2019高考生物大二轮复习专题十六基因工程和细胞工程学案

专题十六 基因工程和细胞工程

考点 考情 1．近五年的全国卷高考试题中对于基因工程的考查频度较高，侧重考查操作工具的种类、功能以及操作基本程序的应用等。动物细胞工程技术中的核移植技术及单克隆抗体的制备也有所考查。 2．题目常借助简洁的文字材料或模式图1．基因工程的诞生(Ⅰ) 2．基因工程的原理及技术(含PCR)(Ⅱ) 3．基因工程的应用(Ⅱ) 4．蛋白质工程(Ⅰ) 5．植物的组织培养(Ⅱ) 6．动物的细胞培养与体细胞克隆(Ⅰ) 7．细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ) 等考查有关基因工程、动物细胞工程的原理、技术手段等，尤为注重对教材中一些关键词的填充及对结论性语句的准确表述等。 3．备考时，应从以下四个方面入手复习： (1)列表比较法掌握限制酶、DNA连接酶和运载体的作用。 (2)实例分析法理解基因工程的原理和过程。 (3)列表比较法理解两个不同，即植物组织培养和动物细胞培养的不同、植物体细胞杂交与动物细胞融合的不同。 (4)图解法分析并掌握单克隆抗体制备过程。

Hexinpanduan

核心判断

(1)质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的很小的环状DNA分子。(√)

(2)DNA分子经限制酶切割后产生的DNA片段末端一定是黏性末端。(×)

(3)基因表达载体组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。(√) (4)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。(√)

(5)基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程则可对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。(√)

(6)微型繁殖技术既能保持优良品种的遗传特性，还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。(√)

(7)动物细胞培养中需用胃蛋白酶或胶原蛋白酶将组织细胞分散成单个细胞。(×) (8)原代培养的细胞遗传物质没有改变，而传代培养的细胞有的已经发生突变，获得了不死性。(√)

(9)动物体细胞核移植技术获得的克隆动物在遗传性状上与供核母体完全一致。(×) (10)动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术类似，也可获得杂种动物。(×)

考向一 基因工程

Zhentihuifang

真题回放

1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：

(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了__体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达__(答出两点即可)。

(2)体外重组的质粒可通过Ca参与的__转化__方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与__外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)__组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是__细菌__。

(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__蛋白酶缺陷型__的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加__蛋白酶__的抑制剂。

[解析] (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。

(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将

2＋

2＋

体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。

(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。

2．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：

(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A__。

(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__噬菌体__作为载体，其原因是__噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕__。

(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__繁殖快、容易培养__(答出两点即可)等优点。

(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是__蛋白A的抗体__(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。

(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是__DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体__。

[解析] (1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原——抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。

3．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：

(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__嫩叶组织细胞易破碎__。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__防止RNA降解__。

(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是__在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA__。

(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子__(答出两点即可)。

(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__磷酸二酯键__。

(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是__目的基因的转录或翻译异常__。

[解析] (1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是相对于老叶而言嫩叶组织细胞更容易被破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需启动子。(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。

4．(2017·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：

(1)先要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是__编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子__。

(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为__模板__，加入了__dNTP__作为合成DNA的原料。

(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。

①由图2可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__进行细胞传代培养__。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__维持培养液的pH__。

②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少__C__(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效

果。

[解析] (1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、dNTP作为原料。(3)T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。

Hexinzhishi

核心知识

1．理清基因工程3种操作工具的作用与特点 项目 作用 限制酶 切割__目的基因和运载体__ DNA连接酶 拼接DNA片段，形成__重组DNA分子__ 运载体 携带目的基因进入__受体细胞__ ①能在宿主细胞内稳定存在并大量__复制__； ②有一个至多个__限制酶切割位点__； ③具有特殊的__标记基因__ 作用部位 两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键 ① E·coliDNA ①识别特定的核苷酸连接酶只能连接黏性末端； ②__T4DNA__连接酶能连接黏性末端和平末端 作用特 点(条件) 序列； ②在特定位点上切割DNA分子 2．掌握获取目的基因的3种途径 (1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从__基因文库__中获取。 (2)人工合成目的基因(常用方法如下)

①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用__DNA合成仪__用化学方法合成，不需要模板。

②人工合成法：以__RNA__为模板，在__逆转录酶__的作用下人工合成。 (3)利用__PCR__技术扩增。 3．牢记基因表达载体的构建

(1)基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋__标记基因__＋复制原点。 (2)启动子和终止子：启动子是__RNA聚合酶__识别和结合的部位，启动转录；终止子是__终止转录__的位点。

(3)基因表达载体的构建过程

4．将目的基因导入受体细胞 生物种类 常用方法 受体细胞 植物细胞 __农杆菌转化__法、基因枪法、花粉管通道法等 体细胞 动物细胞 __显微注射__技术 受精卵 微生物细胞 __感受态细胞__法(Ca处理法) 原核细胞 2＋5．理清目的基因的检测与鉴定 (1)导入检测：__DNA分子__杂交技术(使用DNA探针) 转录检测：__分子杂交__技术检测mRNA??

(2)表达检测?翻译检测：用相应的抗体进行

?? __抗原—抗体__杂交

(3)个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。

Tixingtupo

题型突破

题型1 基因工程的操作工具和流程

1．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Amp或Tet中会导致相应的基因失活(Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Tet表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

r

t

r

t

(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__能自我复制、具有标记基因__(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长__；并且__含有质粒载体__和__含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)__的细胞也是不能区分的，其原因是__二者均含有氨苄青霉素抗性基

因，在该培养基上均能生长__。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__四环素__的固体培养基。

(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为运载体，其DNA复制所需的原料来自于__受体细胞__。

[解析] (1)作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，并含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。由题图可知，用BamHI切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。

2．(2018·河北省衡水中学一模)转基因抗病香蕉的培育过程如图1所示，图2表示PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。请据图回答下列问题：

(1)质粒的化学本质是__DNA__。

(2)利用基因工程培育转基因抗病香蕉的核心步骤是形成重组质粒，即__基因表达载体的构建__；将目的基因导入受体细胞的方式是__农杆菌转化法__。

(3)将抗病基因从含抗病基因的DNA中切割下来，使用的限制酶是__PstⅠ和EcoRⅠ__，一个质粒被限制酶PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ同时切割后得到的DNA片段和黏性末端分别为__3、—GGGCCC—3__个。单独用ApaⅠ切割质粒后的片段是__和__。

—CCCGGG—

(4)转基因抗病香蕉的培育发生了__基因重组__(变异类型)。卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，根据这一原理可利用含卡那霉素的培养基筛选已导入重组质粒的香蕉细胞。由此推断，重组质粒中应含有__卡那霉素抗性__基因作为标记基因。

[解析] (1)质粒是一种小型的环状DNA分子。(2)基因工程的操作分四个步骤，其中构建目的基因的表达载体是核心步骤。图中将B的基因导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。(3)从图1中的目的基因的三种限制酶的切割位点可以看出，不能使用SmaⅠ，否则会破坏目的基因的结构，只有利用另外两种限制酶才能将目的基因切割下来。用三种限制酶切割环

状DNA，能得到3个DNA片段和3个黏性末端。根据图2中的ApaⅠ识别的碱基序列及切割—GGGCCC—

位点可知，该酶切割质粒后得到的黏性末端是和。

—CCCGGG—

(4)基因工程的原理是基因重组，利用含卡那霉素的培养基能筛选出抗卡那霉素的细胞，由此可以推断重组质粒中的标记基因是卡那霉素抗性基因。

易错警示

有关基因工程概念及其工具的8个错混点

(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。

(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

(3)在切割目的基因和运载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的运载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的运载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。 题型2 基因工程在生产科技中的应用

3．(2018·河北衡水中学一模)科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答下列问题。

(1)在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因)，并采用__PCR(聚合酶链式反应)__技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是__引物__、酶、原料、模板，该技术必须用__耐高温的DNA聚合或热稳定DNA聚合__酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外，还需具有__标记基因__。

(2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ酶切割，原因是__SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因__。图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用__BamHⅠ和HindⅢ__酶对外源DNA、质粒进行切割。

(3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的__抗盐基因(或目

的基因)__作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是__将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态__。

4．(2018·东北三省三校高考生物一模)马铃薯是重要的经济作物，在基因育种方面取得丰硕成果。

(1)马铃薯是双子叶植物，常用__农杆菌转化__方法将目的基因导入马铃薯体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有：目的基因、__启动子__、__终止子__、__标记基因__、复制原点五部分。

(2)马铃薯易患多种疾病，导致产量下降。基因工程中常用的抗病基因为__病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、抗毒素合成基因、几丁质酶基因__(写一种即可)。

(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，主要从两个方面进行设计：

①修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂__不敏感(抵抗)__，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。

②引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前__被降解(分解)不敏感(抵抗)__。 (4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行__检测和鉴定__。

[解析] (1)马铃薯是双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入双子叶植物体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点五部分。(2)基因工程中常用的抗病基因为病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、抗毒素合成基因、几丁质酶基因。(3)①除草剂只能作用于杂草，不能作用于马铃薯，因此需要修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感(抵抗)，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。②也可以引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前被降解(分解)。(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行检测和鉴定。

易错警示

有关基因工程操作过程的4个错混点

(1)基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。

(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。

(3)标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。

(4)受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养培养成新个体)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。

考向二 细胞工程

Zhentihuifang

真题回放

1．(2018·全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对

非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：

(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指__将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中__。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目__不变__(填“减半”“加倍”或“不变”)。

(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度__小于__(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是__胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易__。

(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目__相同__(填“相同”或“不同”)，性染色体组合__不同__(填“相同”或“不同”)。

[解析] (1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。重组细胞形成的早期胚胎可移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞的染色体数目与提供细胞核的个体的体细胞相同。

(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。

(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。

2．(2014·全国卷Ⅰ)某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图所示。

若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。

回答下列问题：

(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16000以上，则小鼠最少需要经过__4__次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是__Y__小鼠，理由是__Y小鼠的血清抗体效价最高__。

(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有

__B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞__，体系中出现多种类型细胞的原因是__细胞融合是随机的，且融合率达不到100%__。

(3)杂交瘤细胞中有__1__个细胞核，染色体数目最多是__100__条。

(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是__不能无限增殖__。 [解析] 本题考查杂交瘤细胞的制备过程和特性。(1)据图分析，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗体效价均达到16000以上，小鼠Y的B淋巴细胞产生抗体效价最高，最适用于制备单克隆抗体。(2)融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外，还有骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的自身融合产物；由于细胞融合具有随机性，故体系中会出现多种类型的细胞。(3)杂交瘤细胞形成后，由于核膜具有流动性，小鼠的免疫B淋巴细胞核与其骨髓瘤细胞核会融合形成一个杂交的细胞核，正常情况下融合后的细胞核中的染色体数目为100条。(4)未融合的B淋巴细胞在不发生突变的情况下经过多次分裂后会衰老死亡，不能无限增殖。

Hexinzhishi

核心知识

1．理清3种细胞的区别

(1)杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去掉细胞壁之后形成的__原生质体__融合，融合的原生质体出现细胞壁之后形成的细胞叫杂种细胞。

(2)重组细胞：__体__细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。 (3)杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。 2．关注植物体细胞杂交与动物细胞融合的4个易错点

(1)植物体细胞杂交与动物细胞融合中酶的作用对象不同，__纤维素酶__和果胶酶作用于细胞壁，而__胰蛋白酶__等作用于细胞间的蛋白质。

(2)灭活的病毒保持了其抗原性，但毒性消失。

(3)植物杂交细胞在激素诱导下能表达出全能性，但动物杂交细胞的全能性不能表达。 (4)克隆动物的起点是经过核__移植__后形成的__重组__细胞，其遗传物质主要来自供体，因此形成的个体性状主要同供体，但也有部分性状同受体。

3．规避克隆动物与试管动物的3个误区

(1)误区一：试管动物与克隆动物的产生都是无性生殖。纠正：试管动物的产生是__有性__生殖，克隆动物的产生是__无性__生殖。

(2)误区二：试管动物(哺乳类)的产生是在__体外__进行的，克隆动物(哺乳类)的产生是在__体内__进行的。纠正：试管动物(哺乳类)和克隆动物(哺乳类)早期胚胎之前都是在体外进行的，早期胚胎经过__胚胎移植__之后是在体内进行的。

(3)误区三：胚胎移植的优势是充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，因此胚胎移植的胚胎只能来自体内受精的胚胎。纠正：胚胎移植的胚胎有三个来源：体内正常__受精__产生的胚胎、核移植产生的重组细胞培养而来的胚胎、体外受精产生的早期胚胎。

4．易错警示

(1)制备人工种子需要植物组织培养到丛芽或胚状体阶段。 (2)正确认识3类细胞的来源：

①杂种细胞：植物体细胞杂交。 ②重组细胞：核移植。 ③杂交细胞：动物细胞融合。

(3)原代培养与传代培养的区别：是否进行了分瓶培养。 (4)核移植技术获得的动物与供核动物的性状并不完全相同。 (5)动植物的体细胞进行离体培养都需要在无菌条件下进行。 (6)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。

Tixingtupo

题型突破

题型1 植物细胞工程

1．(2018·陕西省西安市高考生物一模)白菜、甘蓝均为二倍体，体细胞染色体数目分别为20、18。“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短、耐热性强和易于储藏等优点。如图是“白菜—甘蓝”的杂交过程示意图，回答以下问题：

(1)为了得到原生质体需先用__纤维素酶__和__果胶酶__来处理白菜细胞和甘蓝细胞。 (2)诱导原生质体融合的方法有多种，常用的物理方法是__离心、振动、电激__，融合完成的标志是__再生出新的细胞壁__。由杂种细胞得到白菜—甘蓝还需要经过组织培养技术，其中需要避光培养的步骤是__脱分化__。

(3)如图通过植物体细胞杂交技术获得的“白菜—甘蓝”体细胞染色体数为__38__；通常情况下，白菜和甘蓝有性杂交是不能成功的，原因是__存在生殖隔离__，若对白菜和甘蓝采用杂交育种方法能成功的话，得到的后代应含__19__条染色体。

(4)植物体细胞杂交技术和传统杂交技术相比的优点是__克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种__。

[解析] (1)植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，根据酶的专一性原理，可采用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。(2)诱导原生质体融合的方法包括：物理方法(离心、振动、电激)和化学方法(聚乙二醇)；融合完成的标志是再生出新的细胞壁；将杂种细胞培育成杂种植株还需要采用植物组织培养技术，包括脱分化和再分化两个阶段，其中脱分化过程要避光，再分化过程需光。(3)如图通过植物体细胞杂交技术获得的“白菜一甘蓝”体细胞染色体数为20＋18＝38；通常情况下，由于白菜和甘蓝之间存在生殖隔离，因此白菜和甘蓝有性杂2018交是不能成功的；若对白菜和甘蓝采用杂交育种方法能成功的话，得到的后代应含＋＝

2219条染色体。(4)植物体细胞杂交技术和传统杂交技术相比的优点是克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。

2．(2018·河北邯郸一中二模)我国菊花主要有杭菊、亳菊、怀菊、贡菊等8种，是药

食兼优的代表性植物。研究发现杭菊具有明显的抗炎作用，怀菊具有良好的抗病毒作用(但是抗炎作用很弱)。结合所学知识回答下列问题：

(1)欲培育兼有明显抗炎、抗病毒疗效的菊花新品种，用杭菊和怀菊杂交的方法是做不到的，原因是__二者存在生殖隔离__。

(2)基因工程方法为培育上述新品种提供了可能性，在实施基因工程过程中，最关键的步骤是__基因表达载体的构建__。受体细胞的选择直接关系到实验的成功与否以及新生植株的品质，我们一般选取未开花的幼枝的芽尖，理由有__不带病毒或带病毒极少__、__分化程度低或易诱导脱分化和再分化(答案必须是两个方面)__(写出两个)。若想确定杭菊的受体细胞中是否导入了怀菊的抗病毒基因，常用的检测方法是__DNA分子杂交技术__。

(3)如果利用植物体细胞杂交的方法培育“杭菊怀菊”杂种植株，首先要获得这两种植物细胞的__原生质体__，用聚乙二醇诱导处理后，诱导实验材料再生出__细胞壁__，再利用植物组织培养技术培育出杂种植株。

(4)理论上利用植物体细胞杂交和基因工程的方法均可以培育出抗炎、抗病毒的优良菊花，这两项技术的共同特点有__定向改造生物(或克服了远缘杂交不亲和障碍)__。

[解析] (1)杭菊和怀菊属于两个不同的物种，二者之间存在生殖隔离，所以二者之间不能进行有性杂交。(2)基因工程的关键步骤是基因表达载体的构建；由于幼枝的芽尖具有不带病毒或带病毒极少、分化程度低或易诱导脱分化和再分化的特点，所以通常选取未开花的幼枝的芽尖做受体细胞；可用DNA分子杂交技术检测怀菊的抗病毒基因(目的基因)是否导入了杭菊受体细胞。(3)植物体细胞杂交技术首先要获得这两种植物细胞的原生质体，用聚乙二醇诱导处理后，诱导实验材料再生出细胞壁，再利用植物组织培养技术培育出杂种植株。(4)植物体细胞杂交技术和基因工程的共同特点是定向改造生物(或克服了远缘杂交不亲和障碍)。

易错警示

辨析有关植物细胞工程的3个错混点

(1)植物体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管是染色体数、基因型还是染色体组都采用直接相加的方法。

(2)利用植物组织培养生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。

(3)人工种子发育初期需要的营养物质由人工胚乳提供。 题型2 动物细胞工程

3．(2018·辽宁大连二模)白细胞介素4(IL－4)是具有多种免疫学调节功能的细胞因子，临床及研究中需要大量高纯度的IL－4，以及其高效检测试剂。下图是利用单克隆抗体技术制备抗IL－4特异性抗体的过程。回答相关问题。

(1)在免疫系统组成中，IL－4属于__免疫活性__物质。研究人员从外周血中提取到IL－4蛋白分子的mRNA。将其反转录成__cDNA__，构建特定表达载体，利用工程菌获得用于临床及研究需要的高纯度的IL－4蛋白。

(2)图中所示的a培养瓶中培养的是__骨髓瘤__细胞，其与M细胞融合产生双核或多核细胞。再经__有丝分裂__，进一步形成两个新的单核杂交细胞。

(3)b培养瓶所示过程中，要用特定的选择性培养基进行细胞筛选，得到的__融合的杂种(杂交瘤)__细胞能在体外培养增殖生长。经b获得的细胞，还需要进行__克隆化培养和抗体检测(或答“克隆化培养和专一抗体阳性检测”)__。

(4)c培养瓶中培养的细胞是__分泌抗IL－4抗体(答出此意即可)__的杂交瘤细胞。制备IL－4单克隆抗体的过程中，细胞培养瓶通常置于特定培养箱中进行细胞培养，要求培养瓶松盖，主要目的是__让O2进入培养瓶以供细胞代谢、使CO2进入培养瓶维持培养液的pH__。

4．回答下列与动物细胞工程有关的问题：

(1)动物细胞培养中，在细胞发生贴壁生长过程中会出现__接触__抑制。贴满瓶壁的细胞一般用__胰蛋白酶或胶原蛋白__酶处理后分瓶继续培养，这种培养过程称为__传代__培养。

(2)在细胞核移植过程中常用到卵母细胞，通常情况下，采集到的卵母细胞在体外培养到__减数第二次分裂中__期。在核移植之前，应去除卵母细胞的__细胞核__，原因是__若不去掉卵母细胞的细胞核，就会造成核移植后的卵母细胞中有两个细胞核，使得遗传物质不稳定__。

(3)如图表示制备单克隆抗体的过程。在获得B淋巴细胞之前，小鼠已被多次注射__相同__(填“相同”或“不同”)抗原，注射后小鼠体内发生__体液__(填“细胞”或“体液”)免疫反应，生成能产生抗体的B淋巴细胞(浆细胞)。①过程中，如果细胞发生两两融合，融合后出现__三__种不同的融合细胞。②过程需在特定的__选择__培养基上进行筛选，从而得到__杂交瘤__细胞。③过程培养细胞需要的气体环境为__95%的空气＋5%的CO2__。

[解析] (1)动物细胞培养过程中会发生接触抑制现象，贴满瓶壁的细胞一般用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理后继续培养，分瓶后的培养称为传代培养。(2)体细胞核移植过程中，卵母细胞一般培养到减数第二次分裂中期，并去除卵母细胞的细胞核，否则核移植后有两个细胞核，遗传物质表达发生混乱。(3)制备单克隆抗体前，对小鼠先要多次用同种抗原刺激，从而能产生足够的相应的浆细胞。B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合是随机的，可能是两个淋巴

细胞之间融合或两个骨髓瘤细胞之间融合，也可能是B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，因此有三种融合结果。为了得到杂交瘤细胞，需在特定的选择培养基上进行筛选。动物细胞培养的气体环境是95%的空气＋5%的CO2混合气体。

易错警示

辨析有关动物细胞融合与单克隆抗体的3个错混点

(1)灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。

(2)除了受到注射的抗原的刺激，小鼠在生活过程中还可能受到其他抗原的刺激，因此从小鼠体内取出的多个B淋巴细胞可能产生多种不同抗体，所以进行第二次筛选是非常必要的。

(3)单克隆抗体制备过程中，进行了多次动物细胞培养的操作，说明动物细胞培养是动物细胞工程的基础。

1．(2018·深圳调研)叶绿体转基因技术是将外源基因整合到叶绿体基因组中，该技术能有效改良植物的品质。请回答：

(1)转基因技术的核心步骤是__基因表达载体的构建__，完成该步骤所需要的酶有__限制酶和DNA连接酶__。

(2)将植物体细胞处理得到原生质体，再通过__农杆菌转化法__或__基因枪__法，将目的基因导入原生质体，使原生质体再生出细胞壁之后，通过__植物组织培养__技术培养可得到相应的转基因幼苗。

(3)来自原核生物中有重要价值的外源基因，无需改造和修饰就可在叶绿体中高效表达，就此分析，原因是__叶绿体DNA与原核生物DNA结构类似(由于叶绿体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似)__。

(4)对大多数高等植物而言，与传统的细胞核转基因相比，叶绿体转基因更稳定，其遗传方式__不遵循__(答“遵循”或“不遵循”)分离定律，不会随__花粉__(“花粉”或“卵细胞”)传给后代，从而保持了__母本__(“父本”或“母本”)的遗传特性。

[解析] (1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，所需要的酶有限制酶和DNA连接酶；(2)植物细胞导入受体细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。原生质体再生细胞壁之后，通过植物组织培养获取幼苗；(3)叶绿体DNA与原核生物DNA结构类似。(4)分离定律适用于有性生殖过程中细胞核遗传，故叶绿体转基因不遵循分离定律，为母系遗传。

2．(2018·天津市和平区生物一模)已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原。疫苗的生产和抗体的制备流程如图1所示。请回答下列问题：

(1)过程①代表的是__逆转录__，过程③构建A基因重组载体时，启动子和终止子是重新构建的，它们应该能被受体细胞的__RNA聚合酶__所识别，以便于其催化转录过程。

(2)如图2为A基因的结构示意图，已知Ⅱ区的碱基数是2000个，其中阴影区域碱基数是800个，空白区域中G和C的总数共有400个，则由该区域能指导蛋白质合成的片段转录产生的mRNA中A和U总数是__400__个。

(3)在给小鼠皮下注射A蛋白时，要重复注射几次的目的是通过二次免疫，增加小鼠体内的__浆细胞__数目。

(4)在将X进行扩大培养前，至少需要经过2次筛选，第一次是将__杂交瘤细胞__筛选出来，第二次是将__能分泌所需抗体的杂交瘤细胞__筛选出来。

(5)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的__A蛋白__来制备疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒与已知病毒进行核酸序列比较，或用图中的__抗A蛋白的单克隆抗体__与分离出的病毒进行特异性检测。

[解析] (1)由以上分析可知①是逆转录。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录过程。(2)已知图中Ⅱ区的碱基数是2000个，其中阴影区域碱基数是800个，则空白区域中碱基总数为1200个，又已知空白区域中G和C的总数为400个，则A＋T总数为800个，每条链中A＋T总数为400个，根据碱基互补配对原则，由该区转录形成的成熟mRNA中A和U总数也是400个。(3)在给小鼠皮下注射A蛋白时，要重复注射几次的目的是通过二次免疫，增加小鼠体内的浆细胞数目。(4)在将X进行扩大培养前，至少需要经过2次筛选，第一次是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次是采用抗体阳性检测法筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。(5)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的A蛋白所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒，与已知病毒进行核酸序列比较；或采用抗原—抗体杂交法，即用图中的抗A蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测。

3．如图为三种质粒和一个含目的基因的DNA片段，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，

R

TcR为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoRⅠ(0.7kb)、PvuⅠ(0.8kb)等为限制酶

和其切割位点及其与复制原点之间的距离。已知1kb＝1000个碱基对，请回答下列问题：

(1)片段D为目的基因中的某一片段，则DNA聚合酶和DNA连接酶的作用形成的键依次是__②__(填图中数字)。

(2)图中作为目的基因运载体最理想的质粒是__B__(填“A”“B”或“C”)，请据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是__质粒A不含有标记基因；质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被破坏，使该质粒无法进行复制__。

(3)用EcoRⅠ全酶切目的基因和质粒B形成的重组质粒，并进行电泳观察，可出现长度分别为1．1kb和__5.6__kb的两个片段，或者长度分别为__3.6_kb和3.1_kb__的两个片段(重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRⅠ的识别位点之间的碱基对忽略不计)。

(4)将分别用限制酶PvuⅠ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作，则受体细胞的类型包含__ABD__(多选)。

A．Ap蓝色 C．Ap、蓝色

SR

RS

B．Ap白色 D．Ap白色

(5)动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是__B__。 A．受精卵能使目的基因高效表达 B．受精卵可发育成动物个体 C．受精卵更易接受DNA的插入 D．受精卵体积较大，便于DNA导入操作

[解析] (1)DNA聚合酶和DNA连接酶的作用形成的键均为磷酸二酯键，因此都应为②。(2)由题图可知，切割目的基因应用PvuⅠ，但该限制酶会将c质粒的复制原点破坏，使该质粒无法进行复制，而质粒A不含有标记基因，因此两者都不能作为运载体。(3)根据题意，质粒B长度为2.7kb，目的基因长度为4.0kb，所以重组质粒长度为6.7kb，如果出现长度为1．1kb的一个片段，则另外一个片段的长度为5.6kb。若目的基因与运载体反向连接，可形成长度分别为3.1kb和3.6kb的两个片段。(4)将分别用限制酶PvuⅠ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶后，可得到质粒自身环化形成的普通质粒、重组质粒和目的基因自身连接的DNA环三种类型。如果导入的是普通质粒，受体细胞的类型为A(Ap、蓝色)，如果导入的是重组质粒，受体细胞的类型为B(Ap、白色)，如果导入的是DNA环，受体细胞的类型为D(Ap、白色)。(5)动物基因工程通常选用受精卵作为受体细胞的根本原因是受精卵可发育成动物个体。

S

R

R

4．人乳头状瘤病毒(HPV)与宫颈癌的发生密切相关，抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV，从而及时监控宫颈癌的发生，以下是以HPV衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程，请据图回答下列问题：

(1)单克隆抗体制备过程中涉及的细胞工程技术有__动物细胞培养、动物细胞融合__。 (2)若要分析杂交瘤细胞中染色体，可通过__解离、漂洗、染色和制片__等过程制成装片，然后在显微镜下观察。杂交瘤细胞中染色体数目与普通淋巴细胞相比具有的特点是__染色体数目加倍__，在HAT培养基上存活的细胞可能包括__①②③__(填下列序号)。

①无抗体分泌的细胞 ②抗HPV抗体的分泌细胞 ③其他无关抗体的分泌细胞

(3)对于抗体检测呈__阳__性的杂交瘤细胞应尽早进行克隆化，克隆化的方法最常用的是有限稀释法，即稀释细胞到3～10个/mL，每孔加入细胞稀释液__0.1__mL，使每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的。

(4)由上述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体，理由是__小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在着排异反应__。

(5)科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因(prG)，该基因能激发动物细胞分裂，这为单克隆抗体的制备提供了更多的思路。除本题描述的制备单克隆抗体技术外，请再简要写出一种制备单克隆抗体的思路。

__通过基因工程向浆细胞中导入prG；利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中(答对其一即可)__。

[解析] (2)利用显微镜观察有丝分裂过程中的染色体，需先制作临时装片；杂交瘤细胞中含有浆细胞和骨髓瘤细胞的染色体，所以比普通淋巴细胞的染色体数目多一倍；在HAT培养基上生存的细胞均为杂交细胞，这些杂交细胞中有分泌HPV抗体的细胞，有分泌其他抗体的细胞，也有不能分泌抗体的细胞。(3)抗体检验呈阳性，说明该杂交瘤细胞可产生所需抗体；为保证每个小孔不多于一个细胞，根据浓度可推断加入细胞稀释液的量：设加入细胞稀释液的最大量是X，则10个/mL×X＝1个，X＝0.1mL。(4)小鼠形成的抗体与人体抗体不同，故在人体内可引起免疫反应，所以上述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体。(5)根据所给信息可知，还可通过转基因技术或核移植技术获得既能大量增殖，又能产生特定抗体的杂交细胞。

5．(2017·陕西西安长安一中第一次检测)下图是植物体细胞杂交过程示意图，请据图回答：

(1)植物体细胞杂交的第①步是去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体。目前此步骤最常用的方法是酶解法，也就是在温和的条件下用__纤维素酶、果胶酶__等分解植物的细胞壁。

(2)②过程的发生，必须进行人工诱导。人工诱导原生质体融合常用的化学方法是用__聚乙二醇__试剂作为诱导剂诱导融合。动物细胞融合还常用到__灭活的病毒__作为诱导剂。

(3)与过程③密切相关的具有单层膜结构的细胞器为__高尔基体__。

(4)④过程称为__脱分化__，⑤过程称为__再分化__。若利用此技术生产治疗癌症的药物——紫杉醇，培养将进行到__e__(填字母编号)即可。

(5)植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是可以__克服远缘杂交不亲和的障碍__。

[解析] (1)植物体细胞杂交的第①步是用纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体。(2)人工诱导原生质体融合常用的化学方法是用聚乙二醇试剂作为诱导剂诱导融合。动物细胞融合还常用到灭活的病毒作为诱导剂。(3)过程⑧是杂种细胞生出细胞壁，高尔基体与植物细胞壁形成有关。(4)④⑤过程分别为脱分化和再分化，治疗癌症的药物——紫杉醇是从紫杉细胞中提取的，只需将植物组织培养进行到愈伤组织阶段即可。(5)植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是可以克服远缘杂交不亲和障碍，大大扩展可用于杂交的亲本组合范围。

6．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：

(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是__E1和E4__。使用这两种酶进行酶切是为了保证__甲的完整__，也是为了保证__甲与载体正确连接__。

(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了__转录__和__翻译__过程。

(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的__细胞核__移入牛的__去核卵母细胞__中、体外培养、胚胎移植等。

(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的__核DNA__(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作

为PCR模板。

[解析] (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1－GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1－GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。

(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1－GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。

(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。

(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。 7．(2018·天津卷)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。

(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用__PCR__技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的__多肽(或蛋白质)__，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。

(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与__载体__连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的__总RNA__进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。

(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加__非天然氨基酸(Uaa)__的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。

特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是__D__(单选)。 A．病毒的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶

B．宿主的DNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶

(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起__细胞__免疫，增强免疫保护效果。

[解析] (1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是聚合酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。

(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术鉴定，筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。

(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。

(4)不具有感染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。

8．(2018·江苏卷)为生产具有特定性能的α－淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656个碱基对)，利用基因工程大量制备α－淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增α－淀粉酶基因前，需先获得细菌的__基因组DNA__。 (2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的__5′__端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是__使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连__。

(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中__②__的设定与引物有关，__⑥__的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)

①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间 (4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α－淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含__8__个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有__13__种。

(5)获得工程菌表达的α－淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下： 缓冲液 pH 酶相对活性%

50 mmol/L Na2HPO4－KH2PO4 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 50 mmol/L Tris－HCl 8.5 9.0 9.0 50mmol/L Gly－NaOH 9.5 10.0 10.5 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8

根据上述实验结果，初步判断该α－淀粉酶活性最高的条件为__pH为8.5，缓冲液为50_mmol/LTris－HCl__。

[解析] (1)利用PCR技术扩增α－淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α－淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。

(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。

(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1kb以内的延伸时间为1min左右，3～4kb的延伸时间为3～4min。

(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共16种可能性。题干表明控制α－淀粉酶的基因有1656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13种可能性。

(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50mmol/LTris－HCl。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/h0b6.html