药物活性筛选实验

实验计划

实验目的：采用HEK293/α1D-AR/Gα16细胞模型，通过钙流实验评价关黄柏的四个血中移行成分小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮及木兰碱对α1D型肾上腺素能受体的阻滞作用，表征成分的抗前列腺炎潜在活性；在22RV1人前列腺癌细胞上，通过MTT及相关分子生物学分析评价以上四种血中移行成分的治疗前列腺癌活性。

第一章 关黄柏血中移行成分抗前列腺炎活性评价 1 实验材料 1.1 仪器与试剂 1.1.1 实验仪器： CO2培养箱 紫外消毒柜 倒置荧光显微镜 倒置显微镜 超微量分光光度计 离心机 干燥箱 荧光读板仪 低温离心机 生物安全柜 电子分析天平 超纯水机 离心机（小） 电泳仪 电泳成像仪 荧光PCR仪 梯度PCR仪 磁力搅拌器

SANYO 三洋 泰州安康 OLYMPUS OLYMPUS 元仪 卢湘仪 上海一恒 PerkinElmer Hettich HDL

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立式蒸汽压力灭菌器 水浴锅 流式细胞仪 1.1.2 实验材料：

上海博讯 IKA 默克密理博

HEK293/α1D-AR/Gα16稳转细胞系，22RV1人前列腺癌细胞（ATCC），ABT-594和RJR2403阳性化合物（肾上腺素、咖啡因？），96-孔黑边透明底 Greiner plate（μClear/Clear Bottom）,Milliporeviacount reagent，DMEM高糖培养液（Applichem，Germany）,HBSS( Hyclone, USA),台盼蓝（Sigma，USA），RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗钙流检测试剂盒，乙醇其它试剂均为分析纯级。 2 方法 2.1 细胞株培养

细胞的复苏培养 从-80℃中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/mL密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养于含有10?S的DMEM（High glucose）培养液中，同时加入 400 μg/mL G418。消化细胞使用含 0.05íTA的Trypsin溶液。 2.2 细胞的传代

HEK293/α1D-AR/Gα16细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。并冻存细胞备用，冻存细胞使用含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2.3 细胞形态的观察

在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。 2.4细胞的计数

常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用milliporeviacount按比例重悬并吹打制成细胞悬液。预热guava流式细胞仪，进行流式细胞仪的细胞计数分析。 2.5细胞的贴壁率

指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养

瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。 2.6生长曲线

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1mL培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。 或采用台盼蓝计数法：

(1)取不同时间段生长的原代小鼠肝细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数 (2)根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 MTT检测法：

（1）细胞接种在96孔板上，200ul/孔，培养基代替细胞悬液做为空白对照。 （2）加入0.1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲赞结晶。

（3）加入150ul/孔的DMSO,摇床上低速震荡15min,使蓝色的结晶充分溶解后，在酶标仪上在OD值490nm处检测

（4）计算细胞成活率，绘制细胞生长曲线。 2.7 细胞形态观察并记录

利用倒置相差显微镜观察生长过程中细胞的形态，并拍照记录。 2.8 钙流实验

配体门控离子通道受体是继Ｇ蛋白偶联受体和核激素受体家族之后的又一重要的受体靶标。建立基于配体门控离子通道受体介导的钙流变化的药物筛选模型，将细胞与Ｃａ２＋敏感的荧光探针（Ｆｌｕｏ－４）共同孵育，使用阳性化合物（ＡＢＴ－５９４）来激动Ｆｌｕｏ－４标记细胞，通过加入被测化合物后荧光读板仪检测到的钙流变化，观察被筛选化合物激动或拮抗钙流反应的能力，筛选出对α1D-AR起拮抗作用的药物 2.8.1钙流反应缓冲液配制

HEPES 10 mmol/L，NaCl 5 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl22 mmol/L,N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L，glucose 10 mmol/L，室温下调 pH 值到 7.4。 2.8.2细胞内钙流的检测方法

待细胞融合度达70%-90%时，收集于直径 10 cm 的细胞培养皿中培养的HEK293/α1D-AR/Gα16细胞，加入 Fluo-4 5 μmol/L 和 2.5 mmol/L Probenecid，室温下避光孵育 30 分钟后，使用钙流反应缓冲液洗涤 2 遍。以 80 μl/孔接种到 96 孔黑边透明底的 Greiner板中，细胞密度约 6×104/孔。使用 PE 荧光读板仪，加入一定浓度的化合物溶液 20 μL/孔，在激发波长 485 nm，发射波长 525 nm 下检测荧光强度120 秒。 2.8.3 数据采集与处理

取钙流曲线的峰值读数来量化该点化合物的钙流反应。数据的非线性回归拟合及作图采用GraphPad Prism（GraphPad Software, Inc.，San Diego, CA, USA）软件。同时可以利用荧光显微镜拍照记录。 化合物抑制率计算公式：

化合物抑制率=(ABT-594 引发的峰值读数－各化合物引发的峰值读数) / ABT-594 引发的峰值读数×100%

第二章 关黄柏血中移形成分抗前列腺癌活性评价 1 实验材料 1.2 仪器与试剂 1.1.1 实验仪器： CO2培养箱 紫外消毒柜 倒置荧光显微镜 倒置显微镜 超微量分光光度计 离心机 干燥箱 荧光读板仪 低温离心机 生物安全柜 电子分析天平 超纯水机 离心机（小） 电泳仪 电泳成像仪 荧光PCR仪 梯度PCR仪 磁力搅拌器 立式蒸汽压力灭菌器 水浴锅 流式细胞仪 1.1.2 实验材料：

HEK293/α1D-AR/Gα16稳转细胞系，22RV1人前列腺癌细胞（ATCC），ABT-594和RJR2403阳性化合物，96-孔黑边透明底 Greiner plate（μClear/Clear Bottom）,Milliporeviacount reagent，DMEM高糖培养液（Applichem，Germany）,HBSS( Hyclone, USA),台盼蓝（Sigma，USA），RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免

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梅特勒-托利多 优普 Thermo Bio-Rad Bio-Rad Bio-Rad Bio-Rad IKA 上海博讯 IKA 默克密理博

洗钙流检测试剂盒，乙醇其它试剂均为分析纯级。 2 方法 2.1 细胞株培养

细胞的复苏培养 从-80℃中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/mL密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养于含有10?S的RPIM-1640培养液中。消化细胞使用含 0.05íTA的Trypsin溶液。 2.2 细胞的传代

22RV1人前列腺癌细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。并冻存细胞备用，冻存细胞使用含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2.3 细胞形态的观察

在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。 2.4细胞的计数

常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用milliporeviacount按比例重悬并吹打制成细胞悬液。预热guava流式细胞仪，进行流式细胞仪的细胞计数分析。 2.5细胞的贴壁率

指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。 2.6生长曲线

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。

以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1mL培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。 或采用台盼蓝计数法：

(1)取不同时间段生长的原代小鼠肝细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数 (2)根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 MTT检测法：

（1）细胞接种在96孔板上，200ul/孔，培养基代替细胞悬液做为空白对照。 （2）加入0.1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲赞结晶。

（3）加入150ul/孔的DMSO,摇床上低速震荡15min,使蓝色的结晶充分溶解后，在酶标仪上在OD值490nm处检测

（4）计算细胞成活率，绘制细胞生长曲线。 2.7 细胞形态观察并记录

利用倒置相差显微镜观察生长过程中细胞的形态，并拍照记录。 2.8 CCK8、MTT检测关黄柏血中移行成分抗前列腺癌活性

2.8.1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000

孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.8.2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板，具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，每孔0-10ul，设3-5个复孔

2.8.3.每孔加入10微升CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200微升，则需加入20微升CCK-8

溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

2.8.4.在细胞培养箱内继续孵育1小时、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后 选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。 2.8.5.在450nm测定吸光度。进行数据分析。

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