cytoscan assay中文手册

CytoScan Assay中文手册

gDNA≥50ng/μL

关于振荡：Mix：高速振荡3次，每次1秒

Reagents：3次，每次1秒 酶：快速振荡1秒

关于离心：板：除片段化步骤要求4℃外，其余均室温，2000rpm离心1分钟 Reagents和酶：离心3秒

关于酶：以下步骤用到的所有酶均到用时才能从冰箱拿出，用完立即放回-20℃

Stage 1:消化

1. 将gDNA高速振荡3次，每次1秒混匀，2000rpm离心1分钟。 2. 10×Nsp I Buffer和100×BSA室温融化，振荡、离心，冰上放置。 3. Nsp I enzyme放于-20℃，用时才能拿出来。 4. PCR仪要先预热。

5. 阳性对照管(+)加5μL Genomic DNA，阴性对照管(-)加5μL low EDTA TE. 6. 配Digestion Master Mix。

7. 将Mix振荡混匀并离心。 8. 将Mix分管加至模板中。

9. 将PCR板高速振荡5次，每次1秒；2000rpm离心1min。 10. 按上图右侧的程序运行。

Stage 2：连接

1．预热PCR仪，将板放于室温。

2．10×T4 DNA Ligase Buffer(约20min)和50μM Adaptor,Nsp I 室温融化，振荡混匀，buffer变清澈，离心，冰上放置。 3．消化后的模板2000rpm离心1min，冰上放置。 4．配Ligation Master Mix.

5．Mix高速振荡3次，每次1秒；离心3秒。 6．将连接Mix分至各消化管。

7．将PCR板高速振荡5次，每次1秒；2000rpm离心1min。 8．按上图右侧的程序运行。

Stage 3A：PCR

1. 连接产物盖紧盖口，2000rpm离心1min。 2. 稀释连接产物。

3. 盖紧盖口，高速振荡5次，2000rpm离心1min，冰上放置。 4. 稀释后的PCR产物每个模板分成4管，每管10μL。如下图

5. PCR仪预热。

6. 10× TITANIUM Taq PCR Buffer, dNTP Mixture, PCR Primer 002室温融化，混匀并离心，立即置于冰上。GC-Melt Reagent和Affymetrix Nuclease-Free water置于冰上。 7. 配master mix。

8. 高速振荡3次，每次1秒。 9. 将master mix分装至各管。

10. 高速振荡5次，每次1秒。重复振荡一次，2000rpm离心1min。

11. 按上图右侧的程序运行。此步PCR一定要用银质板或金包银板的PCR仪。

Stage 3B：PCR产物验证

1. 取0.2mL的PCR管，各加入5 μL的Affymetrix? Nuclease-Free water和2 μL

的USB 5×RapidRun? Loading Dye。

2. 从第一排的PCR产物中各抽取3μL加入至上一步的混合液中，得到10μL的产物mix，振荡混匀并离心。

3. 各取8μL产物mix和5μL DNA marker点入2%的琼脂糖凝胶中，5V/cm跑胶45min。样本和阳性对照的产物约在150bp~2000bp，阴性对照无条带。

Stage 4：PCR产物纯化

1. 将同一样本的4管PCR产物移至同一个1.5mL的离心管中，从此步开始，阴性对照便不必再往下做。

2. 彻底上下颠倒Purification Beads至溶液呈均一状。

3. 每管加入720μL Purification Beads，盖紧管盖，上下颠倒10次混匀，室温放置10min。

4. 最大转速（16100rcf）离心（管盖连接处朝向外侧）3min。

5. 取出管子放在磁力架上。待磁珠富集后，不扰乱磁珠的情况下，小心抽弃上清液。

6. 每管各加1.0mL Purification Wash Buffer。盖紧管盖，最大速度涡旋振荡2min。 7. 重复步骤4和5。

8. 16100rcf离心30s（管盖连接处朝向外侧），重新放在磁力架上。

9. 用小枪头将管底的Purification Wash Buffer吸净，从磁力架上拿下管子，不盖管盖，使残余的Buffer完全挥发，室温放置10min。

10. 每管加52 μL的Elution Buffer，直接滴在磁珠上。

11. 盖紧管盖，最大速度涡旋振荡10min使磁珠重新悬浮混匀。若磁珠尚未完全重悬，轻弹管子，并继续振荡2min。

12. 16100rcf离心3min（管盖连接处朝向外侧），于磁力架上放置10min。 13. 待磁珠完全贴于管底一侧，小心抽取47μL洗脱后的模板至新管。 14. 盖紧管盖，最大速度振荡1s，2000rpm离心1min。

Stage 5：定量

Nanodrop

1. 在新PCR管中各加入18μL Affymetrix? Nuclease-Free water，加入2μL纯化产物。

2. 盖紧管盖，振荡，离心。

3. 用Affymetrix? Nuclease-Free water作空白对照，取1μL稀释后的模板测定其在260, 280和320 nm处的吸光值。

4. 计算未稀释模板的浓度μg/μL：(ng/μL的浓度×10) ÷ 1000。 7个及其以上模板的纯化后浓度需≥3.0μg/μL，不得＜2.5μg/μL； OD260/OD280的比值需在1.8和2.0之间； OD320的值需非常接近于0 (＜0.1)。

Stage 6A：片段化

1. 开始做片段化前先将板放至冰上冷却到4℃。 2. PCR仪提前预热。

3. 纯化产物从冰箱拿出解冻，振荡离心，置于冰上预冷10min。

4. 将用到的试剂（除Fragmentation Reagent直到用时才从-20℃拿出外）放于冰上。配Fragmentation Master Mix。

5. 将Mix高速振荡3次，每次1秒。

6. 每管模板加入10μL Fragmentation Master Mix。

7. 将板用粘附膜贴牢，高速振荡5次，每次1秒。 8. 预冷的离心机中2000rpm离心1min。 9. 将板放入PCR仪，按上面右侧图的程序运行。

Stage 6B：片段化产物验证

1. 抽取4μL片段化产物至新的排管中并标记。

2. 加28μL Affymetrix? Nuclease-Free water。盖紧管盖，振荡，离心。 3. 取出8μL，加2μL的USB 5X RapidRun? Loading Dye，盖紧管盖，振荡，离心。

4. 在4%的TBE胶中点入8μL样本稀释液，旁边点入2μL TrackItTM 25 bp DNA Ladder。5V/cm电压跑胶45min。理想的凝胶图片如下图。片段化区域约在25~125bp。

Stage 7：标记

1. 将5×TdT Buffer和30 mM DNA Labeling Reagent 2. 配Labeling Master Mix。

3. 振荡混匀并离心。

4. 每个模板加入19.5μL Labeling Master Mix。

5. 用粘附膜将板封好。高速振荡5次，每次1秒，2000rpm离心1min。 6. 放入PCR仪，按上面右侧图所示的程序运行。

Stage 8：杂交

1. 将芯片从冰箱拿出，平衡至室温。 2. 杂交炉设置成50℃旋转预热1h。

3. 在Affymetrix GeneChip Command Console(AGCC)中用手持红外扫描设备扫描芯片条形码，注册样品信息，生成样品对应芯片ARR文件 4. 取一个15mL的管子，在冰上配Hybridization Master Mix。

5. 将Mix高速振荡3次，每次3秒混匀。离心。

6. 每个标记后的模板加入190μL的Hybridization Master Mix。

7. 将板封好，高速振荡5次，每次1秒。重复振荡一次。2000rpm离心1min。 8. 将板放进PCR仪，按下图的杂交程序运行。

9. 程序运行结束后，使模板在49℃温育至少1min。

10. PCR板保持在PCR仪中，抽取200μL杂交液打入芯片中。每次实验最多操作8张芯片。

11. 擦净隔膜四周的液体，用Tough-Spots?贴上隔膜，压紧。 12. 立即将芯片放入杂交炉，每次4个。 13. 50℃下60rpm杂交16~18个小时。

Stage 9：洗脱，染色，扫描

1. 把芯片洗涤液wash A 、wash B和去离子水放在洗涤站的相应位置，然后运行AGCC Flutions Control软件进行初始化；

2. 初始化结束后，在3个无核酸1.5ml离心管中分别加入500ml stain Cocktail 1、 500mlstain cocktail2和800ml array holding buffer，然后放在洗脱站的1、2、3位置上，然后把杂交好的芯片从杂交炉直接取出插入洗脱站的槽中；

3. 在AGCC flution Control软件的洗脱站Barcode中扫描芯片条形码和在Probe Array Type中选择相应的芯片类型(CytoScan 750 K选择CytoScan 750 K;CytoScan HD选择CytoScan HD)，然后点击运行，大约洗涤2h；

4. 洗脱结束后，把芯片放在affymetrix的扫描仪中，然后点击affymetrix Launcher中的AGCC Scan Control，点击工具栏中的Star进行芯片扫描生成数据。

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