植物DNA分子遗传学基础综合性实验报告 - 图文

分子遗传学基础综合性实验报告

10农生一班第一组 卢** 胥** 闫**

摘要

抽取水稻叶片总DNA，利用PCR仪扩增使其总量增加，在利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测DNA的纯度与分子量，同时通过对电泳带型分析判断水稻样品是属于粳稻或籼稻。

关键词 DNA PCR 琼脂糖凝胶电泳 引言

DNA 分子标记技术的研究始于1980 年, 本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA 片段, DNA 分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA 差异, 通常也称为DNA 的指纹图谱。DNA 分子标记具有的优越性有: 大多数分子标记为共显性, 对隐性的农艺性状的选择十分便利; 基因组变异极其丰富, 分子标记的数量几乎是无限的; 在生物发育的不同阶段, 不同组织的DNA 都可用于标记分析; 分子标记揭示来自DNA 的变异; 表现为中性, 不影响目标性状的表达, 与不良性状无连锁; 检测手段简单、迅速。DNA 分子标记以其显著的优点广泛应用于动植物遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等诸多方面。

DNA微量抽取：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠（SDS）等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂。再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白变性。最后加入无水乙醇沉淀DNA；沉淀的DNA，即为植物总DNA，溶于TE溶液中保存备用。

多聚酶链式反应：多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。 1． 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2． 退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3． 延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

1 材料及方法

1.1实验材料、器具及试剂

水稻幼叶【21号、22号、27号、28号、223号、224号、249号、台中65号、IR64、9311（籼稻）、日本晴（粳稻）】

高速台式离心机，振荡器，水浴箱，1.5ml离心管架，玻璃滴管，移液器，研钵，1.5ml离心管，2ml离心管，枪头，烧杯，量筒等。无水乙醇，氯仿，异戊醇，TE缓冲液（pH8.0）,

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抽提液（200mM Tris-HCl, PH7.5; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5%SDS）

PCR仪，2ml离心管架，移液枪，1. 5ml离心管，0.2ml离心管， dNTP，Taq酶，引物一对（RM1 F，RM1 R），10×PCR反应缓冲液，灭菌双蒸水。

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉。 琼脂糖，TBE电泳缓冲液，GoldenView，载样缓冲液

1.2实验步骤

DNA提取：

① 取幼叶0.1g左右放于研钵中,加入液氮，将叶片磨成粉状，倒入1.5ml离心管中。 ②约用400μl抽提液洗涤研钵，也倒入离心管，混匀。 置于65℃水浴中30分钟。 ③ 加入800ul氯仿，振荡，充分混匀。

④12000rpm离心15分钟。取上清液于1.5ml离心管。

⑤加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置直到DNA析出。

⑥12000rpm离心5分钟，去上清液。加入70%乙醇漂洗。适当风干，溶于100-200μl TE溶液中待用。 PCR扩增DNA：

①PCR反应混合液的制备（n为样品数）

n× 0.4μl dNTP

n×2.0μl 10× PCR buffer（含15mM MgCl2）

n×0.2μl 引物F n×0.2μl 引物R

n×0.2μl Taq酶

n×16μl ddH2O 混匀

②吸取19ul混合液与PCR管中，加入1ulDNA样品，盖好盖子，混匀，立即置于PCR仪上进行扩增。

③结束反应，PCR产物放置于4℃冰箱中待电泳。 琼脂糖凝胶电泳：

①称取0.8g琼脂糖加入盛有100ml 1×TBE电泳缓冲液的500 ml三角瓶中，摇匀。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，冷却到60℃，加入10μl的GoldenView，并摇匀。

②用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。

③充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 ④用移液器吸取上次实验抽提的水稻总DNA 4μl样品于点样板小孔中，再加入5μl 1×TBE电泳缓冲液及1μl 的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10μl λDNA(HindIII酶切，30ng/ul)作为分子量标准。

⑤打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20分钟后即可观察。

⑥将凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到白色条带。根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量，并确定是粳稻或籼稻。

2 实验结果与分析

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2.1.水稻总DNA带型：

分析：

从水稻总DNA的带中看出，有部分DNA已经降解，因为当时提取DNA时没有及时进行处理，而是在冰箱中保存，一周后才进行电泳。DNA在溶液中，尤其是水的稀溶液中，会发生自然的降解作用。降解作用速率和温度关系不大，但是反复的冻融会加速DNA的断裂和降解。还有是可能因为在提取DNA是污染了DNA样品，导致DNA加速降解。 还有将样品DNA与Marker DNA作比较，可以发现样品DNA分子量较小

2.2.水稻各个样品的带型：

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分析：

从上图可以看出有不同带型，其中的序号对应的水稻样品如下： 1 2 3 4 5 27 6 7 8 9 10 IR64 11 22 12 Marker DNA 台中65 223 9311 28 249 日本晴 224 21 已知9311为籼稻品种，日本晴为粳稻品种，则可以粗略判断21号、223号、224号为籼稻品种；28号、27号、249号、22号、台中65为粳稻品种；而IR64的带型介于9311与日本晴之间，无法判定。

3 讨论

通过对水稻的总DNA进行琼脂糖凝胶电泳可知，DNA容易降解，不宜久放，即使是在冰箱里面，故DNA适于当天提取当天进行PCR扩增。在对PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳时，对得到的带进行分析，可以得到如下结果：21号、223号、224号为籼稻品种；28号、27号、249号、22号、台中65为粳稻品种；而IR64的带型介于9311与日本晴之间，无法判定。

参考文献

【1】 普通遗传学综合性实验 /刘向东,李亚娟主编.中国农业出版社，2011.7，第四章 【2】 遗传学综合实验/主编李雅轩, 赵昕，北京:科学出版社,2006

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/gvp7.html