Hoefer 双向电泳使用说明(Hoefer) - 图文

第一部分 介绍

1.0手册的介绍

这本手册分五大部分。第一部分对手册进行了介绍。第二部分介绍了样品预处理的方法。第三部分细叙了进行双向电泳第一向电泳的过程。第四部分介绍了利用IPG胶条进行第二向电泳的一般方法。第五部分讨论了双向电泳的显影和结果分析。在这里，使用Amersham pharmacia Bioteeh公司的产品进行双向电泳介绍，设备的选择我们在1、2节中介绍。

1.1 双向电泳的介绍

双向电泳是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛运用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（PI）将蛋白质分离。在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（MW）大小将它们分离。二向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。

双向电泳在1975年由P.H.OFarrel[1]和J.Klose[2]提出，在早先的技术中，第一向分离在含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶载体中进行，这种胶在狭窄的试管中灌注而成。样品放入管胶的某一端，并且在很高的电压下将它们分开。在完成等电聚焦（IEF）以后，凝胶棒从管子中取出来，在SDS样品缓冲液中平衡。随后，放在垂直SDS—聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向分离。

自从双向电泳被被提出以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认。但是，它是在最近几年被广泛应用的，由于在各方面的改进。

■ 2—D技术被改进而产生了2—D的图象，这在分辨率和重复性上有很

大提高。这项新技术是由A.Gorg和他的同事发明的。在2—D技术中，使第一向电泳得到了改进，利用固定的pH梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并且用塑料胶片支撑的凝胶条代替了柱状凝胶。在章节3.1“Background to IEF”中阐述了这种技术的优越性。

■ 快速分析蛋白的方法被改进了，从而，单个的从2D—凝胶中分离的斑

点能被很快鉴定出来。质量分光光度技术的发展能分析相当少量的蛋白质和多肽。化学微序列和氨基酸分析方法能在改良过的更少样品中使用。利用大量的有价值的抗体，免疫化学鉴定成为可能。

■ 现在可以购得更可靠的低价位的计算机及软件，从而可以用常规的方

法来对双向电泳复杂的图像进行计算评估。

■ 现在可以得到一些生物体的整个基因组，从而可以迅速地断定编码双

向电泳分离的蛋白的基因。

■ 用来与双向电泳结果进行比较的点图像数据库直接可以方便地从Intel

网上得到，并且还可以得到用来指定分离蛋白基因序列的基因组序列

数据库。

双向电泳技术在蛋白组型分析中广泛运用。分析包括对来自同一样品的蛋白质同时进行系统的分离、判定和定量。双向电泳在这方面的运用是由于它能对上千种蛋白进行分离的能力。双向电泳在鉴定后期修饰及共翻译性修饰的能力是独一无二的，这些修饰在基因组序列中不能被预测到。

双向电泳在其它方面的运用包括，细胞差异性分析、疾病标记检测、药物研究、癌研究、纯度分析以及微量蛋白纯化。

本手册对使用从Amersham Pharmacia Biotech公司购得的预制IPG胶条进行双向电泳的方法进行了描述。双向电泳的开始步骤是样品预处理。适当的样品预处理方法对得到好的双向电泳结果相当重要。双向电泳下一个步骤是IPG胶条的重新水化。购得的IPG胶条是干的，在等点聚焦（IEF）之前必须将IPG胶条在含有合适的试剂的溶液中进行水化。第一向等点聚焦是在有温度控制及高电压的条件下的平板电泳仪上进行的。接下来，为了进行第二向的分离，IPG胶条在含有SDS的缓冲液中进行平衡。平衡后，将IPG胶条放在第二向凝胶上进行电泳。最后的步骤是进行显影及对双向电泳点阵结果进行分析。

表1.双向电泳的仪器选择

第一向等点聚焦（IEF）的仪器选择

MultiphorTMII 电泳仪及ImmobilineTM 干胶设备

在膨化托盘中进行重新水化 使用固相干胶设备在MultiphorTMII电泳仪进行等点聚焦 选择因素：

■MultiphorTMII 电泳仪既可以进行第一向也可以进行第二向分离。 ■MultiphorTMII 电泳仪是多功能的，对利用IPG胶条进行等电聚焦没有限制。其它的电泳技术也可以在这台仪器上进行。

图1.MultiphorTMII 电泳仪及

ImmobilineTM 干胶设备

IPGphorTM等点聚焦系统

重新水化和等电聚焦同时能在IPGphor 胶条支撑槽中进行

选择因素

在没有人看管条件下，重新水化过程和等点聚焦可 以在晚上进行。

对IPG胶条的操作很少，减少了错误的机会。 由于电泳时电压很高，因此分离速度和效果很好。 电源的供应和温度控制都组建在设备内。

图2. IPGphorTM等点聚焦系统

表1.第二向SDS—PAGE电泳设备的选择

Multiphor II（平板系统）

24.5×11cm或24.5×18cm凝胶

选择因素

■提供了预制的凝胶：ExcelGel8-18%(24.5×11cm), ExcelGelXL(24.5×18cm)

■ 相当快的速度：电泳时间小于4小时。 ■ 分辨率高。

■ 可以使用所有类型的IPG胶条。

图3. Multiphor II（平板系统）

TM

Hoefer

TM

miniVE或SE260(mini vertical) 8×9cm凝胶

选择因素

■ 电泳速度非常快：1—2小时 ■ 用7cm IPG胶条进行电泳效果最好。

图4. HoeferTM miniVE

HoferTM SE600 (标准垂直型)14

（或16）×15cm凝胶

选择因素

■ 电泳时间4—5小时。

■ 分离的效果中等（15cm长的凝胶）。 ■ 能容纳胶的数量中等。（最多达4块胶）。 ■ 用13cm的IPG胶条进行电泳效果最好。

图5. Hoefer SE 600

Hofer

TM

DALT(大型垂直型) 24×19cm 凝胶

选择因素

■ 电泳需要7小时，一般可在晚上进行。 ■ 分辨率极高（19cm长的凝胶）。 ■ 蛋白质加样量大。

■ 能容纳胶的数量大。（能同时进行10块胶电泳）

图6. Hoefer DALT

概括起来，双向电泳的实验步骤为:

1样品的预处理

2 IPG胶条的重新水化 3 等电聚焦电泳（IEF） 4 IPG胶条平衡

5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 6 显影

7 结果分析

1.2 设备的选取

根据电泳方法和等电聚焦（IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）装置可以选择不同的设备。表1列出了可以从Amersham Pharmacia Biotech公司购得的设备。如果想要各种设备操作的详细资料，请参考各设备的使用手册。

等电聚焦设备的选择

Amersham Pharmacia Biotech提供了进行第一向电泳的两套不同的仪器：Multi-phorTMⅡ仪器及附件、IPGphorTM等电聚焦设备。

Multi-phorⅡ是一台多功能仪器，它能用来进行一些不同的电泳技术。对于双向电泳，它既能进行第一向电泳（IEF），也能进行第二向（SDS-PAGE）电泳。胶条的重新水化可以在固相干胶条再膨化盘(Immobiline Dry Strip Reswilling)内进行。重新水化后，IPG胶条被转移导电泳仪上进行第一向等电聚焦（IEF）。该电泳设备是由MultiphorⅡ平板装置和固向干胶条配套器件(Immobiline Dry Strip Kit )组成（图1）。这个设备能进行最多达十二条水化后的同样长度的IPG胶条进行任何规格的等电聚焦（IEF）。电源由EPS 350XL电源供应仪提供，MultiTempTMⅢ静热循环仪（Thermostatic Circulator）控制电泳时的温度。在IPGphor等电聚焦设备在IPG胶条上等电聚焦进行第一向的分离相当简单。IPGhor等电聚焦设备是由支撑槽和IPGphor部件组成，IPGphor的支撑槽既能用来进行IPG胶条重新水化又能用来进行等电聚焦（IEF），IPGphor部件能提供8000V的电压，并在内部安装了温度控制器。编程化的参量可以用来控制重新水化及其间的温度。等电聚焦的温度及最大电流，并且还可以控制在进行一次分离过程中各步骤及过程中电压的方式。多达12个同长度胶条支撑槽可以放在IPGphor平台进行任何一种规格的等电聚焦。由于胶条重新水化和等电聚焦（IEF）能不在使用者干预下连续进行，因此，它能在无人看管下过夜进行。其中一些对IPG胶条的操作能产生很少故障，如：胶条混淆、污染、空气接触及尿素的结晶，由于可以利用高电压，因此，分离速度非常快。表2列出了利用MultiphorⅡ设备和IPGphor等电聚焦设备在第一向电泳中的主要区别。

表2. 等电聚焦设备选择 最大电压

MultiphorⅡ

3500V

②

需要的附件设备

固相干胶膨化盘

固定干胶配套器件（Figure 1）

EPS350XL电源供应仪 MultiTempⅢ静热循环仪

IPG胶条支撑槽

等电聚焦的时间（IEF）

3—48小时

①

IPGphor

8000V 1.5--24小时

① 最佳的聚焦时间依赖于IPG胶条的长度及pH值的范围和样品的特性，进行相同的分离，IPGphor设备比MultiphorII设备快2倍。

② 出于安全原因，很高电压的是不可取的。

第二向电泳的设备选择

第二向电泳分离既可以在平板设备上进行也能在垂直设备上进行。表3提供了合适于第二向电泳的设备及胶的大小和于之相匹配的IPG胶条的长度，进一步的考虑因素在下面将讨论。

表3.第二向电泳设备选择

凝胶的近似

大小 （长×宽cm） 平板型

MultiphorII ExcelGel 垂直式

Hoefer miniVE或 SE260 Hoefer SE600 Hoefer DALT

1 在一片ExcelGel凝胶上，同时使用较短的胶条：两条11cm胶条或3条7cm胶条 2 若 使用1CM 宽度的空间

3 利用附加的分隔板，能容纳四块凝胶

凝胶数量

凝胶厚IPG胶条长度 度 （mm） （cm） 0.5

全部

总的电泳时

间 （h:min）

1:45 3:20 1:30 5:00 7:00—15:00

24.5×11 24.5×18

1

①

8×9 14×15

②

16×15 24×19

2 2或4 10

③

1,1.5 1,1.5 1,1.5

7 11,13 18

MultiphorII平板型设备

利用这种设备在大尺寸的凝胶上进行电泳能产生很好的分辨率，并且分离的速度相当快。

预制的ExcelGel凝胶产品为随时可用的凝胶和缓冲胶条提供了方便性。

MultiphorII（figure3）设备使用起来很方便，它是多功能的，同时可以进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）。

IPG 胶条中带有的蛋白质量能超出薄且水平的第二向电泳中的凝胶。因此在进行微量预备分离中，往往利用较厚垂直的第二向凝胶。若在进行第一向电泳

中，使用PH值范围为6—11的IPG胶条，一般不建议使用MultiphorII设备进行第二向电泳。

垂直型的设备

垂直型的设备使用起来相当方便，并且能同时进行多块胶的分离。垂直型的第二向凝胶既可以是1.5mm厚度又可以是1.0mm厚度。为了迅速起见，建议使用微型凝胶（Mini—Gel）电泳仪器——Hoefer miniVE（图4）或SE—260。这样，第二向电泳分离一般在1—2小时内能完成。如果要快速取得粗略的蛋白质情况或当样品中只有几种不同蛋白时，使用微型凝胶（MINI—GEL）进行第二向电泳是可取的。为了提高分离的分辨率和效果，建议使用标准规格的Hoefer SE600垂直型电泳设备。Hoefer SE260同时能容纳4块16cm长的凝胶。当与静热循环仪如MultiTEMPIII一起使用，内建的热量转换装置能起到降温作用，从而能提高分离的重复性。使用14cm宽度的凝胶，标准的垫片宽度为2cm。如果想利用在13cm IPG胶条两端的用来进行分子量标记的额外空间，使用1cm宽的垫片能进行16cm宽的凝胶的电泳。 为了得到最好的分辨率、重复性和提高样品容量，建议使用Hoefer DALT设备的大型凝胶类型。Hoefer DALT设备能容纳所有梯度的18cm的IPG胶条（加上分子量标记），并且最多能达10块凝胶同时跑电泳。一个内置的热量交换器和缓冲液循环泵能提供稳定的温度环境和对温度精确的控制。在Hoefer DALTMultip胶模中能同时浇注20或更多块的1—1.5mm厚的凝胶。

1.3实验室技术

? 在处理IPG胶条、SDS聚丙烯酰胺凝胶、ExcelGel缓冲胶条以及任何要

接触的仪器时，请戴上手套。使用手套能减少杂点和条带的污染。

? 将所有的器件用清洗玻璃器皿的去污剂清洗，并且用大量的蒸馏水冲洗。 ? 经常使用高纯度的试剂及蒸馏水。

第二部分 样品的预处理

2.0样品预处理一般方法

为了得到双向电泳最佳的结果，适当的样品预处理是相当重要的。由于样品和原始材料的种类繁多，在这里只对样品预处理的一般方法进行介绍。最佳的对各种类型的样品预处理方法必须通过经验来决定。若样品预处理能使样品中的蛋白质完全地溶解、分离、变性以及还原，那是最理想的。

当选用某种样品预处理方法时，对双向电泳要达到最终怎样结果有个清晰的把握是相当重要的。是否最终结果要尽可能地看到更多的蛋白质，还是仅仅想看到样品中感兴趣的蛋白质。额外的样品预处理能提高电泳最终结果的质量，但它能够使一些选择性的蛋白丢失。在这里应充分考虑提高样品质量和对样品进行完全的蛋白质预处理之间的相互关系。为了在复杂的蛋白混和物中辨别出特定蛋白，那些感兴趣的蛋白在电泳条件下必须是完全溶解的。溶解不同种类的蛋白样品应采用不同的条件和措施：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其它蛋白质形成复合物；一些蛋白质形成各种非特异性的集合体；一些蛋白质当离开它们一般条件时就沉淀了。溶解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质溶解和浓缩的方法、去污剂的选择以及样品溶液的成分。在处理某种样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离可能不能完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。为了对细胞内蛋白作完全分析，细胞必须进行有效的破碎。细胞破碎方法的选择，依赖于样品是否来源与细胞、坚硬组织或其它生物材料以及是否要分析细胞内所有蛋白质或仅仅是细胞内小小的一部分。在2.1节中既介绍了缓和的破碎方法又介绍了剧烈的破碎方法。在细胞破碎过程中，蛋白酶也可能被释放出来。蛋白质的水解增加了双向电泳结果分析的难度，因此在细胞破碎和随后的预处理中，样品必须防止被水解。在2.2节中，讨论了蛋白酶的抑制方法。

如果只对组织或细胞中的一部分蛋白感兴趣，在样品预处理过程中可以采取预先分流的方法。如果想要分析的蛋白质来源于细胞器（细胞核、线粒体、原生质膜），感兴趣的细胞器应为进行双向电泳而进行蛋白质溶解之前采取差速离心或其它方法进行纯化。在进行双向电泳之前，样品可以在不同的抽提条件下利用溶解性进行预分流。参考资料[8，9]讲述了利用这种方法对样品进行处理。参照资料[10]可以获得蛋白质分流的相关主题。

样品中蛋白质沉淀和干扰物质去除是任选的步骤。是否采用这两步依赖于样品的自然属性和实验的最终结果。沉淀步骤在2.3节中介绍，它可被用来浓缩样品，也能被用来将蛋白质从潜在的干扰物中分离。除杂技术在2.4节中讲述，它可被用来减少来自样品的污染。如果，这些样品中的污染物不被除去，污染物有可能存在于双向电泳的最后结果中，这些污染物有盐离子、小离子分子、离子去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物。

通常对样品的处理越简单越好，举例来说，低蛋白质浓度高盐浓度的样品能按常规的方法分析和稀释，或去盐，然后利用冻干的方法将其浓缩，或利用TCA和预冷的丙酮将其沉淀，然后用重水化溶液将其再溶。一般用重水化溶液简单地对样品进行稀释可能足够了。若蛋白质浓缩存在问题或干扰物质干扰问题不能克

服，有必要使用蛋白质沉淀和除杂技术。

样品溶解液的成份对双向电泳极为重要，因为对第一向电泳而进行的蛋白质溶解处理必须既不影响蛋白质的pI值，也不能使蛋白样品存在于高传导性溶液中。通常，高浓度的尿素和一种或多种去污剂同时使用。样品溶解液在2.5节中进行探讨。

常规样品处理原则：

1．使样品处理的方法尽量简单、尽量避免蛋白质丢失。额外的样品处理能提高双向电泳最终结果的质量，但是有可能以丢失选择性蛋白为代价。

2．细胞破碎的方法必须以最小限度地减少蛋白质水解和其它形式的蛋白降解为原则，细胞破碎有可能的话可在低温进行，并且减少破碎过程中热量的产生。理想的情况是，细胞破碎应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行。 3．样品溶解液是新配制的或在冰冻情况下储存，使用高纯度或去离子的尿素。 4．通过在等电聚焦（IEF）之前处理样品或将样品冰冻在-80℃冰箱内保存来保持样品的质量，避免使样品暴露而反复熔化。

5．通过超离心方法除去所有颗粒物，固体的小颗粒必须除去，因为它们能堵塞凝胶的孔隙。

6．为了防止蛋白质被修饰，不要在加入尿素时加热。当样品中存在尿素时，不要将样品处于37℃以上的环境中。提高温度能使尿素转化为氰化物，它能对蛋白质进行修饰。

7．为了得到关于为使用IPG胶条而准备样品方面更多的资料，请参照[11-13]。

2.1 细胞破碎的方法

在表4和5中列出了标准的细胞破碎的方法，包括破碎技术和所用的化学方法。细胞破碎必须在低温下进行。可能的话将样本放在冰块上并且利用预冷的溶液。如果这些方法被使用时，在细胞破碎过程中蛋白酶有可能被释放出来，因此，蛋白样品能防止被水解（参考2.2节）。直接将样品在高强度的变性裂解液中进行样品的破碎是可取的。这样能使蛋白水解酶迅速失活，并且也能使其它一些修饰蛋白的反应抑制。细胞的破碎往往在合适的能对感性趣的蛋白溶解的蛋白溶解液中进行。参考资料［4－5］，包含了常规组织破碎方面的信息。 2.1.1常规细胞破碎方法

当感兴趣的样品是由易于溶解的细胞组成的（组织培养细胞、血细胞以及

一些微生物），就用柔和溶解细胞的方法来破碎样品，这种方法在表4中列出。

表4 柔和破碎细胞的方法

细胞破碎的方法

渗透溶解

这是一种非常柔和的方法，非常适用于被溶解样品降解成小细胞成分。

冻熔法

许多种类的细胞通过对其进行一次或反复地快速冻结随后化冻的方法来降解。 去污剂溶解法

去污剂能溶解细胞的细胞膜从而降解细胞并释放内含物。

适用材料

血细胞

组织培养细胞

细菌细胞 组织培养细胞

组织培养细胞

一般过程

将细胞悬浮在低渗透液中。

利用液氮将细胞迅速冻结后迅速化冻。如果需要，可反复进行。

将细胞悬浮在含有去污剂的裂解液中。

细胞往往可以直接在样品溶液或重新水化液中裂解，因为它们含有去污剂。参照附录（溶液A），提供了常用的裂解液的配方。如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确保不干扰IEF，可以选择以下的步骤之一：

■ 将裂解的样品在含有过

量的非离子或两性去污剂的溶液中稀释。

■ 利用丙酮沉淀法,使SDS

从样品中除去。（参表7，8和2.5 ）

在等渗透液溶液中用酶处理细胞。

酶溶解法

带有细胞壁的细胞可以用酶降解法除去细胞壁。这种方法的进行要有一种能降解被降解细胞的细胞壁的酶。

植物组织 细菌细胞 真菌细胞

当只有一种特定的亚细胞成分（细胞内成分）要分析时，也可以用柔和的破碎方法。例如，选择反应的条件，只释放细胞质蛋白，或那些未接触的线粒体或其他的细胞器通过差速离心的方法也可取得。有时这些方法混合使用。 2..1.2 剧烈的破碎方法

表5中列出了剧烈的破碎方法，当细胞不太容易破碎时可以利用这些方法来

破碎，如硬组织中的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞。剧烈的破碎法能彻底的破碎细胞，但是要避免在此过程中产生热量和泡沫。

表5：剧烈破碎法

细胞破碎方法

适用材料 一般步骤

短时间冲击细胞悬浮液避免产生热量，在超声波冲击过程中将样品放在冰上制冷

超声波破碎法 细胞悬浮液 通过超声波发生器产生的超声波的剪切力将细胞破碎。当达到最大的振幅时，剪切也越完全，但必须注意减少热量的产生和泡沫的形成。 法式压破细胞

在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细胞。 研磨法

一些类型细胞将它们放在研钵中利用碾槌手工能将它们打开。 机械粉碎法

许多设备能用来进行组织的机械粉碎。手工操作的粉碎机（如 Dounce或Polfer-Elvehjem）能够用来破碎细胞悬浮液或相当柔软的组织。 搅拌器或其它的电带动的设备能用来处理大的样品，样品粉碎很迅速并且对蛋白质很安全，除了在粉碎过程中一些蛋白酶的释放。 滚珠粉碎法

旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物。

带细胞壁的微生物

将细胞悬浮液放入预冷的法式压力室中，施加压力并收集被挤出的破碎样品。

组织和细胞用液氮冷冻，并将它们反复研磨成精细的粉末，加入石英和细沙有助于研磨。 如果需要，将组织切成薄片加入粉碎缓冲液(组织的3-5倍)，迅速进行粉碎。利用过滤器或离心的方法将粉碎物澄清。

固体组织 微生物 固体组织

细胞悬浮液 微生物

将细胞悬浮在等体积预冷的破碎液中，并转移到一支坚硬的试管内。每克湿细胞中加入1-3克预冷的玻璃珠，旋转液体一分钟并且在冰上冷却一分钟，这样重复2-4次。

2.2 防止蛋白质水解

当细胞被破碎后，蛋白水解酶就被释放出来或被激活。在蛋白质变性过程中，

伴随着蛋白水解作用，使双向电泳最后结果复杂化，因此，必须采用一些方法来避免这些问题。如果有可能的话，直接将样品在强浓度的变性液中变性（8M尿素、10%TCA、或2%SDS）来抑制蛋白酶。在低温的时候，蛋白酶的活性低，因此，建议在样品预处理时尽可能地在低温下进行。此外，许多蛋白酶在pH 9以上就失活了，因此，Tris-碱、碳酸钠或含碱基团的载体两性电解质存在的条件下往往能抑制蛋白水解。

单独使用这些方法来抑制蛋白水解已足够了，然而有些蛋白酶甚至在这些条

件下仍然保持着活性，在这种情况下应当使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此，建议复合使用蛋白酶抑制剂，在商界能得到很多种类的蛋白酶抑制剂。表6提供了常用的抑制剂及抑制的蛋白酶。请参照［12，28，36-40］获得关于蛋白酶抑制的更多方面知识。

表6蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂

PMSF

相当常用的抑制剂，使用浓度为1mmol/l。

有效的抑制的酶

PMSF是不可逆抑制剂，能抑制：

■ 丝氨酸水解酶。

■ 一些半胱氨酸水解酶。

使用范围

PMSF在含水溶液中很快失活，在使用前现配。

PMSF在含有巯醇类试剂（DTT或2-去巯基乙醇）时效果不好。这种缺点可以克服，通过将样品在含有PMSF缺少巯基醇类的去污剂溶液中破碎。含巯基类去污剂可以在最后步骤加入。PMSF毒性相当大。

AEBSF具有修饰能力，能潜在改变一种蛋白的PI值。

AEBSF

使用浓度为4mmol/l。

AEBSF在抑制行为上与PMSF相仿,但它更易溶于水并且毒性低。

1mM EDTA,1mM EGTA 这些混合物能抑制金属蛋通常在1mmol/l浓度使用。 白，通过螯合蛋白酶维持

活性所必需的金属离子。 多肽水解蛋白酶抑制剂 这些抑制剂是： ■ 不可逆抑制剂。

■ 在有DTT存在下起活性。

■ 在不同条件下低浓度进行反应。

使用浓度2-20μg/ml。 TLCK,TPCK

(对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮,苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮)

使用浓度0.1-0.5mmol/l。 Benzamidine

使用浓度1-3mmol/l。

亮抑蛋白酶（Leupeptin）能抑制许多种类的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。

抑胃酶（Pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶。

Aprotinin能抑制许多丝氨酸蛋白酶。

苯丁抑制剂（Bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。 这两种相近的化合物不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶。

多肽蛋白酶抑制剂价格昂贵。 多肽蛋白酶抑制剂是小分子多肽，因此有可能在双向电泳结果中出现，根据其分子大小范围被第二向凝胶分离。

抑胃酶（Pepstatin）在PH为9时不能起抑制作用。

Benzamidine抑制丝氨酸蛋 白酶。

表7 沉淀过程（程序） 沉淀方法 一般程序 硫酸氨沉淀法

在存在高浓度盐时，蛋白质有可能结合起来并从溶液中沉淀出来，许多种潜在的污染物（核酸）将会遗留在溶液中。 TCA沉淀

TCA是一种相当有效的蛋白质沉淀剂。

在含有EDTA的缓冲液中（>50mM）处理蛋白质，最终蛋白浓度大于1mg/ml。慢慢地将硫酸铵加入，至饱和液中并且搅拌10-30分钟，利用离心将蛋白质分离。

在浓缩液中加入TCA，使之最终浓度为10-20%，并且在冰浴中沉淀30分钟。也可以将组织直接在10-20%的TCA中粉碎，这种方法可以限制蛋白质水解和其他蛋白修饰作用，离心并用丙酮或乙醇洗去残留的TCA。

在浓缩液中加入3倍体积的预冷丙酮，使蛋白质在-20℃条件下沉淀2小时。用离心法收集蛋白质，通过空气干燥法或冷冻干燥除去残留的丙酮。

将破碎或破解完的样品悬在含有20mmol/lDTT或0.07%巯基乙醇的10%TCA溶液中。在-20℃条件下沉淀蛋白质45分钟，用离心方法收集蛋白，并且用含有0.07%巯基乙醇或20mmol/lDTT的预冷丙酮溶液清洗。通过空气干燥法或冷冻干燥除去残留的丙酮。

样品中的蛋白能被抽提进入水或缓冲液饱和酚溶液中，在酚阶段利用含有0.1mol/l的乙酸胺的甲醇溶液沉淀蛋白质，用含有乙酸氨的甲醇溶液清洗沉淀几次，然后用丙酮清洗，将残留的丙酮蒸发掉。

使用范围

许多的蛋白质仍然留在高盐浓度的溶液中，若想得到所有蛋白质，这种方法不可取。然而它可以用来进行预分离和蛋白质富集。残留的硫酸铵能影响等电聚焦，因此，必须除去有关盐离子，参照2，4节的方法。 蛋白质可能很难再溶或完全不能再溶。用丙酮或乙醇将残留的TCA充分洗净。

长时间地将样品暴露于这种低pH值溶液中，能引起蛋白质降解和修饰。

丙酮沉淀法

这种有机溶剂常用来沉淀蛋白质。许多有机溶剂污染物（去污剂，酯类）残留在溶液中。 丙酮、TCA沉淀蛋白 在双向电泳样品预处理过程中 ，往往用TCA和丙酮的混合物来沉淀蛋白，这种方法比单独使用TCA或丙酮效果好。

蛋白质可能很难重新溶解或完全不能重溶。

长时间地将样品处于这种低pH值的溶液中能使一些蛋白变性或修饰。

乙酸胺、甲醇溶液沉淀蛋白质并且用酚抽提

这种方法在处理含有高水平的干扰物质的植物样品中被证明是有用的。

这种方法很复杂并很费时。

2.3 蛋白质沉淀过程

进行双向电泳过程中，蛋白质沉淀是任选的步骤。蛋白质沉淀被用来从污染杂质（如盐，去污剂，核酸，酯等）中有选择性地分离蛋白质，这些污染杂质否则能影响双向电泳的结果，此后再将沉淀物溶在样品液中。这种方法也能从稀浓度来源液（植物组织，尿）中浓缩样品。没有一种沉淀方法是十全十美的，有时一些蛋白质沉淀后不能在随后的样品再溶中溶解。因此，在样品预处理中使用沉淀方法有可能改变样品蛋白的成分。如果双向电泳想要完全和精确地得到样品中的蛋白质，避免使用沉淀和复溶的方法。表7列出了一些可用的沉淀方法。若在样品处理中要使用蛋白质沉淀方法，一般只用一种沉淀方法。参考［14，15。41］来获得更多的蛋白沉淀方法。

2.4 除去影响双向电泳结果的污染物

在样品中的非蛋白杂质能够影响蛋白质分离和随后的双向电泳结果的显影。

因此，样品预处理时可包含几步来除去这些杂质。表8列出了影响双向电泳结果的物质以及除去的方法。参考资料［12］给出了对去除干扰物质的进一步探讨。

表8 影响双向电泳的污染物 污染物 除杂原因 残留在缓冲液中的盐，和其它带电小分子。这些物质是由样品预处理过程中残留下来的。

盐能使电泳混乱，因此必须除去，或尽可能地使其保持较低浓度。

IPG胶条中的盐能增加胶条的导电率。在离子移到胶条的两端前，蛋白质聚焦将不能发生，这样延长了等电聚焦所需时间，也能引起水的流动，从而使胶条的一端保持肿胀状态而另一端则干燥的状态。在胶条中的盐能引起胶条两端很大一块区域内蛋白没有聚焦。若要将样品在IPG胶条重水化时加样，重水化液中的盐浓度应当低于10mmol/l。 若样品在样品杯中加样，在样品中高达50mmol/l的盐浓度是可以容忍的，然而，由于蛋白质迅速向低盐浓度的区域移动，在样品加样点蛋白质有可能发生沉淀。

在任何样品溶解液中都存在着内部带电小分子。这些物质往往带有负电荷，在阳极端能引起蛋白聚焦不完全。 离子去污剂（通常SDS）常常在蛋白质提取和溶解过程中使用，但是对等电聚焦的影响特别大，除非SDS除去或将SDS分离。SDS能与蛋白质复合，并产生带负电荷的复合物，不能正常的聚焦。

除杂技术

可以通过下列方法除盐： ■ 滤膜渗析 ■ 旋转膜渗析 ■ 凝胶过滤 ■ 沉淀/重溶法

滤膜渗析法是相当有效的除盐方法，样品的损失量小。然而，这过程需要大量时间并且需要样品体积较大。旋转膜渗析法速度较快，但存在着渗透膜吸附蛋白的问题。旋转膜渗析法可以在加尿素和去污剂前进行。

凝胶过滤是可取的，但往往产生蛋白丢失。

沉淀/重溶法是除去盐和其它污染物相当有效的方法，但它能产生蛋白丢失。

内部的带电小分子

丙酮/TCA沉淀法对除去这些物质相当有效，也可以利用其它去盐技术。

在含有两性电解质或非离子去污剂（CHAPS、Tritonx-100、或NP-40）的重水化液中稀释含有SDS的样品直至最终SDS浓度为0.25%或更低，并且使其它的去污剂和SDS的比例为8：1［24］。 丙酮沉淀能部分除去SDS。

在室温下沉淀能除去大部分的SDS但蛋白沉淀在-20℃更彻底。 富含核酸的样品用不含蛋白酶的DNase/Rnase混合物使核酸降解成单个核苷酸或寡核苷酸。在样品中加入0.1倍体积的含1mg/ml DnaseA，0.25mg/ml RnaseA和50 mmol/l的MgCl2溶液，并进行冰浴。 注意：DNase和RNase蛋白有 可

离子去污剂

核酸（DNA，RNA）

核酸能增加样品的粘度，并且

能产生背景污染。高分子量的核酸能堵塞凝胶孔隙。核酸能与蛋白质通过静电反应的结合，阻碍聚焦。若将分离的样品用银染，核酸也能被染色，这样在第二向胶产生背景污染。

污染物 除杂原因 除杂技术

能在双向电泳谱相中出现。

超离心技术能将大分子的核酸除去，然而这种方法也能使大分子量的蛋白质除去。

在使用低离子强度抽提条件下，带负电的核酸有可能与带正电的蛋白质形成复合物。强离子强度或高PH值的抽提液能减少这种反应。

脂类（lipids）

许多种蛋白质，尤其是膜蛋白能与脂类结合，这样既能降低可溶性又能影响PH值和分子量，脂类与去污染剂成复合物，在作为蛋白质促溶剂时，能降低去污剂的作用。

当将富含脂类组织抽提液进行离心时，往往能看到脂层，很难被除去。

酚类化合物存在于植物组织中，并且通过催化酶氧化反应能修饰蛋白质。

高强度的变性条件和高浓度的去污剂能减少蛋白质一—脂反应。过量的去污剂是必要的。

利用丙酮沉淀法能除去一些脂类。

在组织液提取过程中，可以利用还原剂来防止酚类氧化物（DTT，巯基乙醇等）。

利用沉淀技术能迅速将蛋白质从酚类化合物中分开。

可以利用抑制剂来抑制聚酚类氧化。（如Thiourea、Diethyldith Iocarbamic Acid）

利用PVP或PVPP吸附剂的吸附将酚类化合物除去。

在进行第一向等电聚焦（IEF）前用离心法将样品纯化。

酚类化合物

(Phenoclic lompounds)

不溶物质

不溶物质能堵塞凝胶空隙，使聚焦质量下降。当使用样品杯加样时，不溶物质尤其是个问题，它能阻碍蛋白质进入IDG胶条。

2.5 样品溶液的组成

为了取得聚焦好的第一向分离，样品蛋白必须充分相互分开，并完全溶解。不管样品是否用相当粗的破碎方法或使用了额外样品沉淀过程，样品溶液必须含有某些成份，确保在进行第一向等电聚焦（IEF）前，使样品完全溶解和变性。这往往包括尿素以及一种或多种去污染剂。在附录中的细胞降解液中（溶液A）含有尿素和两性离子去污剂CHAPS，发现对许多种类的样品具有很好溶解作用。还原剂和IPG缓冲溶液经常被加入到样品溶液中，以提高样品的溶解度。

在变性条件下，进行等电聚焦（IEF），能得到最好的分离和最清晰的结果。尿素是一种中性的促溶剂，在双向电泳的第一向中被用作变性剂。在双向电泳第一向样品溶液中经常含有尿素，其浓度为8mol/l。尿素能使许多种蛋白溶解并舒展开来形成完全随机的结构，所有的离子基团暴露在溶液中。除了尿素、硫脲最近被发现能提高蛋白质的溶解度，尤其是膜蛋白。

为了确保样品的完全溶解和防止通过疏水反应而使蛋白质相互结合，在样品溶液中往往包含非离子或两性去污剂。原先使用NP-40和TRITOX-100这两种相尽的非离子去污剂。后来的研究证明，两性去污剂CHAPS的效果更好。非离子或两性去污剂使用的浓度达4%。

当使样品完全溶解发生困难时，阴离子去污剂SDS能被用做促溶药剂。SDS是一种相当有效的蛋白质促溶剂，但它由于能与蛋白质形成复合物并且带负电性，在双相电泳中，不能只使用这种去污剂来溶解样品。普遍使用的用来消取SDS干扰的方法是将样品在含有过量的CHAPS 、TRITOX-100或NP-40的溶液中稀释。最终SDS的浓度为0.25%或更低，过量的去污剂和SDS的比例至少为8：1[24.31、55]。

为了打断二硫键，并且使所有蛋白质处于还原状态，在样品溶液中往往加入还原剂。经常使用的还原剂为DTT，使用浓度为20—100mmol/l之间。DTE与DTT相近，也能用作还原剂。原先，巯基乙醇被用作还原剂，但是需要高浓度的还原剂，所以内含的杂质可能引起污染。最近，非硫类还原剂（tributylphosphine）被用作双向电泳的还原剂，使用浓度为2 mmol/l.[57]

载体两性电解质或 IPG缓冲液[达2%（ w/v）]能够被包含在样品溶解液中。通过电荷与电荷之间的反应减少蛋白质结合来增加蛋白质的可溶性。

样品在离心和随后的处理之前，应当将样品保留在样品溶液中在室温下维持1小时，使之充分变性和溶解。在有去污剂存在的样品，加热能促进样品的溶解，但是，只有在加入尿素之前才能加热，因为存在尿素时对样品加热，能在蛋白中插入电荷而使蛋白修饰。超声波能加快蛋白质溶解，尤其是来源于那些相当难再悬浮材料的样品。

广泛使用的样品溶解液是裂解液，在附录（溶液A）中给出。为进一步了解双相电泳蛋白溶解方面的材料请参考[12]。

第三部分 第一向等电聚焦

3.0 第一向等电聚焦概况

Amershum Pharmacia Biotech公司提供了进行第一向电泳分离的两套不同设备：MutiphorⅡ设备及附件和IPGPhor等电聚焦设备。两种设备对照在1.2节中给出。

进行一次有价值的第一向分离，需要选择适合于样品也适合于样品加样的pH值范围。固相PH梯度选择在3.2 节中介绍，样品加样的方法和这些方法的选择在3.3节中介绍。

第一向分离过程包括IPG 胶条的重新水化，加样和等电聚焦。IPG 胶条的重新水化液制备在3.4节中介绍。IPG胶条的重新水化，加样和等电聚焦规则在 3.5中描述，这些规则只适合于第一向电泳设备。其中3.5节主要讲述 MutxtiphorⅡ设备的规则，3.6节讲述 IPGPhor等电聚焦设备。

3.1 等电聚焦的背景

等电聚焦（IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子；它们整个分子要麽带有正电或负电，要麽不带电，这依赖于环境的pH值。整个蛋白质分子的带电量取决于组成蛋白质的氨基酸的侧链及碳端和氮端所有电荷总合。等电点是一个特定的pH 值，此时整个蛋白质分子的带电量为零。蛋白质在环境pH值低于pI时带正电，而高于pI值时带负电。若将蛋白质分子所带电量与环境PH值作图时，结果曲线在等电点处横截横坐标。pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在PH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所带电荷为零的点移动。蛋白质若所带电荷为正，则它向阴极移动，在它到达pI点位置之前在它们通过PH 梯度时，其所带的正电荷会逐渐减弱。带负电的蛋白质则要向阳极移动，所带的负电荷会逐渐减弱直至为零。如果蛋白质偏离等电点，其立即带上电荷而返回等电点的位置。这就是等电聚焦(IEF)的聚焦效果，能将蛋白质在其pI点上浓缩及分开。并根据所带电荷微小的差异，能将蛋白质分离。

分离的程度取决于pH梯度和电场强度。因此，等电聚焦(IEF)是在相当高的电压下进行的（一般超过1000V）。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时，在整个体系中很少有离子的移动，从而使最终电流很低（往往低于mA）。给定样品在给定电泳体系中进行等电聚焦，一般要经过几个连续的电压时（电压时是在该点电压时，电压与电泳时间的乘积）。

等电聚焦在变性条件下进行，能产生很高质量的分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单分子存在，并且减少结合和分子间的相互作用。

原先的第一向等电聚焦依靠载体两性电解质在聚丙烯酰胺管胶内产生的pH梯度将蛋白质分离。[1，2]载体两性电解质分子非常小，易溶，在它们的PI值附近有很高的缓冲能力。商品化的载体两性电解质混合物是由在特定pH值跨度上具有等电点（pIs）的上百种单独的聚合物组成。当电压加到载体两性电解质混合物上时，低pI值的载体两性电解质向阳极移动，高pI值的则向阴极移动，其它的载体两性电解质根据它们的pIs值分别分布在这两极端之间，并且使其周围环境缓冲在相应的pH值上。结果产生连续的pH梯度。

尽管这种基础的方法被用于上百种双向电泳的研究，但具有一些限制它们更广泛使用的局限性：

■载体两性电解质是混合的多聚物，很难被很好第定性，并且受到批与批之间生产上的变动。这些变动降低了第一向分离的能力。 ■载体两性电解质pH梯度不稳定，并且具有漂移的趋势，在电泳过程中往往向阴极漂移。通过电泳时间变化，梯度漂移反过来能影响电泳的重复性。梯度漂移也能在pH梯度两端形成pH梯度消失而使pH值均匀，尤其是pH值高于9时，从而使在pH值两端使双向电泳技术失去作用。

■柔软的聚丙烯酰胺管胶的机械稳定性低。胶棒有可能被拉长或断裂，从而影响电泳的重复性。电泳结果好坏往往依靠操作者的熟练程度。

由于载体两性电解质梯度技术的局限性，一种可替代的pH梯度形成技术被发明了：固相pH梯度或IPG。这项技术在1982年由Biellqvist及其他成员所创的。在凝胶灌注时，将酸性和碱性的缓冲基团与聚丙烯酰胺凝胶形成共价结合而形成IPG。缓冲剂，被称作丙稀酰胺缓冲剂（Amershum Pharmacia BiotechimnmobilimeTM试剂），是一组易定性的分子，每一个丙稀酰氨单体都连

接着单个的酸性或碱性缓冲基团。它们的一般结构如下：

CH2=CH-C-NH-R R R=弱酸性或碱性缓冲基团

固相pH梯度是由使用两种溶液形成的，一种包含一种相关的酸性的丙稀酰胺缓冲剂混合物另一种包含相应碱性的混合物。在两种溶液中不同缓冲剂的浓度决定着pH梯度的范围和状态的形成。两种溶液都含有丙稀酰胺单体和催化剂。在聚合过程中，丙稀酰胺缓冲剂的丙稀酰胺部分与丙稀酰胺和双丙稀酰胺单体聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。图8是聚丙烯酰胺基质与缓冲基团结合的图示。

为了提高工作效率和简化处理，IPG凝胶浇注在塑料支持物上。随后洗去凝胶上的催化剂和没有聚合的单体，这些物质不仅能修饰蛋白而且能影响分离。最后将胶干燥并切成3mm宽的胶条。最终的IPG胶条能够用含有等电聚焦所必需成份的重新水化液重新水化。

等电聚焦（IEF）使用IPG胶条在平板电泳仪上水平进行。使用平板形式进行电泳有如下优点：

■等电聚胶需要有效的降温来控制严格的温度，在连接有静热循环仪或Peltier冷却盘水平的瓷性冷却盘能很容易达到要求。

■等电聚焦需要高强度的电场来得到精确的聚焦条带，因此必须使用高电压。平板式设计是最经济的方法，在如此高压下能达到足够的安全标准。

A.Gorgetal.[3.4]是使用IPG胶条进行双向电泳的第一向电泳的创始者，这本手册中的一些规则大部分建立在A.Gorg和她的同事的工作之上的。IPG胶条在含有必需成份的重水化液中重新水化，并且也可能含有样品蛋白。（重新水化液在3.4节中详细介绍）等电聚焦是在贯窜IPG胶条电压逐渐增加的情况下进行的，最终至少也得达到3500V，并且维持这个电压至少几千电压时。等电聚焦以后，IPG胶条在平衡液中平衡，随后安装到平板的或垂直的SDS—聚丙烯酰胺凝胶上。当IPG胶条被用来进行第一向分离时，在分离效果与重复性上，双向电泳都很优秀。IPG胶条比用载体两性电解质产生的pH梯度具有明显的改善：

■第一向电泳的重复性好，因为共价形成的梯度不能漂移。

■具有塑料支撑的IPG胶条易于处理，可以用镊子或着戴手套用手指直接从

任何一端将它们拿起。

■由塑料支撑的胶片可以防止凝胶的拉伸或折断。

■在任何单条IPG胶条上，IPG技术能增加有用的pH范围。这样可以分离更多种类的碱性和酸性蛋白。

■IPG胶系能容纳更多的蛋白样品。[59]

■样品能在IPG胶条重新水化的过程中加入。[60，61]

■预先浇铸好的IPG胶条可以从Amersham Pharmalia Biotech公司购得。这些预先制好的干IPG胶条省去了对有毒的丙烯酰胺单体的操作，制备的时间和精力明显下降了。并且pH梯度的重现性得到了保障。

3.2固相pH梯度选择

可以从Amershampharmaia Biotech公司购得pH值梯度在4—7L（线性），6—11L（线性），3—10L（线性）和3—10NL（非线性）的预制IPG胶条（固相pH干胶条，Immobiline Drystrip gels）。可得到的胶条长度为7，11，13和18cm，pH3—10L胶条在pH3—10之间具有线性的pH值梯度。pH3—10NL胶条具有一个粗略的象S型的梯度，这样在pH5—7之间，电泳效果得到明显改进。若需要特定的pH值梯度，在[62]中给出了准备一般宽窄的固定pH梯度（immobiliztd pH gradients）的方法。

pH3—10的IPG胶条能够在单块双向凝胶上显示最广的蛋白质分布。较窄的pH分布范围能很好分离特定pH范围内的蛋白。

3.3加样方法的选择

样品既能通过将它放入重新水化液中，也能利用样品杯或上样槽直接在水化后的IPG胶条上加样。一般往往喜欢将样品放入重新水化液中将样品加入到IPG胶条上。（参照3.4节）利用这种加样方式的优点如下：

■这种方法能使大量的蛋白进行加样和分离。 ■这种方法能用很稀的样品进行加样。

■由于没有分离的加样点，这种方法消除了当样品利用样品杯加入时在该点产生沉淀的现象。

■这种方法在技术上是简单的，可以避免使用样品杯时可能产生的渗漏问题。 当然了，有些也有在等电聚焦（IEF）前在重新水化后立即加样的，这是有原因的：

■若存在着蛋白水解或其它蛋白的修饰问题，与样品一同过夜进行重新水化是不可取的。

■当样品利用样品杯或样品槽加样时，在pH6—11L IPG胶条上将样品加在阳极，往往能得到较好的结果。

使用MultphorⅡ和固向干胶条设备的在重新水化后加样的方法在3.5.2D节中给出。样品加入到精确固定在IPG胶条表面的样品杯中。通过加样杯，每条胶条能加多达100 μ l的样品。

重新水化后利用IPG Phor设备加样的方法在3.6.3节中给出。样品加入在位于两端的加样槽中，能在两端分别加入多达7.5μl的样品溶液。（若两端的所在槽都使用，每个样品槽加15μl，那么总共能加30μl的样品。）

3.4 IPG胶条重新水化溶液

IPG胶条在进行IEF前必须重新水化。若利用MultphorⅡ设备进行IEF，IPG胶条在固相干胶条膨胀托盘（Immobiline Drystrip Reswelling Try）上进行水化，若使用IPGphor，则在IPGphor胶条支撑槽内（IPGphor Strip holders）进行水化。

含有或不含样品的重新水化液加入到膨胀托盘或IPGphor胶条支持架的储液槽中,随后各胶条就分别吸收重新水化液。水化后的胶条宽3mm大约0.5mm厚。

3.4.1重水化液的组成

最佳的重水化液的选择依赖于样品中特定蛋白溶解性的要求。一般的重水化液含有尿素，非离子或两性去污剂，DTT，IPG缓冲液（Amerham Phcrmcuia Biotecll），其pH值适合于IPG胶条pH值范围和染料pH值。也有可能包含样品。各种成分的作用和浓度在如下描述： →尿素（urea）

使蛋白质溶解和变性，通过展开蛋白质分子，使它们的内部带电氨基酸分子暴露。通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。最近有报导，除了使用尿素，使用硫脲能进一步改善蛋白质的溶解性，尤其是对于膜蛋白。 [9，13，51-53]

→去污剂（Detergent）

促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合。去污剂分子必须带电量为零——只使用非离子或两性去污剂。一般常用CHAPS，TritonX-100，或NP-40使用浓度为0.5-4%。

→还原剂（Reductant）

打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE（20-100mmol/L）。也可以使用2-巯基乙醇替代，但需要更高的浓度并且杂质能产生干扰[5 6]。最近的报导指出非硫还原剂磷酸三丁醇酯（Tributylphosphine）能被用来进行第一向等电聚焦。在使用前加入还原剂。

→IPG缓冲液（载体两性电解质混合物）

能提高分离效果和样品溶解度，尤其是加样量多时。形成各PH值范围的IPG胶条的IPG缓冲液是各种载体两性电解质的混合物，它在等电聚焦过程中不影响梯度结构，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。并且IPG缓冲液是有特殊组成的，它不影响银染效果。表9列出了进行重水化时各IPG缓冲液的最终建议浓度。

建议IPGphor体系的IPG缓冲液浓度为0.5%，若样品的溶解存在问题，可

以使浓度达到2%。

注意：缓冲液浓度在建议浓度的上限时，在IEF过程中有可能增加使电压达到设置最大值时所需的时间，从而增加完全聚焦所需的时间。

IPG缓冲液能加入在重水化液中储存，也可在使用前现加。（当多条具有相同PH范围的IPG胶条使用时，IPG缓冲剂能包含在重水化液中储存。当同种储存的重水化液来处理不同PH值范围的IPG胶条时，在使用前将IPG缓冲液分别加入到单份储存液中。）

→指示染料（Tracking dye）(溴酚蓝)

指示从开始进行电泳时，等电聚焦（IEF）的进程。若指示染料中没有向阳极移动时，就说明没有电流移动。然而注意：在样品聚焦前，使指示剂很好地离开胶条。

→样品（Sample）

样品能通过加在重水化液中进行加样。在等电聚焦前每条胶条多达1㎎的样品能稀释到或再溶到重水化液中。在检测和显影方法的使用中部分介绍了样品所需的数量。辐射标记所需的样品量少，银染一般需要100ug的样品，考马司兰染色和预备加样需要更多的样品。

表9：在重水化液中的IPG缓冲剂加量

IEF设备

胶条HP跨度

加入重水化液中的载体两性电

解质 IPG缓冲液的PH范围与IPG胶条PH范围相同 PH6-11LIPG缓冲液

IPG缓冲液的PH值范围与IPG胶条PH值范围相同

推荐浓度 2%IPG缓冲液 （50ul每2.5ml） 0.5%IPG缓冲液(12.5ul每2.5ml)

0.5%IPG缓冲液(12.5ul每2.5ml)

MultiphorⅡ 4-7L，3-10L，

或3-10NL MultiphorⅡ IPGphor

6-11L

4-7L，3-10L，3-10NL 或6-11L

3.4.2重水化液的准备

① 准备重水化储存液。在附录溶液B和C中列出了配制方法（选择合适实验的方法）。

注意：储存液在-20℃以2.5ml为单位储存。

② 在使用前，缓慢熔化2 .5ml单位的储存液。如果IPG缓冲液没有加入到重水化储存液中加入正确量的IPG缓冲液。（参见表9） ③ 加入7mgDTT和样品（若需要的话）

注意：在使用前，DTT和样品必须是新加入的。

3.5 MutiphorⅡ和固相干胶条设备（Immobiline Dry Strip Kit）

3.5.1IPG胶条重新水化——固相干胶条膨化托盘（Immobiline Dray-strip Reswelling Tray）

固相干胶条膨化托盘具有12个独立的储液槽。每一条储液槽都能安装长达18㎝长的单条IPG胶条。分离式的储液槽能减少每条IPG胶条的重水化液体积。 (1)膨化托盘（图9）的准备

从托盘上完全移去保护盖，通过旋转调平脚使托盘水平，直至气泡位于灵敏水平器的中间，确保托盘的干净和干燥。

(2)加入重新水化液 根据表10所述，将适量的重水化液用吸管加入到各槽中。将溶液放入到槽中间，除去任何大的气泡。

注意：确保所有样品被吸收，不要加入过量的重水化液。

表10：每条IPG胶条的重水化液体积

IPG胶条长度（cm） 7 11 13 18 24

① 若加样时包含样品

每条胶的总体积(ul)① 125 200 250 340 450

（3）安放IPG胶条（图10）

从IPG胶条除去包装，放低胶条一端，并且使胶条成尖的一端靠着槽的倾斜的一端；降低另一端，使胶条靠近溶液。为了使胶条被溶液浸润，慢慢的抬高或放低胶条并且来回的沿着液体表面滑动。注意不要使IPG胶条底部产生气泡。

（4）在IPG胶条上铺上一层IPG覆盖夜（IPG Cover Fluid）用1.5-3ml 的IPG覆盖液，覆盖在每一条IPG胶条上，减少蒸发和尿素结晶。 （5）使IPG胶条重新水化

盖上盖子使IPG胶条在室温重新水化。进行水化至少用10小时，建议在晚上进行重新水化。若IPG胶条膨胀不均匀，请参照表11。 （6）准备固向干胶条设备。（ImmobilueＤryStrip Kit） 在IPG胶条从膨化托盘上移去前，根据3.5.2A和3.5.2B节中所述，准备Multiphor Ⅱ固向干胶条设备和电极胶条（Electrode Strips）。

表11在膨化托盘上进行IPG胶条重新水化故障及排除方法

症状（Symptom） 胶条膨胀不均匀

可能原因（PossibieＣause） 排除方法（Remendy） 注意：往往碱性端比酸性端膨化速度快。

失水的IPG胶条在室温或在高于室温的条件下储藏太久。

重新水化液的使用体积不正确。

重新水化时间太短。

不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟胶条会从空气中吸收水分，将IPG胶条密封好在-20℃以下温度保存。

搞清楚加入到膨化托盘上的槽中的正确溶液体积。 重新水化时间至少需要10小时。

3.5.2等电聚焦准备（IEF）

双向电泳固向干胶条设备的组成包括：一个托盘和电极支撑架，正和负电极，一个干胶条对准器，一把样品杯栅和样品杯。

在IPG胶条从膨化托盘移走前以下步骤A和B必须预先完成。 A．固相干胶条设备的准备

（1） 清洗所在的固相干胶条设备及附件。

固相干胶托盘，干胶对准器，电极，样品杯栅和样品杯，应当清洗干净备用，用去污剂清洗，并且用大量蒸馏水冲洗，然后干燥。 （2） 在MultiphorⅡ上检查电源连接。

检查在MultiphorⅡ设备上红色的连接线连接。 （3） 安装冷却装置

在Multi Temp Ⅲ静热循环仪上设置温度为20℃将冷却盘安置到Multiphov Ⅱ设备上，并确保表面是否水平。打开MultitempⅢ静热循环仪。 （4） 安装固相干胶托盘

用吸管吸取10ml左右的IPG覆盖夜到冷却盘上。将固相干胶托盘安装在冷却盘上，这样使托盘红色连接口位于冷却盘顶部的冷却管附近。除去托盘和冷却盘之间的大气泡，小气泡可以被忽略。IPG覆盖液在这里能使冷却盘和托盘之间接触良好，将红色和黑色电极插入到MultiphovⅡ设备的托盘上。 （5） 安装干胶对准仪

将15ml的IPG覆盖液倒入固相干胶托盘上。将干胶对准仪放入到托盘中，位于IPG覆盖夜上，使具有13条沟槽的一侧朝下。在干胶对准器下，胶条位置之间的气泡不会影响实验。在这时避免使IPG覆盖夜粘在对准仪上，这样会干扰各槽的显影。

B．准备电极条

（1） 将电极条切成一定规格

将两根IEF电极条切成110mm长度。 （2） 用蒸馏水将电极条湿润

将电极条放在干净的表面如玻璃皿，用0.5ml的蒸馏水使各电极胶条湿润。用滤纸将胶条的水吸去。

注意：电极胶条必须保持润湿而不是湿透水。过量的水能产生条纹。 注意：A 和B步骤必须在等电聚焦前完成。

C．电泳的准备

（1） 将水化后的IPG胶条从膨化托盘上移去

为了从膨化托盘槽中移去IPG胶条，沿着槽的倾斜一端划动镊子的尖端，并且使镊子尖端在IPG胶条下稍微向下压。用镊子夹住胶条的一端，并提起来，从托盘中拿出。 （2） 用去离子水冲洗IPG胶条

用镊子夹住IPG胶条，用去离子水流轻轻地快速冲洗IPG胶条。冲洗胶条为了除去胶条表面多余的重水化液，这样在等电聚焦过程中，可以防止在胶表面出现尿素晶体。将IPG胶条的一边放在潮湿的滤纸上几秒钟，从而吸去多余的水分，避免使凝胶的表面与滤纸接触。 （3） 在干胶对准仪（Drystrip ahgner）中安置IPG胶条

立即将水化后的IPG胶条转入到干胶托盘上的对准仪的相邻沟槽中，使胶条的成尖端（酸性）位于托盘上端接近红色的电极处。钝的一端应当位于托盘的另一端，接近阴极端。对准IPG胶条，使阳极的凝胶边缘成一条线。

（4） 安置电极条

安置潮湿的电极胶条，使胶条横贯已对准胶条的阳极和阳极两端，电极胶必须至少与各IPG胶条的表面部分接触。 （5） 安装电极（图12）

每个电极在边上标有红色（正极）或黑色（负极），在电极胶条上调准各电极，确保标注边与在托盘上给定电极接口的边对应。当电极正确调整后，向下压低电极，使电极与电极条接触，检查

IPG胶条依然在各自的沟槽中对齐。

D．任选：凝胶重水化后加样

若样品在胶条重水过程中没加样，在进行电泳前，可以利用样品杯进行加样，当使用样品杯时，加样的量就少了，并且，更具限定性。不同梯度和胶条的合适的加样量，在表12中给定。这些数据只能作为一般的参考，根据样品和所使用的染色方法的灵敏性，合适的加样量将会有很大的不同。 （1） 准备样品

在与使用的重新水化液具有相同成分溶液中准备样品。

表12用样品杯加样的合适样品量 固相干胶条（immobiline Drysfrip） 7cm 7cm 7cm 11cm 11cm 11cm 13cm 13cm 13cm 18cm 18cm 18cm 24cm 24cm 24cm

pH 4-7 pH 6-11L

pH 3-10L PH3-10NL pH 4-7L pH 6-11L pH 3-10L pH 4-7L pH 6-11L

pH 3-10L PH3-10NL pH 4-7L pH 6-11L

pH 3-10L PH 3-10NL pH 4-7,3-7 pH 6-9,窄pH梯度 pH 3-10,3-10NL

合适加样量（ug蛋白质） 4-8(银染) 20-120(考染) 8-16 40-240 2-4 10-60 10-20 50-300 20-40 100-600 4-8 20-120 15-30 75-450 30-60 150-900 8-15 40-240 30-60 150-900 60-120 300-1500 15-30 75-450 45-49 200-1300 80-170 400-2000 20-40 100-600

（2） 确定加样点

最佳的加样点依赖于样品的特性，当感兴趣的蛋白质具有偏酸性的PI值或在样品预处理过程中使用了SDS，建议在接近阴极处设立加样点。带正电的样品进行加样需要PH6-11的梯度，最好使用PH3—10的梯度。由于样品的自然属性不同，最佳的加样点也可能各不相同。经验性的确定加样点位置是相当重要的。 （3） 安置样品杯栅

将样品杯放置在样品杯栅上，放在样品杯栅足够高的位置以避免接触凝胶表面。依据你的样品，调整样品杯栅的位置，使样品杯离阴极或阳极几毫米远。样品杯必须面对着电极。样品杯栅的一边具有一块垫片。向阳极或阴极移动样品杯栅，直至垫片正好接触阴极或阳极。

（4） 正对IPG胶条下压样品杯

移动样品杯至指定位置，使各IPG胶带上方各具一个样品杯，并且下压样品杯，使样品杯与胶条接触良好。这可能是所有过程中最关键的一步。检查胶条是否位于正确位置，在干胶对准仪上成一直线。

（5） 加入IPG覆盖液

当样品杯正确安装完后，在托盘上倾入70-80ml的IPG覆盖液，使胶条完全被覆盖液覆盖。若IPG覆盖液渗透到样品杯内，调准样品杯的位置，吸管吸去杯内的覆盖液，并检查是否依然渗透。加入大约150ml的额外 IPG覆盖液，使样品杯覆盖。IPG胶条沉没在一层IPG覆盖液下，可以防止IPG胶条变干，防止重水化液成份的沉淀，并且还可以防止空气溶入IPG胶条。 （6） 加样（图14）

利用微量移液器在IPG覆盖液面下加样（每条IPG胶条可加多达100μl的样品）样品应当沉入样品杯的底部，观察样品是否从样品杯中渗出来。

注意：正如在3.3节所提到的，当样品通过样品杯加样时，在加样点上有可能形成沉淀，这样加入量的蛋白质数量有可能比在重水化液中加量的蛋白质数量要少。这种局限性可以通过以下几步克服：

蛋白质在加样点处的沉淀及相互结合（蛋白分子）有时能被避免： ■样品必须含有尿素，非离子去污剂和IPG缓冲液或载体两性电解质。 ■用样品稀溶液加样（60—100μg蛋白质每100μl样品）

■在聚焦最初的1—2小时内，使电压限定在10—30V/cm范围内。 ■在样品中加入LiltrodexTM脂。

由于微量准备的加样，通过样品杯，可以加入更多量的样品。 ■在IEF过程中反复向样品杯中加样。

■在近阳极和近阴极附近同时加样（使用两个样品杯栅）。 3.5.3 等电聚焦的原则

在Multiphor设备中进行等电聚焦，（IEF）是在高压（达3500V）下进行的，并且由于IPG胶条内离子强度低，从而使电泳过程中电流非常低（往往低于1ma）.在等电聚焦过程中（IEF），当 蛋白质和其他带电成分向它们的平衡点移动时，电流就逐渐减少，然而电压却逐渐增加了。典型的等电聚焦规则往往在进行等电聚焦时要通过一系列的电压步骤。开始电压是相当低的，电压随后就逐渐上升。直到最终达到所希望的聚焦电压，并且在此电压下维持几个小时。在开始的低电压能减少样品的结合（蛋白质间的结合），并且使具有不同盐浓度的样品平行分离。对于那些加样量大的等电聚焦（IEF）来说，逐渐增加电压是明智的。（每条

IPG胶条100ug或更多）。许多因素能够影响完成聚焦所需的时间，各种有利于优化电泳最终结果的特定条件（样品和重水化液的成份，IPG胶条长度及pH梯度）需要经验性的判断来确定。在表13的范例规则中提供了等电聚焦，所需的近似时间。能增加电泳时间的另外一个原因是小离子的存在，在蛋白质聚焦前，他们先移至胶条的两端。蛋白质的量大也需更多的时间进行聚焦。

注意：

在100000总电压时下，聚焦过久不会产生问题，但继续进行跑胶，有可能产生水平的条纹，能在双向电泳的结果中看到。（参照6.0节 双向电泳结果故障排除）

3.5.4 规则举例—Multiphor

依表13给出的规则，适合于第一向的含有常规分析量的蛋白质样品的等电聚焦，其重水液中含有0.5—2%的IPG缓冲剂。由于蛋白质的性质，数量及加样方式的不同，最佳的聚焦时间有可能不同。为了分离加样量大的蛋白质（达1mg或更多），若需要，各规则的最终步聚焦的时间可以延长至100000电压时。 注意：

通过将样品加入重水液中加样，在PH6—11L IPG胶条上聚焦，明显需要延长完成聚焦的时间，在过程的最后阶段，增加推荐的电压时，7cm长的IPG胶条增至6—10倍，11cm长的IPG胶条增至5—8倍，13和18cm长的IPG胶条增至5—7倍。 3.5.5 进行跑胶

确保固相干胶托盘（Immobiline dry strip tray）上的电极连接正确，并且在MultiphorⅡ设备上盖上盖子，将盖子上的接口与电源供应仪相连。确保在EPS3501XL电源供应仪上的电流检测处于断开状态，开始进行等电聚焦。

随着等电聚焦的进行，溴酚蓝指示染料就向阳极移动。注意，在聚焦完成前，染料的前沿从IPG胶条上完全移出。因此，染料从胶上清除掉后不意味着等电聚焦完成了。若染料没有移动，则没有电流。若发生这种情况，检查电极和电极条之间是否接触良好，等电聚焦后，立即进行第二相电泳，或将IPG 胶条放在具有螺纹盖的试管内，并放在-40℃——-80℃条件下保存。7cm长的胶条，放在15cm的圆锥形试管中。11、13和18cm长的胶条放在25×200mm的带螺纹盖培养试管中。

表13 Multiphor 上进行固相干胶等电聚胶（Immobiline Drystrp IEF）规则

在梯度模式（Gradient mode）下设置好EPS3501XL电源仪的程序，并关掉电源检查选择选项。IPG胶条在含有相应pH范围的IPG缓冲液的重水化液中重新水化。

固定干胶条（Imnobiline Drystrip） 长度 ph梯度 7cm PH4-7L

1 2 3 总 共

7cm PH6-11L

PH3-10L PH3-10NL

11cm PH4-7L

1 2 3

总共

1 2 3

11cm PH6-11L

PH3-10L

13cm PH4-7L

1 2 3 总共 1 2 3 总共

13cm PH6-11L

PH3-10L PH3-10NL

18cm PH4-7L

1 2 3 总共 1 2 3 总共

18cm PH6-11L

PH3-10L PH3-10NL

24cm pH3-10

1 2 3 总共 1 2 3 总共

500 3500 3500

500 35000 3500

2 2 2

5 5 5

500 35000 3500

2 2 2

5 5 5

300 35000 3500

2 2 2

5 5 5

300 35000 35000

2 2 2

5 5 5

300 35000 3500 300 35000 3500

2 2 2 2 2 2

200 35000 3500

2 2 2

5 5 5 5 5 5 5 5 5

200 3500

2 2

阶段（phase） 电压

（V）

电流（A）

功率 (W) 5 5 5

0:01 1:30 0:55-1:30 2:25-3:00 0:0.1 1:30 0:35-1:05 2:05-2:35 0:01 1:30 2;20-3:30 23:50-5:00 0:01 1:30 1:45-2:35 3:15-4:05 0:01 1:30 3:45-4:20 5:15-5:50 0:01 1:30 3:10-4:00 4:40-5:30 0:01 1:30 5:40-7:40 7:10-9:10 0:01 1:30 4:50-6:20 6:20-7:50 0:01 1:30 7:40-10:40 9:10-12:10

1 2800 3200-5200 6000-8000 1 2800 2200-3700 5000-6500 1 2900 8100-12100 11000-15000 1 2900 6100-9100 9000-12000 1 2900 13100-18100 16000-21000 1 2900 11100-14100 14000-17000 1 3000 20000-27000 23000-30000 1 300 12000-22000 20000-25000 1 3000 27000-37000 30000-40000

持续时间 （h:min）

（推荐）电压时

35000 2

总共

固定干胶条（Imnobiline Drystrip） 长度 ph梯度 24cm pH4-7 3-7NL

3-10NL

阶段（phase） 电压

（V）

电流（A）

功率 (W)

持续时间 （h:min）

（推荐）电压时

1 2 3 总共 1 2 3 总共

500 3500 3500 500 3500 3500

0:01 1:30

1 3000

12:00-16:20 42000-47000 13:30-17:50 45000-60000

0:01 1:30

1 3000

24cm

窄pH 梯度

22:00-27:40 77000-97000 23:30-29:10 80000-100000

(1) 在阶段2中，电压将会从阶段1设置的电压上升至3500V。在整个阶段3中电压将会保持在3500V。 (2) 若在PH6-11L IPG胶条上，样品通过包含在重水化液中加样，需要更多的时间来完成聚焦。在最后阶

段中增加推荐的电压时，使最后阶段电压时为：7cm长的IPG胶条6-10倍，11cm长的IPG胶条5-8倍，和13-18cm长的IPG胶条5-7倍。

3.5.6故障及排除

表14在等电聚焦过程中可能产生的故障和解决的方法。 症状

（Symptomm） 样品杯渗漏

可能原因

（Possible Cause） 处理和放置样品杯不正确

样品杯很脆弱，它不能无数次的从加样栅上拿下来又安装上去。检查样品杯是否与IPG胶条对准。 检查样品杯底部是否与IPG胶条的表面平行贴着。（见图13）

注意：样品杯渗漏往往在加样前能被检查出来 当IPG覆盖液到入到固定干胶托盘内时

（1）当将IPG覆盖液倒入到固相干条托盘上时，观察IPG覆盖液是否从样品杯底部渗漏到杯内，若这情况发生，重新安装样品杯，用微量移液器移走渗入的液体，并且继续检查样品杯是否渗漏。

（2）另一种检查是否渗漏的方法是将0.01%的溴酚蓝溶液放入样品杯内，看是否有染料从样品杯渗出。若有染料渗出，则样品杯必须重新安装来消除渗漏。（注意：在加样前染料必须从样品杯内除去）

电流过低

在重水化液中没放IPG缓冲剂

在开始跑胶时没电流

没连接电极或缺少电源连接

IPG胶条没有完全水化

电泳仪的高电压接口没有正确地插入到电源供给仪上。

样品染料液有从样品杯中移出

样品染料从样品杯中移出往往需要好几个小时

对IPG凝胶来说很常见，凝胶的传导性很低

电源供给仪不能检测到低uA级的电流并且关闭。

通常IPG等电聚胶开始时电流接近1mA,随后下降到uA级范围内，这依赖于在电泳仪上IPG胶条的数量。

检查低电流选项是否打开，（参照电源供应指令），IPG等电聚焦开始时电流的范围不能被电源供给仪检测出来。

重水化液中经常包含IPG缓冲剂

确保所有的MultiphorⅡ位于正确位置，确保带有电极的金属片与固定干胶托盘的侧面的金属片接触。注意带有电极的金属板只能位于标有红色或白色圈端。确保在冷却盘下的连接电缆是否正确安装。 确保整个IPG胶条已经全部水化。

确保电泳仪的高压接口安全地接到电源供给仪的输出端口上。若需要，使用合适的接口。

解决方法（Remedy）

样品杯按下时用力太大，以至于样品杯穿过胶条与塑料支持胶片靠在一起。这能使电流受阻，并且机械地阻碍蛋白质进入胶条。

样品中的离子强度大于胶条内的离子强度，由于这种原因，样品区域的场强不足于使蛋白质按估计的速度从样品区域移走。移动有可能完全停止了。

撤换IPG胶条，并且重新安装样品杯

尽可能的稀释样品或在加样前利用渗析法除去盐离子。

IPG胶条产生火花或燃烧

样品或IPG胶条的传导性太大 确保样品已充分去盐，或到达最大电压前，增加了低电压阶段的时间，使各离子向IPG胶条两端移动。

3.6 IPGphor 等电聚焦设备

利用IPGphor等电聚焦设备，IPG胶条的重水化和等电聚焦在同一个一个支

撑槽内进行。不同长度的支撑槽（holder）能适应不同长度的IPG胶条。胶条支撑槽是由在内部装有铂电极的具热传导性的瓷性物质做成的槽和一个盖子组成。能简单的将样品放入到含有重水化液的支撑槽中进行加样或在等电聚焦之前单独加样。当样品加入到IPG 胶条后并且将胶条支撑槽安置在IPGphor仪器平台上，根据所选的电泳方法，随后的步骤能自动进行。多大12个胶条支撑槽能同时进行电泳。

3.6.1 IPG胶条重新水化—IPGphor胶条支撑槽

（1） 准备IPG胶条支撑槽。

根据实验的要求选择与IPG胶条长度相对应的胶条支撑槽。 注意：在处理瓷性支撑槽时要小心，由于它们很脆弱。

用去污剂清洗各槽以除去残留蛋白。用重蒸馏水冲洗支撑槽。用棉性擦布或脱脂棉干燥支撑槽，或让支撑槽在空气中干燥。带手套处理干净的支撑槽以避免污染。

（2）加重水化液

用微量移液器吸取合适体积的重水化液至各槽中，如表15所示。从支撑槽的中间位置慢慢的将重水化液注入，使其从加样槽向两段移动。除去所有大的气泡。

注意：为了确保样品完全吸收，不要加入过量的重水化液

表15每条IPG胶条的重水化液体积 IPG胶条长度（cm） 7 11 12 18 24

①包含样品，若在重水化液中加入样品。

每条胶条的总共体积（ul） 125 200 250 350 450

①

（3）安装IPG胶条（图17和图16）

除去IPG胶条表面的包装，胶上成尖的一端（阴极端）对准支撑槽上带有点标记端，使带有点的一端先放到支撑槽上，为了使溶液包被整个胶条轻轻地抬起和放低胶条，并且沿着液体表面来回的移动，若需要的话，轻轻的倾斜支撑槽以确保整条胶完全的和均匀的浸润。最后放低IPG胶条阴极端（方形端）将整个胶条浸入到溶液中。确保胶条的两端与支撑槽的两端的电极接触。（当重水化液给胶着色时，胶能从视觉上判断出来），小心不要在胶底部形成大的气泡。 （4） 加入IPG覆盖液

加入IPG覆盖液以防止蒸发和尿素结晶的形成。利用微量移液器将胶条覆盖液从支撑槽的一端加入，直至半条胶覆盖上覆盖液，然后从另一端加入覆盖液，直至整条胶覆盖住。

（5） 胶条支撑槽上加盖

轻轻挤压盖子下侧的区域，确保在胶膨胀过程中，使IPG胶条与电

极具有良好的接触。 （6） 使IPG胶条重水化

重水化过程可放在板凳上进行或IPGphor仪平台上进行，确保支撑槽位于水平的表面上。进行水化至少需要10小时以上，因此建议在晚上进行。重水化的步骤可以编为利用IPGphor进行电泳的第一步。若在电泳的过程中考虑到温度控制，这样就尤其方便。

3.6.2 任选：安置电极纸片

在某种情况下，如聚焦时间很长，水有可能向IPG胶条的一端移动，从而使

另一端变干。这种作用可以通过在IEF前在IPG胶条和支撑槽电极之间放置纸电极片来减小。纸电极片也能吸收离子，这些离子不但再电泳时能在胶条两端积累，而且有可能影响分离效果。 （1） 准备纸电极

从等电聚焦电极纸带上（PaperIEF electrode Strip）剪取３ｍｍ宽的纸

电极片。将其放在干净平滑表面上如玻璃培养皿，然后用无离子水润湿用滤纸吸去多余的水分

注意：纸电极片必须润湿而不是湿透。 （２）安放纸电极片

在胶条支撑槽上移去盖子。用镊子抬起胶条的一端，在电极上放置纸片电极，然后将胶条这端放回至原来的位置上。在另一端重复这样做。然后盖上盖子。

3.6.3任选：在胶条重水化后加样。

若在胶条的重水化液中没有进行样品加样，样品可以在等电聚焦前立即

加样。

（１） 样品准备

将样品在入含有与重水化液相同成份的溶液中处理。

（２） 加样

除去支撑槽的盖，用微量移液器，将样品加入到胶条支撑槽的两侧的槽内将样品注入到IPG覆盖液以下。每个边上能加入到7.5ｕｌ的样品溶液（每槽内15ｕｌ或两侧的两个槽上总共加30ｕｌ）

注意：ＩＰＧ胶条背面没有渗透性，不要将样品加入到IPG胶条的背面。将盖子盖回原处。

3.6.4等电聚焦原则

在IPGPhor设备上进行等电聚焦需要很高的电压（达8000V）并且由于在IPG胶条内离子强度很低，电流相当弱（一般低于50uA每胶条）。在电泳过程中，由于蛋白质和其他带电的物质向平衡点靠近，电流就越来越弱，而电压就逐渐升高。进行一次典型的等点聚焦电泳，往往需经历一系列的电压过程，开始电泳时电压非常低。电压逐渐上升，直至达到预定电压，并在此电压下维持几个小时。开始电压很低能减少蛋白质分子间的相互结合并且能使具有不同盐浓度的样品平行分离。当加样量很大时（每条IPG胶条达100ug或更多），采取逐渐增大电压的措施是很明智的。

许多因素影响等电聚焦所需的时间，并且为了取得最佳的电泳结果，需要凭经验来确定每一种特定的条件（样品和重水化液成分，IPG胶条长度，和pH梯度）。表16举例提供了进行电泳所需的近似时间。能增加电泳聚焦所需的时间因素有离子和IPG 缓冲剂。离子在蛋白聚焦前能先移向IPG胶条两端。IPG缓冲剂能增加IPG胶条的导电性。当设备受到最高电流设置限制时，能使最终的电压很低。在IPG缓冲剂浓度高于0.5%时，有可能需要更长的聚焦时间。由于通过样品加样槽加载了大量的蛋白质和样品，通过延长聚焦时间和增加达到最大电压步骤，能提高电泳的效果。

注意：

通常利用电压时来对电泳进行拟订规格,而不用时间。在有限的电流下，实际所得到的最大电压和所得到分离速度是不同的，这依赖样品和重水化液成份的导电性，由于获得最佳聚焦的时间存在差异，在拟定电泳规则时一般愿意用电压时，因为它能弥补这种差异性。 注意：

将每条IPG胶条的电流超过50uA的限度是不可取的,因为这有可能产生过多的热量并且有可能损坏胶条和支撑槽,在极端条件下IPG胶条有可能发生燃烧. 注意：

在低于100000总电压时延长聚焦时间不存在问题，但是继续跑胶有可能产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。

表16 在IPGphor等电聚焦设备上进行固相干胶等电聚焦的规则 50uA每条IPG 胶条

20℃在重水化和等电聚焦时

pH值梯度4-7L、3-10L和3-10NL

阶段 电压 持续时间（h:m） 电压时（vh） 梯度种类（Gradient type） 7cm 重新水化 12:001

1 500 0:30 250 step-n-hold 2 1000 0:30 500 step-n-hold 3 8000 1:00 8000 step-n-hold 11cm 重新水化 12:00

1 500 1:00 500 step-n-hold 2 1000 1:00 1000 step-n-hold 3 8000 2:00 16000 step-n-hold 13cm 重新水化 12:00

1 500 1:00 500 step-n-hold 2 1000 1:00 1000 step-ntrold 3 8000 2:00 16000 step-n-trold 18cm 重新水化 12:00

1 500 1:00 500 step-n-trold 2 1000 1:00 1000 step-n-trold 3 8000 4:00 32000 step-n-trold

pH梯度6-11L

阶段 电压 持续时间 电压时 梯度种类 7cm 重新水化 12:00

1 500 0:30 250 step-n-tord 2 1000 0:30 500 step-n-trold 3 8000 3:45 30000 step-n-trold 11cm 重新水化 12:00

1 500 1:00 500 step-n-trold

2 1000 1:00 1000 step-n-trold 3 8000 7:30 6000 step-n-trold

13cm 重新水化 12:00

1 500 1:00 500 step-n-trold 2 1000 1:00 1000 step-n-trod 3 8000 9:30 75000 step-n-trold 18cm 重新水化 12:00

1 500 1:00 500 step-n-trold 2 1000 1:00 1000 step-n-trold 3 8000 12:30 100000 step-n-trold 4 8000 2:30 20000 step-n-trold

(1) 为了方便起见,重新水化时间能进行调整，但必须长于10小时

(2) 在建议各阶段中，这电压可有能达不到

3.6.5规则举例--IPGhor

表16的规则适合于那些溶解在重水化液中具有常规分析数量的蛋白质

(1-50ug)进行第一向的等电聚焦。若在重水化液中含有0.5%IPG缓冲剂能提高分离效果。推荐的电流强度限度为每条胶50uA。推荐的电泳聚焦时间已经给出，但最佳的时间依赖于样品的自然属性蛋白质的数量及加样方法。请参阅IPGphor使用者手册（IPGphor use Manual）以获的怎样设计电泳程序的指令。 3.6.6进行电泳（Running a protocol）

确保胶条支撑槽正确的安置到IPGphor电泳仪的平台上。（利用标在电泳仪

平台侧面的标记调整好各胶条支撑槽，并且确保标成尖的胶条支撑槽的一端位于阳极上（标于电泳仪的背面），而钝的一端位于阴极上。请参阅IPGphor使用者手册）。检查位于各胶条支撑槽底部的外部电极触口是否于电泳仪平台上的接口接触良好。

盖上安全盖（SafetyLid）位于安全盖内侧的至少2/3的压力垫必须轻轻的压住各胶条支撑槽的盖面，以确保电极于电极之间接触良好。开始等电聚焦。

随着等电聚焦的进行，溴酚蓝示踪染料就向阳极移动。注意，在等电聚焦完成前染料必须完全从胶条相中移出，因此染料完全从胶条相中移尽不意味着样品已经聚焦。若染料不移动，这说明没有电流。如果染料不移动，请检查胶条支撑槽外部的电极表面与设备上的电极区域是否接触良好，以及内部电极的表面与胶条之间的接触。 注意：

用较短的IPG胶条进行等电聚焦或样品具有较高的电导性，预先设置的最大电压有可能达不到。

等电聚焦后迅速进行第二向分离，或将IPG胶条盛在带螺纹盖的试管内储存在-40—-80 条件下。7cm长度的胶条可以随意盛在15ml锥形的试管内，11、13和8cm长的胶条可以盛在25×200mm的带螺纹盖的组织培养试管内。

3.6.7 故障及排除

表17列出了在进行等电聚焦过程中可能碰到的故障及排除方法。

表17：第一向等电聚焦的故障及排除方法-IPGhor 症状（Symptom） 可能的原因

（Possible cause） 电流太低或为零

电源连接发生故障。

排除方法 （Remedy）

检查外部电极的接口：

位于胶条支撑槽底部的电极必须与电泳仪平面上的电极板接触区域形成金属于金属接触。

检查内部电极接口：凝胶必须与支撑槽内两端的电极接触。检查IPG胶条是否完全水化。胶条没有完全水化，能使胶条与电极间接触不良。 检查电流限度是否正确设置。检查实际在IPGphor平台上进电泳的实际胶条数与在规则内设置的胶条数是否一致。

处理样品，使样品盐浓度低于10mmol/L。建议的IPG缓冲剂浓度为0.5%。若样品的溶解存在问题，最高浓度可达2%。

电压太低或没有达到预定最大电压

进行实验的IPGphor设置不对。

导电性或离子强度过高。

产生火星或IPG胶条燃烧

电流设置过高，高于50mA。 不要使每胶条的电流高于 50mA。

PG胶条重水化不充分

在等电聚焦过程中IPG胶条变干燥 。

确保用足够的重水化液对IPG胶条进行重新水化。 除去在将胶条放入重水化液后在胶条下面产生的较大的气泡。检查整个胶条表面处于湿透状态。

经常加入IPG覆盖液，来防止水化后的IPG胶条失水。

第四部分 第二向 SDS-PAGE

4.0第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-概要

等电聚焦后，第二向的分离可以在不同的平板型或垂直型的设备上进行，这依赖于在1.2节‘设备选择‘中所讨论的因素。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳由四步组成：（1）第二向电泳凝胶的制备（2）在SDS缓冲液中平衡IPG胶条（3）将平衡后的IPG胶条安置在SDS 凝胶上（4）进行电泳。 在这本手册中，平衡步骤在这里首先介绍，因为这对垂直的和平板的电泳仪一般都适用。凝胶制备，IPG胶条的安装电泳的规则，另一方面是由胶条的胶性质决定的。在4.3节和4.4节中分别介绍了在垂直型的设备和在平板型设备中进行电泳的规则。然而，应当注意，第二向凝胶必须在平衡开始前预制。

4.1 SDS 聚丙烯酰铵凝胶电泳的背景。

SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳是根据多肽的分子量的大小将多肽分离的。它是在含有十二烷基硫酸纳的聚丙烯酰铵凝胶中进行的。由于在样品中存在SDS和在凝胶中进行分离，蛋白样品内部所带的电荷量不是进行分离的因素。SDS是一种阴离子去污剂，通过以每克蛋白样品1.4克的比例缠绕在多肽连上使多肽变性。与SDS结合，使蛋白质自身的电荷产生屏弊形成带有永久性净负电荷的复合物。SDS也能打断氢键，阻碍疏水反应并且部分的展开蛋白分子，通过取消三级和二级结构，减小蛋白质在分子形态上的差异性。当使用一种还原试剂如DTT，蛋白质分子就完全舒展开来了。在半胱氨酸侧链间形成的双硫键能被打断，并且多肽能形成具有相同电荷密度棒状结构或每单位长度带的棒状结构。当蛋白质同时用SDS和还原剂进行处理，完全由分子量来分离蛋白成为可能。实际上，分子量的对数与SDS-多肽胶粒移动的相对距离之间存在着近似线性相关性。（注意：这种线性相关性只对某些分子量范围的蛋白有效，这种分子量范围是由聚丙烯酰胺的浓度百分比来衡量的。）

最常规使用的进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的体系是tris-甘氨酸缓冲液体系，在[63]中有Laemmli介绍。其它的缓冲液体系也能被利用，尤其是Schugger和VonJagow[64]的tris-N三甲基甘胺酸，这种缓冲剂用来溶解分子量范围低于10KD的多肽。

在MultiphorII平板电泳仪上利用预先浇铸好的ExleGet凝胶进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳需要使用不同的tris-一N-三甲基甘酸缓冲体系（tris-tricine buffer System）。

4.2 IPG胶条平衡

平衡步骤是将IPG胶条浸没在进行第二向分离所必需的SDS缓冲体系中。平衡液包含：缓冲剂，尿素，还原剂、SDS甘油、和染料。另外可选用碘代乙酰胺来代替还原剂。

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