就可成为理想的分子标记作图群体，而番茄的多态性较差，因而选用不同种间的后代构建分子标记作图群体。

用于分子标记的遗传作图群体一般分为两类，一类为暂时性分离群体，包括F2群体、BC等；另一类为加倍单倍体(doubled hap㈤d，DHL)和重组近交系(recombinant lnbred Lines，RIL)等永久性分离群体。自花授粉作物与异花授粉作物作图群体的构建方法如图17—5所示。

它们的特点见表17—2。F2群体构建比较省时。但由于每个F2单株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了该群体的作图能力。BC群体是由F1与亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较为简单，但提供的信息量少于F2群体，且可供作图的材料有限，不能多代使用。若通过远缘杂交构建的F2作图群体，易发生向两极疯狂分离，标记比例易偏离3：1或1：2：1。第二类为永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等。RIL群体是由F2经多代自交一粒传(Single seed descendant，简称SSD)使后代基因组相对纯合的群体。RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同实验室的协同研究，而且作图的准确度更高。缺点是建立RIL群体相当费时，而且有的物种很难产生RIL群体。DH群体是通过对Fl进行花药离体培养或通过特殊技术(如棉花的半配生殖材料)得到单倍体植株后代，再经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体。因此DH群体也能够长期保存。但构建DH群体需深厚的组织培养基础和染色体加倍技术。与暂时性群体相比，永久性群体至少有两方面长处：①群体中各品系的

遗传组成相对固定，可以通过种子繁殖代代相传，不断地增加新的遗传标记，并可在不同的研究小组之间共享信息；②可以对性状的鉴定进行重复试验以得到可靠的结果。这对于某些病害的抗性鉴定以及受多基因控制且易受环境影响的数量性状的分析尤为重要。

许多重要的农艺性状，如抗病性、抗虫性、育性、一些抗逆性(抗盐、抗旱)等都表现为质量性状遗传的特点。由于这些性状只受单基因或少数几个主基因控制，一般均有显隐性，在分离世代无法通过表型来识别目的基因位点是纯合还是杂合，在几对基因作用相同时(如一些抗病基因对病菌的不同生理小种反应不同)，无法识别哪些基因在起作用。特别是一些质量性状虽然受少数主基因控制，但其中许多性状的表现还受遗传背景，微效基因以及环境条件的影响。所以利用分子标记技术来定位、识别质量性状基因，特别是利用分子标记对一些易受环境影响的抗性基因的选择就变得相对简单。

二、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记

近等基因系(NIL)是Young等人最早提出来的。近等基因系的培育主要是通过多次的定向回交，它与原来的轮回亲本就构成了一对近等基因系(图6—1)。在回交导人目标性状基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将随之进入回交子代中(图17—6)。NIL作图的基本思路是鉴别位于导人的目标基因附近连锁区内的分子标记，借助于分子标记定位目标基因。利用这样的品系可在不需要完整遗传图谱的情况下，先用一对近等基因系筛选与目标基因连锁的分子标记，再用近等基因系间

的杂交分离群体进行标记与目的基因连锁的验证，从而筛选出与目标基因连锁的分子标记。Param等1991年运用212个随机引物对莴苣抗感霜霉病(Dm)的近等基因系进行了RAPD分析，将4个RAPD标记定位在Dml和Dm3连锁区域，6个定位在Dmll连锁区。用近等基因系方法，还筛选出燕麦锈病，大麦茎锈斑病，小麦的腥黑穗病，番茄的线虫、花叶病毒，烟草的黑根瘤等抗性基因以及很多其他的目标基因的分子标记。

三、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记

近等基因系的基因作图效率很高，但一个近等基因系的培育耗费时间长，既费工又费时，另外，许多植物很难建造其近等基因系，如一些林木植物既无可利用的遗传图谱，又对其系谱了解很少，几乎不可能创造近等基因系。1991年，Michelmore等提出了群体分离分析法(Bulked segregant analysis，BSA)，为快速、高效筛选重要农艺性状基因的分子标记打下了基础。下面以某一抗病基因为例说明构建BSA群体的方法。用某一作物的抗病品种与感病品种杂交，F2抗病基因发生分离。依抗病性表现将分离群体植株分为2组，1组为抗病的，另1组为感病的。然后分别从两组中选出5～10株抗、感极端类型的植株提取DNA，等量混合构成抗、感DNA池。对这两个混合DNA池进行多态性分析，筛选出有多态性差异的标记，再分析F2所有的分离单株，以验证该标记与目标性状基因的连锁关系以及连锁的紧密程度。NIL和BSA分析方法见图17—6。

利用BSA法，Michelmore等(1991)从100个随机引物中筛选到3个与莴苣Dm5／8基因连锁，且遗传距离在15cM内的分子标记。Giovannoni等通过已知的RFLP遗传图谱，选择不同的RFLP基因型建立DNA混合库，筛选出与西红柿果实成熟及茎蒂脱落基因连锁的RAPD标记。目前，利用该法已广泛用于主要农作物重要农艺性状基因连锁的分子标记筛选。

四、数量性状基因的定位

产量、成熟期、品质、抗旱性等大多数重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点。影响这类性状的表型差异由多个基因位点(数量性状位点，QTL)和环境共同决定，子代常常发生超亲分离。筛选与多基因控制的数量性状基因连锁的分子标记要比筛选主基因控制的质量性状复杂得多。

用于QTL分析的群体最好是永久性群体，如重组近交系和加倍单倍体群体。

永久性群体中各品系的遗传组成相对稳定，可通过种子繁殖代代相传，并可对目标性状或易受环境因素影响的性状进行重复鉴定以得到更为可靠的结果。从数量性状遗传分析的角度讲，永久性群体中各品系基因纯合，排除了基因间的显性效应，不仅是研究控制数量性状基因的加性、上位性及连锁关系的理想材料，同时也可在多个环境和季节中研究数量性状的基因型与环境互作关系。

永久性群体培育费用高，因此QTL的标记与定位也有用暂时性分离群体。开始时，分离群体用单标记分析方法进行QTL的定位。例如，在一个P2群体，给予任何一个特定的标记M，如果所有MiMl同质个体的表型平均值高于M2M2同质个体，那么就可以推断存在一个QTL与这个标记连锁。如果显著水平设置太低，这种方法的假阳性高。此外，QTl不一定与任一给定的标记等位，尽管它与最近的标记之间具有很强的联系，但它的准确位置和它的效应还不能确定。

区间作图的引入，克服了上述许多问题。它沿着染色体对相邻标记区间逐个进行扫描，确定每个区间任一特定位置的QTL的似然轮廓。更准确地说，是确定是否存在一个QTL的似然比的对数(Lander ＆Bostien，1989)。在似然轮廓图中，那些超过特定显著水平的最大值处，表明是存在QTL的可能位置。显著水平必须调整到避免来自多重测验的假阳性，置信区间为相对于顶峰两边各1个LOD值的距离。它一直是应用最广的一种方法，特别是它应用于自交衍生的群体。其软件Mapmaker／QTL(White—headlnstitute，1993)是免费提供的。尽管已对该方法进行过许多精度和效率的研究，但都没有产生重要的修改。

第2种方法是Haley ＆ Knott(1992)发展的多元回归分析法。该方法相对LOD作图而言，在精度和准确度上与区间作图产生非常相似的结果，它具有程序简单、计算快速的优点，适合于处理复杂的后代和模型中包含广泛的固定效应的情形。例如，性别的不同和环境的不同。显著性测验和置信区间估计可利用Bootstrapping抽样方法(Visscher et al，1996；Lebreton ＆ Visscher，1998)。

第3种方法是同时用一个给定的染色体上的所有标记进行回归模型分析，利用加权最小平方和法或者模拟进行显著性测验

(Kearsey ＆ Hyne，1994)。它具有计算速度快和在一个测验中利用所有标记信息的优点。如果一条染色体上只有一个QTL，所有定位和测定标记两侧之间的QTL效应的必要信息都可以利用。尽管你确实不知道哪些标记在QTL两侧或者每条染色体上只有一个QTL，不论QTL怎样在染色体上分布，多重标记方法确实提供了模型的整个测

第三节 作物MAS育种

一、作物MAS育种需具备的条件

利用分子标记进行MAS育种可显著提高育种效率。但是要开展MAS育种，必须具备如下条件：①分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM，最好lcM或更小。②具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，目前，主要应用自动化程度高，相对易于分析，且成本较小的PCR技术。③筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。④应有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。

由单基因或寡基因控制的质量性状的分子标记，易于用于MAS育种。对大多数数量性状遗传的重要农艺性状，若想利用MAS育种则必须具有精确的QTL图谱。这不仅需要将复杂的性状利用合适软件分成多个QTLs，并将各个QTL标记定位于合适的遗传图谱上，而且还与是否有对该数量性状表型进行准确检测的方法，用于作图的群体大小、可重复性、环境影响和不同遗传背景的影响，以及是否有合适的数量遗传分析

方法等有关。这为筛选某一复杂农艺性状的QTL标记提出了更高要求，也增加了MAS付诸育种实践的难度。

二、MAS育种方法

筛选与质量性状基因紧密连锁的分子标记用于辅助育种，可免受环境条件影响。Deal等(1995)将普通小麦4D长臂上的抗盐基因转移到硬粒小麦4B染色体上，利用与该抗盐基因连锁的分子标记进行选择，大大提高了选择效率。研究表明，在一个有100个个体数的回交后代群体中，借助100个RFLP标记选择，只需3代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的99．2％，而随机挑选则需要7代才能达到。利用MAS技术在快速基因垒集方面也表现出其巨大优越性，国际水稻所(1RRl)Mackill等(1992)已将抗稻瘟病基因Pi—1、Pi—Z、Pi—ta精确定位，并建立了分别具有这三个基因的等基因系。通过MAS聚合杂交获得3个抗稻瘟病基因垒集到一个材料中的个体。在水稻Rfl基因的MAS育种方面也已有成功报道。 (一)回交育种

由单基因或寡基因等质量性状基因控制的主要农艺性状，若利用分子标记辅助选择，主要应用回交育种分析方法。针对每一回交世代结合分子标记辅助选择，筛选出含目标基因的优异品系，进一步培育成新品种。若利用分子标记跟踪选择回交后代中的QTIj，常由于该数量性状在后代中处于分离状态的QTL数目增加，需扩大回交群体，以增加所

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有QTL的有利基因同时整合在一个个体中的机会。另一方面，对多个QTLs进行回交转育，可能会将较大比例的与这些QTL连锁的供体基因组片段同时转移到轮回亲本中去。因此，该法不是利用分子标记辅助育种选择QTL性状的最优方法。

在回交育种过程中，尤其是野生种做供体时，尽管一些有利基因成功导人，但同时也带来一些与目标基因连锁的一些不利基因，成为连锁累赘(Linkage drag)。利用与目标基因紧密连锁的分子标记可直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而避免了或显著减少了连锁累赘，加快了回交育种的进程。Young等研究发现，利用番茄高密度RFLP图谱对通过回交育种育成的抗病品种所含Lperu抗TMV的Tmv2渗入片段大小检测，最小4cM，最大超过51cM，可见常规育种对抗性基因附近的DNA大小选择效果不大；模拟结果显示，利用分子标记通过二次回交所缩短的渗入区段，在不用标记辅助时需100次回交才可达到同样效果。 1996年Tanksley提出了QTL定位和利用的AB分析方法(Advanced backcross analysis)策略，即利用野生种或远缘的材料与优良的品种杂交，再回交2～3代，利用分子标记同时发现和定位一些对产量或其他性状有重要贡献的主效QTls，这种方法已在番茄和水稻中被证实是行之有效的。例如，通过AB分析方法，发现O．rufipogon水稻野生种(图17—7)中有2个可显著提高我国杂交稻产量的QTIj。和原杂交稻相比，每个QTL可提高产量大约17％。而且这2个QTLs没有

与不良性状连锁，因此，他们有很大的利用潜力（Tanksley & McCouch，1997）。

(二)SIS—MAS(single large—scale MAS)

这是Ribant等(1999)提出的。基本原理是在一个随机杂交的混合大群体中，尽可能保证选择群体足够大，保证中选的植株在目标位点纯合，而在目标位点以外的其他基因位点上保持大的遗传多样性，最好仍呈孟德尔式分离。这样，分子标记筛选后，仍有很大遗传变异供育种家通过传统育种方法选择，产生新的品种和杂交种。这种方法对于质量性状或数量性状基因的MAS均适用。本方法可分为三步：

第1步：利用传统育种方法结合DNA指纹图谱选择用，于MAS的优异亲本，特别对于数量性状而言，不同亲本针对同一目标性状要具有不同的重要的QTL，即具有更多的等位基因多样性。

第2步：确定该重要农艺性状QTL标记。利用中选亲本与测验系杂交，将Fl自交产生分离群体，一般200～300株，结合F2：3单株株行田间调查结果，以确定主要QTL的分子标记。

表型数据必须是在不同地区种植获得，以消除环境互作对目标基因表达的影响。标记的QTL不受环境改变的影响，且占表型方差的最大值(即要求该数量性状位点必须对该目标性状贡献值大)。确定QTL标记的同时将中选的亲本间杂交，其后代再自交1～2次产生一个很大分离群体。

第3步：结合QTL标记的筛选，对上述分离群体中单株进行SLS—MAS。

第4步：根据中选位点选择目标材料，由于连锁累赘，除中选QTL标记附近外，其他位点保持很大的遗传多样性，通过中选单株自交，基于本地生态需要进行系统选择，育成新的优异品系，或将此与测验系杂交产生新杂种。若目标性状位点两边均有QTL标记，则可降低连锁累赘。

(三)MAS聚合育种

在实际育种工作中，通过聚合杂交将多个有利目标基因垒集到同一品种材料中，培育成一个具多种有利性状的品种，如多个抗性基因的品种，在作物抗病虫育种中保证品种对病虫害的持久抗性将有十分重要的作用。但是，由于导人的新基因表现常被预先存在的基因所掩盖或者

许多基因的表型相似难以区分、隐性基因需要测交检测、或接种条件要求很高等，导致许多抗性基因不一定在特定环境下表现出抗性，造成基于表型的抗性选择将无法进行。MAS可利用分子标记跟踪新的有利基因导人，将超过观测阈值外的有利基因高效地累积起来，为培育含有多抗、优质基因的品种提供了重要的途径。

利用MAS技术在快速垒集基因方面表现出巨大的优越性。农作物有许多基因的表现型是相同的，通过经典遗传育种研究无法区分不同基因效应，从而也就不易鉴定一个性状的产生是由于一个基因还是多个具有相同表型的基因的共同作用。借助分子标记，可以先在不同亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个品种中去，通过检测与不同基因连锁的分子标记有无来推断该个体是否含有相应的基因，以达到聚合选择的目的。

南京农业大学细胞遗传所与扬州农科所合作，借助于MAS完成了Pm4a+Pm2+Pm6、Pm2+Pm6+Pm21、Pm4a+Pm21等小麦白粉病抗性基因的聚合，从而拓宽了现有育种材料对白粉病的抗谱，提高了抗性的持久性。利用具有单个不同抗性基因的4个亲本，通过MAS三个世代即可获得同时具有四个抗性基因的个体。国际水稻所Mackill利用MAS对水稻稻瘟病抗性基因Pi—1、pi-z5、pi-ta进行累集，获得了抗两种或三种小种的品系。

利用RAPD与RFLP标记，Yoshimura等已将水稻白叶枯抗性基因Xal、Xa3、Xa4、Xa5与Xa10等基因进行了不同方式的聚合。在水稻中

已将含有抗白叶枯基因Xa21的材料与抗虫基因材料杂交，利用Xa21的STS标记获得了同时具有Xa2，和抗虫基因的材料旷通常应用MAS聚合不同基因时，F2分离群体大小应以200～500株为宜，先对易操作的分子标记进行初选，再进行复杂的RFLP验证，可提高聚合效率。

随着育种目标的多样性，为了选育出集高产、优质、抗病虫等优良性状于一身的作物新品种，应考虑目标性状标记筛选时亲本选择的代表性，即最好选择与育种直接有关的亲本材料，所构建群体也最好既是遗传研究群体，又是育种群体，在此基础上，多个目标性状的聚合需通过群体改良的方法实现。不容置疑，分子标记技术赋予了群体改良新的内涵，借助于分子标记技术可快速获得集多个目标农艺性状于一身的作物新品种。

南京农业大学棉花研究所在多目标性状聚合的修饰回交方法育种的基础上，提出了MAS的修饰回交聚合育种方法。修饰回交是将杂种品系间杂交和回交相结合的一种方法，即回交品系间的杂交法。将各具不同优良性状的杂交组合分别和同一轮回亲本进行回交，获得各具特点的回交品系，再把不同回交品系进行杂交聚合。目前利用分子标记技术可对目标性状进行前景选择，对轮回亲本的遗传背景进行背景选择，就可以达到快速打破目标性状间的负相关，获得聚合多个目标性状新品系的目的(图17—8)。

三、提高分子标记的筛选效率 (一)多重PCR方法

为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件下同时反应，这称为多重扩增。利用这种方法时需注意，设计或选择引物时，必须考虑各引物复性温度是否相匹配，且在扩增产物的大小上无重叠。研究表明，多重扩增使用Taq酶量与一个引物扩增用量相同。这显著地降低了选择成本费用和筛选时间。如Ribaut等将筛选到的与热带玉米抗旱基因QTL连锁的1个STS，2个SSR标记使用多重扩增方法用于MAS选择，以改良其耐旱性，两人仅用了一个月就从BC2F1的2300个单株中选出300个目标单株。

(二)用相斥相分子标记进行育种选择

所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。这些选择特别在一些显性标记如RAPD标记中，效果较为显著。Haley等(1994)找到与菜豆普通花叶病毒隐性抗病基因bc—3连锁的两个RAPD标记，其中标记—1与bc—3相引，距离为1．9cM；标记—2与bc—3相斥，距离为7．1cM。用标记—1选择的纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占26．3％，72．5％和1．2％。而用标记—2选择的结果分别是81．8％，18．2％和0。当将两个标记同时使用时，即相当于一个共显性标记。其选择效果与单独使用标记—2的选择效果一致。一般认为，在育种早代选择中，利用相斥相的RAPD标记，与共显性的RFLP标记具有相似的选择效果。 (三)克服连锁累赘

回交育种是作物育种常用的育种方法，但回交育种中长期存在的问题是在回交过程中，目的基因与其附近的非目的基因存在连锁，一起导人受体，这种现象称为连锁累赘(Linkage drag)。利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以显著地减轻连锁累赘的程度。如在大约150个回交后代中，至少有一个植株在其目的基因左侧或右侧lcM范围内发生一次交换的可能性为95％，利用RFLP标记可以精确地选择出这些个体；在另一个有300个植株的回交群体中，有95％的可能在被选择基因另一侧lcM范围内发生一次交换，从而产生目的基因大于

2cM的片段。这个结果用RFLP选择只需2个世代就能够得到；而传统的方法可能平均需要100代。随着分子标记图谱的更加密集，选择重组个体的效率将进一步提高。因此，高密度的作物分子遗传图谱的构建是加速作物育种进程所必需的。 (四)降低MAS育种的成本

进行MAS，首先是需把与目标基因(性状)紧密连锁(或共分离)的分子标记如RFLP、RAPD等转化为PCR检测的标记。然后设法降低PCR筛选成本。可从以下几方面考虑：

①样品DNA提取。采用微量提取法如利用小量组织或半粒种子且不需液氮处理的DNA提取技术。且在提取过程中不利用特殊化学药品，降低提取缓冲液成本。

②减少PCR反应时的体积。如反应时的体积从25μ1减到15μ1甚至10μ1。

③琼脂糖(Agrose)凝胶：实验表明同一Agrose胶可以多次电泳载样，而不会造成样品间互相干扰。

④扩增产物检测：通常PCR扩增产物用EB染色，LTV观测，使用Polaroid film照相系统。利用这种观测方法，不仅有致癌诱导剂，而且UV射线对眼睛损害很大，照相系统花费也很高。通过改造染色系统，利用美蓝又称亚甲蓝、甲烯蓝(Methylene blue)染琼脂糖凝胶，

可直接在可见光下检测。甚至若PCR扩增产物仅一种，则无需电泳，只需在反应管中加入EB，紫外灯下直接根据反应即可鉴定出目标基因型，大大降低了标记辅助选择成本，非常有利于大规模育种。这在中国春小麦Phlb基因的SCAR标记筛选上已有成功尝试。

近十年多来，分子标记的研究已经得到快速发展，在许多作物中已定位了很多重要性状的基因，但育成品系或品种的报道还相对较少。究其原因主要有：①标记信息的丢失。标记仍然存在，但由于重组使标记与基因分离，导致选择偏离方向；②QTL定位和效应估算的不精确性；③上位性的存在，由于QTL与环境、QTL与QTL间存在互作，导致不同环境、不同背景下选择效率发生偏差；④标记鉴定技术有待进一步提高。尽管近年来标记鉴定技术在实用性及降低成本方面都得到了很大发展，但对于大多数实验室来说，MAS还是一项费时耗资的工作。尽管目前MAS的成功应用还存在诸多困难，但MAS在未来作物育种中的作用是毋庸置疑的。相信在不久的将来，随着分子生物技术的进一步发展以及各种作物图谱的日趋饱和，MAS会发挥它应有的作用。

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