5株抗常见动物病原菌的优良拮抗放线菌的分类鉴定

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第31卷第8期2009年8月

中国预防兽医学报

ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine

Vol.31，No.8Aug.2009

5株抗常见动物病原菌的优良拮抗放线菌的分类鉴定

来航线，傅艳萍，赵卉琳，朱

华

(西北农林科技大学生命科学学院/资源环境学院，陕西杨凌712100)

摘要：为寻找新的抗菌微生物，本研究从西北部分地区盐渍土中分离到5株具有拮抗作用的放线菌1202、

02-F-17、66J03、3501及3010，其代谢产物对引起鸡大肠杆菌病的大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)和引起牛隐性乳房炎的无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)等多种动物病原菌均有较强的抑菌作用。通过对其进行形态学特征、生理生化特性、细胞壁化学组分以及16SrDNA序列等多相分类研究，初步确定其分类地位分别为：5株菌均属链霉菌，其中1202与戈壁三素链霉菌(Streptomycesgobitricini)最接近，02-F-17与晶体链霉菌(Streptomycescavis-

cabies)相近，66J03与易变链霉菌(Streptomycesmutabilis)相近，3501最接近红淡紫灰链霉菌(Streptomycesrubrolavendulae)，3010与比基尼链霉菌(Streptomycesbikiniensi)相近。

关键词：动物病原菌；拮抗性；放线菌；分类鉴定中图分类号：S852.61

文献标识码：A

文章编号：1008-0589(2009)08-0646-04

Identificationoffivefineantagonisticactinomycete

strainsagainstanimalpathogens

LAIHang-xian,FUYan-ping,ZHAOHui-lin,ZHUHua

(CollegeofLifeScience/CollegeofResourcesandEnvironment,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China)

Abstract:Fiveactinomycetestrains1202,02-F-17,66J03,3501and3010wereisolatedfromthesalinesoilofShaanxiandXinjiangprovinces,andshowedstronginhibitingactivitytoEscherichiacoli,Streptococcusagalactiaeandotheranimalpathogens.Basedonthepolyphasicstudies,includingtheremorphology,physiologicalandbiochemicalcharacteristics,chemotaxonomyand16SrDNAsequenceanalysis,theseactinomycetestrainswereprimarilyidentifiedasStreptomyces,ofwhich1202,02-F-17,66J03,3501and3010weresimilartoStreptomycesgobitricini,Streptomycescaviscabies,Streptomycesmutabilis,Streptomyces

rubrolavendulaeandStreptomycesbikiniensis,respectively.

Keywords:animalpathogen;antimicrobialactivity;actinomycete;identification

随着大型集约化养殖业的迅速发展，畜禽的细菌性疾病如鸡的大肠杆菌病、牛的乳房炎等明显增多，成为危害养殖业的最普遍发生且防治最棘手的疾病之一，严重制约着养殖业的发展[1-2]。这些细菌性疾病由于分布广泛，血清型众多且有逐年增加的趋势[3]，因此消灭或清除这些疾病是一个需要投入大量人力、物力和财力的长期过程。抗生素在临床和生产中对细菌性疾病的预防与控制取得了一些很好的效果，但由于抗生素的长期滥用和误用，不但

激化了病毒的进化，而且使细菌的耐药性直线上升，从而导治治疗费用越来越高[4]。有专家认为，细菌可利用自由飘浮的基因材料发展抗药性，抗生素将很快失去效用[5]。因此，开发残留小、不产生或少产生耐药菌的抗生素替代品成为诸多学者关注的焦点。本研究室在西北地区盐渍土中拮抗性放线菌资源研究中获得了5株高效拮抗菌株，这些菌株对引起鸡和猪大肠杆菌病的大肠埃希氏杆菌、引起牛隐性乳房炎的无乳链球菌、引起猪葡萄球菌病的

收稿日期：2008-12-30

基金项目：国家“十五”科技攻关项目(2002BA516A09)

作者简介：来航线(1964-)，男，陕西礼泉人，副教授，博士，主要从事微生物资源利用和微生物生态研究.

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第8期来航线，等.5株抗常见动物病原菌的优良拮抗放线菌的分类鉴定647

金黄色葡萄球菌均有较强的拮抗作用，并且其发酵液拮抗效果稳定而持久，极具有开发利用的潜力。本研究对这5株菌进行了形态特征、培养特征、生理生化特性、细胞壁化学组份以及16SrDNA序列分析的多相分类研究，现将结果报道如下。

培养特征观察。经显微镜观察发现1202基丝细长，气丝紧密，较细，多交叉，孢子丝直线型；02-F-17基丝交织，气丝紧密，较粗，孢子丝直线型，单轴分支；66J03基丝稀疏，气丝细长，顶部或中部膨大形成孢子链；3501基丝较细，气丝发达，较粗，孢子丝末端成卷曲状；3010基丝细长，气丝发达，较粗，孢子丝聚集成簇状。观察结果表明供试菌株的形态特征均表现出链霉菌的特征(表1)。

表1供试菌株的培养特征

Table1Culturecharacteristicsoftestedstrains

菌号指标StrainNo.Index

生长Growth气丝AM

1202基丝SM

可溶色素SP产孢Sporulation

生长Growth气丝AM基丝SM可溶色素SP产孢Sporulation生长Growth气丝AM基丝SM可溶色素SP产孢Sporulation生长Growth气丝AM基丝SM可溶色素SP产孢Sporulation生长Growth气丝AM基丝SM可溶色素SP产孢Sporulation

Ⅰ++WLP-------++WC--+++PIC-+++WC--Ⅱ+++WLY--+++OWPB--+++WP--+++IC--+++WW--Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ

Ⅵ++WDB-++++GDB--+++IPB-++++OC--+++OC--Ⅶ+++WW--+++OWDBLB-+++GDBLB-+++OC--++WC--

1

1.1

材料和方法

菌

株

本实验室分离自陕西、新疆等地区盐

碱土中的5株优良拮抗性放线菌，采用固体和液体2种筛选方法获得。1.2

形态特征与培养特征

形态特征采用高氏一号

琼脂培养基于28℃条件下进行埋片培养，分别培养7d、14d、21d后取片，用Motic数码生物显微镜观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝及孢子的形态特征。

培养特征采用文献[6]所载的7种培养基接菌后28℃培养7d～14d，观察并记录结果。1.3

生理生化特征

参照文献[6-7]对5株菌的唯一

碳源利用、明胶液化、牛奶凝固与胨化、H2S产生等生理生化指标进行测定。1.4

细胞化学组分分析

全细胞水解液氨基酸和糖

分的分析以Hasegawa等和王平改进的TLC方法进行[8-9]。1.5

16SrDNA序列测定与分析

总DNA的提取采

+++++++++WWPIWWW

----++++LYW--+++WP--+++WI--++WY--+++LYW--+++WLY--+++WOW--+++CELB-+

+++WDB-++++WW-++++WC-++++OWWYG-

02-F-17

66J03

3501

用酶解法进行，总DNA和PCR扩增产物的检测均采用琼脂糖凝胶电泳，引物采用细菌通用引物，正向引物PrimerA(对应于E.coli的16SrDNA5'端8-27f位置)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物PrimerB(对应于E.coli的16SrDNA5'端1523-1504r位置)：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

根据测序结果，先利用BLAST搜索软件从GenBank与EMBL等数据库中搜索相关放线菌的模式菌株的16SrDNA序列，随后用ClustalX1.8[10]进行多序列比对，选择Nocardiopsisaegyptica为外群，采用Neighbor-joining[11]法，Kimura[12]双参数矫正模型构建系统进化树。

3010

2

2.1

结果

利用高氏一号琼脂、察

注：Ⅰ察氏琼脂培养基，Ⅱ甘油-天门冬酰胺琼脂培养基，Ⅲ无机盐淀粉琼脂培养基，Ⅳ酵母膏-麦芽膏琼脂培养基，Ⅴ燕麦片琼脂培养基，Ⅵ马铃薯浸汁琼脂培养基，Ⅶ营养琼脂培养基C无色，G灰色，I乳白色，O橘黄色，P紫色，W白色，Y黄色，CE灰绿色，DB黑褐色，LB浅褐色，LP淡紫色，LY淡黄色，OW灰白色，PB紫褐色，PI粉色，YG黄绿色

Notes:ⅠCzapek'sagarmedium,ⅡGlycerolasparagineagarmedium,ⅢInorganicsalt-starchagarmedium,ⅣYeastext-Maltextagarmedium,ⅤOatmealagarmedium,ⅥPotatojuiceagarmedium,ⅦNutrientagarCcolorless,Ggrey,Iivory,Oorange,Ppurple,Wwhite,Yyellow,CEceladon,DBdarkbrown,LBlightbrown,LPlightpurple,LYlightyellow,OWoffwhite,PBpurplebrown,PIpink,YGyellowishgreen

通过形态特征和培养特征观察，5株菌均属于

形态特征与培养特征

链霉菌属，初步鉴定为：1202、02-F-17为粉红孢类群，66J03为绿色类群，3501为淡紫灰类群，3010

氏琼脂等8种培养基对供试菌株进行初步的形态和

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为烬灰类群。2.2

生理生化指标

参照文献[6，7]中规定的相关

测定项目，对供试的5株菌进行了10种共38项生理生化特征鉴定，结果见表2。

表2供试菌的生理生化特性

Table2Physiologicalandbiochemical

characteristicsoftestedstrains

指标ActinomyceteIndex120202-F-1766J03

明胶液化Gelatinhydrolysis+++++-淀粉水解Starchhydrolysis-2.6-硝酸盐还原Nitricacidreduction+++卵磷脂酶Lecithinhydrolysi---硫化氢产生ProducingH2S++-+黑色素产生Tyrosinedrolysis++纤维素分解Utilizationofcellulose---+-+产酸Acidproduction

---石蕊牛奶试验产碱Alkaliproduction

+--Litmusmilktest胨化Peptonizatio

---凝固Coagulatio

---还原Reduction

+++尿素Urea

+++硝酸钾KNO3

---亚硝酸钠NaNO2

+++酪氨酸Tyrosine

+++丝氨酸Serine

++唯一N利用烟酰胺Nicotinamide+++Nitrogensource.甘氨酸Glycine++++甲硫氨酸Methionine

+++丙氨酸Alanine

+++谷氨酸Glutamate

+++腺嘌呤Adenine

+++阳对照PositiveCK

+++阴对照NegativeCK

+++D-葡萄糖Glucose

+++D-木糖Xylose

+++L-鼠李糖Rhamnose

+++D-果糖Fructose

+++蔗糖Sucrose

+++乳糖Lactose

+麦芽糖Maltose+++唯一C源利用甘露糖Mannose++

Carbonsource甘油Glycerol---+++山梨醇Sorbitol

++-醋酸钠Sodiumacetate

++-柠檬酸钠Sodiumcitrate

---草酸钠Sodiumoxalate

-++马尿酸钠Hippurate

++丁二酸钠Sodiumsuccinate++++阳对照PositiveCK

+++阴对照NegativeCK

strains

35013010++++++++2.12.7+++--+-+--+---------++++--++++++++-+++++++++-+++++++++++++++++--++++++--++++++++

toN2;Milkpeptonization:+peptonized＜1/3,++peptonized1/3-2/3,

+++peptonized＞2/3;CarbonandNitrogensource:+canbeusedorgrow,-cannotbeusedorgrow

表2结果显示，供试菌株的生理生化特征差异不大，尤其是硝酸盐还原、碳氮源利用能力等，若要进一步确定其分类地位，需借助分子手段。2.3

细胞壁化学组分分析

5株菌的细胞壁均含LL-DAP和甘氨酸，属胞壁Ⅰ型。全细胞水解液均含葡萄糖和核糖，但无特征性糖，糖型C。细胞壁类型和糖型均表现为典型的链霉菌特征(表3)。

Table3

菌株号StrainNo.120202-F-1766J0335013010

表3细胞壁化学组分分析

Analysisofchemicalcompositionofcellwall

全糖种类氨基酸种类胞壁类型糖型KindsofKindsofTypesofTypessugarAminoAcidCellwallofsugarGlu、Rib、ManGly、Asp、Glu、AlaCⅠ

Glu、RibCGly、Asp、Glu、AlaⅠ

Glu、Rib、ManCGly、Asp、Glu、AlaⅠ

Glu、Rib、ManCGly、Asp、Glu、AlaⅠ

Glu、RibCGly、Asp、Glu、AlaⅠ

DAP类型

TypesofDAPLL-DAPLL-DAPLL-DAPLL-DAPLL-DAP

注：Gly甘氨酸；Asp天门冬酰氨；Glu谷氨酸；Ala丙氨酸；Glu葡萄糖；Rib：核糖；Man甘露糖

2.416SrDNA序列分析将供试菌株的16SrDNA

序列与GenBank和EMBL数据库中链霉菌属相关的菌株进行16SrDNA序列比较，并以Nocardiopsis

aegyptica为外群，构建系统发育树(图1)。

注：明胶液化：-为不液化，+为液化＜1/3，++为液化1/3～1/2，+++为液化1/2～2/3，++++为液化＞2/3；硝酸盐还原：-为不还源，+为还原成NO2，++为还原成N2；牛奶胨化：+为胨化＜1/3，++为胨化在1/3～2/3，+++为胨化＞2/3；碳氮源利用：+能够利用或生长，-不能够利用或生长

Note:Gelatinliquefaction:-non-liquefaction,+liquefied＜1/3,++liquefied1/3-1/2,+++liquefied1/2-2/3,++++:liquefied＞2/3;Nitratereduction:-non-reduction,+bereductedtoNO2,++bereducted

在系统发育树上，菌株1202与Streptomyces

xantholiticus，Streptomycesgobitricini，Streptomycesnatalensis4株菌构成1个分支，1202与这3株菌的

序列同源性分别为95.45%，99.29%，95.15%，其中与Streptomycesgobitricini序列同源性最高。02-F-17与Streptomycesbikiniensis，Streptomycescaviscabies，

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第8期来航线，等.5株抗常见动物病原菌的优良拮抗放线菌的分类鉴定649

Streptomycescrystallinus聚为一支，序列同源性分别

为95.18%，94.58%，99.04%，与Streptomyces

体外杂交等手段来完成。对有应用潜力的供试菌株进行多相分类研究，可以较为准确地确定其分类地位，从而为该菌株的改良和进一步开发利用提供理论依据，同时也可为今后动物性拮抗放线菌的分类鉴定提供系统的试验参考方法。

crystallinus序列同源性最高。66J03与Streptomycesmutabilis聚在一支，序列同源性为98.37%。3501

与Streptomycesrubrolavendulae，Streptomycesfradiae，

Streptomycesroseoflavus聚在一支，序列同源性均为

97.01%，参照3株模式菌株的形态及培养特征，3501与Streptomycesrubrolavendulae最为接近，3010与Streptomycesbikiniensi聚为一小支，序列同源性为98.12%。但仅以传统分类方法及16SrDNA的比对对菌株鉴定还不够，对于其具体的分类地位的确定尚需借助DNA-DNA同源性分析即DNA-DNA分子体外杂交等手段来完成。

[3][2][1]

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(本文编辑：陈立群)

参考文献：

3讨论

根据放线菌和链霉菌的分类鉴定手册，5株菌的形态特征、培养特征、生理生化特征均表现出链霉菌属的典型特征，其中1202、02-F-17为粉红孢类群，66J03为绿色类群，3501为淡紫灰类群，3010为烬灰类群。细胞壁化学组分分析更证明这一结论。16SrDNA序列分析表明，1202与戈壁三素链霉菌(Streptomycesgobitricini)序列同源性最高，为99.29%，应属于相同种，02-F-17与晶体链霉菌(Stre-

ptomycescaviscabies)序列同源性最高，为99.04%，属

于相同种，66J03与易变链霉菌(Streptomycesmuta-

bilis)同源性为98.37%，应属于相同种，参照模式

菌株的形态及培养特征，3501与红淡紫灰链霉菌(Streptomycesrubrolavendulae)最为相近，3010与比基尼链霉菌(Streptomycesbikiniensis)同源性为98.12%，应属于相同种。对于供试菌株具体分类地位的确定尚需借助DNA-DNA同源性分析即DNA-DNA分子

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

(上接第645页)[5]

世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验和疫苗手册[M].5版.2004.[6]

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(本文编辑：陈立群)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/gwp4.html