斜面低温保藏法
更新时间:2024-03-15 06:19:01 阅读量: 综合文库 文档下载
斜面低温保藏法
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法.操作简单,使用方便,不得特殊设备,操作时,将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌生长充分以
后,转移至2-8℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同,霉菌、放线菌及芽 胞的菌保存2--4个月,移种一次;酵母菌两个月移种一次,细菌最好每月移种一次。此法 的缺点是菌种容易变异,因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的,传代过多会使微生 物的性状和代谢发生变异,在传代过程中,污染杂菌的机会也较多。因此,此法仅能用于工 作用菌种的短期保藏,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,传代代数超过5代的菌种应 灭菌处理后抛弃。
xxx食品检测中心作业指导书
1.目的
规范实验室菌种的收集、使用、保管程序;确保实验室的安全。
2.范围
本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。
3.职责
3.1菌种保管员:按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作。 3.2科室负责人:负责监督菌种的使用及管理。
4.管理细则
本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、一部分无致病能力的普通细菌和常见真菌。不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体;保存的菌种主要用于各类培养基、检测试剂的性能测试和质量控制。 4.1在本实验室保管的菌种名
4.1.1保留工作菌种:大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a ATCC12022、副溶血性弧菌200904-1、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、普通变形杆菌,克雷伯氏杆菌,小肠结肠炎耶森氏菌ATCC 23715 、单核增生李斯特菌ATCC19111、 枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌ATCC11778、白色念珠菌ATCC10231、酿酒酵母ATCC9763、 黑曲霉菌 、展青霉菌 、 黄曲霉菌。
4.1.2常规检测,科研分离得到的有保留价值的三类/四类菌种根据需要可继续保留;如果在食品中分离到二类/一类菌种,及时送上级单位进一步鉴定,并按规定立即销毁。本实验室不保存一类、二类菌种。 4.2 菌种的保管
4.2.1实验室菌种保存于专用的菌种室。
4.2.2菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种。
4.2.3使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后,向菌种保管员领用。
4.2.4菌种应按规定的时间定期转种,一般每转种3代做一次鉴定,如发现污染或变异应及时处理。
4.2.5保管人员工作变动时应作好交接工作。 4.3 菌种的使用和保存
4.3.1菌种的类别
4.3.1.1实验室内的标准菌种根据用途不同,分为储存菌种、传代用菌种和工作用菌种。 ①储存菌种:以冷冻干燥保藏为主,用于菌种的长期保存,一般是从菌种保藏中心或专业实验室购买得到的标准菌株,用符号S表示。一般可保存5年。
②传代用菌种:采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法,用于菌种的传代,用符号G表示。甘油冷冻管保藏法一般可保存2年;
③工作菌种:保存于半固体内或琼脂斜面培养基中,作为工作用菌种,用符号W表示。一般可保存1~2个月。
4.3.1.2实验室从样品中分离得到的菌株用符号Y表示。 4.3.2菌种的接收 菌种购到实验室后,应在菌种接收记录上填写所购菌种的信息,如名称、数量和接收日期等。贴好标签后储存于-30℃以下。 4.3.3冷冻干燥菌种的恢复培养
按菌种保藏中心的要求进行恢复培养。中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)建议的方法如下:
①安瓿管开封:用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管,用火焰将安瓿管顶端加热,滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂,用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 ②菌株恢复培养:用无菌吸管,吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基(如营养肉汤),滴入安瓿管内,轻轻振荡,使冻干菌体溶解呈悬浮状,取约0.2ml菌体悬浮液,移植于指定的琼脂斜面/平板培养基上,剩余的菌液,注入指定的液体培养基内(3-4ml),然后在建议的温度下(一般培养温度32.5℃±2.5℃,18~24h)培养。
③注意事项:菌种活化前,请将安瓿管保存在5-10℃的环境下;某些菌种经过冷冻干燥保存后,延迟期较长,需连续两次继代培养才能正常生长。 4.3.4菌种的传代
从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。按转种次数确定菌种的代数:
①冷冻干燥的菌种在液体培养基内恢复培养(第1代)后,转种至平板培养基上得到单 个纯菌落,此为第2代。菌种传代一般不超过5代。
②鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后,挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管,此作为第2代传代用菌种(G2);同时挑取纯菌落转接斜面,此菌种作为工作用菌种,为第3代(W3)。
③将第2代传代用菌种(G2)管冷冻保存(-30℃以下),将第3代工作用菌种(W3)以适当温度下培养适当时间后可用于实验。
④取一支冷冻保存的第2代传代用菌种(G2)转种于平板和斜面培养基上,平板上的菌种制成甘油冷冻管,为第3代传代用菌种(G3);斜面培养基经适当温度下培养适当时间后可用作第3代工作用菌种(W3)。
⑤当工作用菌种代数小于5时,可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种,如W3可直接转接为W4。
⑥按上述程序操作,直至G4转为W5为止,需重新开启安瓿,再重复上述操作程序保藏和使用菌种。
4.3.5菌种的保存方法 4.3.5.1甘油冷冻管保存法
甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种,一般可保存2年。
①将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面,经37℃24~48h培养后,用无菌接种环轻轻刮 取菌苔,移至预先装有无菌蒸馏水的试管中,调整菌液浓度,使其等同于1单位麦氏比浊管。
②向已制备好的菌悬液中加入等体积,浓度为20%的无菌甘油,得到10%甘油菌悬液。 ③轻轻振摇,使10%甘油菌悬液充分混合,分装于无菌小试管中,在-30℃条件下贮存。 4.3.5.2液体石蜡覆盖保藏法
液体石蜡覆盖保藏法适用于保存传代用菌种,一般可保存3-6个月。 ①取纯化菌种穿刺接种于半固体培养基中,经37℃18~24h培养后,加无菌液体石蜡覆盖半固体表面(高度1厘米为宜)。
②石蜡油封存以后,放入4℃冰箱中保存,也可直接放在低温干燥处保藏。③肠道细菌、葡萄球菌一般可保存3-6个月;保存O1群和非O1群霍乱弧菌时宜放置室温阴暗处;保存副溶血性弧菌时,用含3.5%氯化钠半固体,宜放置室温阴暗处;保存葡萄球菌、链球菌可用10%血半固体。
4.3.5.3斜面低温保存法斜面低温保存法适用于保存工作用菌种,一般可保存1~2个月 取纯化菌种转接种于适宜的固体斜面培养基上,经37℃18~24℃培养后,用纸将管塞部分包扎好,放入4℃冰箱中保存,也可直接放在低温干燥处保藏。 4.4 菌种的实验室编号
编号原则:菌种名称+类别/传代次数-制备日期或接收日期,例副溶-G3-20081213。对于实验室从样本中分离得到的菌种,类别用Y表示,例副溶-Y3-20081213。
注:菌种名称使用中文简称,如“副溶血性弧菌”用“副溶”表示;“金黄色葡萄球菌”用“金葡”表示;“奇异变形杆菌”用“奇变”表示。 4.5 菌种的销毁
4.5.1 菌种销毁采用高压蒸汽灭菌:121℃,20分钟。
4.5.2 下列菌种需及时销毁处理:①发生污染或变异的菌种;②超过保存期限的菌种;③使用后的菌种。
5.记录表式
菌种接收记录表 菌种使用登记表 菌种销毁审批表 6.参考文献 6.1 戴光强. 医学继续教育系列丛书?卫生检验分册[M].合肥:安徽科学技术出版社,2001.4. 6.2 管远志, 王艾琳,李坚管.医学微生物实验技术[M].北京:化学工业出版社,2005.8. 6.3 王宏明.微生物检验技术操作规程与质量控制及检测数据分析处理实用手册[M].北京:卫生科技出版社,2007.5.
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