银杏叶有效成分的提取工艺

银杏叶有效成分的提取工艺

银杏叶有效成分的提取工艺

郭美华,张新建,段丽娟,马满玲

1,2

1

1

1

(1 哈尔滨医科大学附属第一医院药学部,黑龙江 哈尔滨 150001;2 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

摘 要:目的:优选银杏叶中有效成分的提取工艺条件。方法:用HPLC法测定有效成分含量,采用正交

试验法,以干浸膏收率、总黄酮醇苷及萜类内酯含量为考察指标。结果:银杏叶的最佳提取条件为:提取温度70 ,70%乙醇提取2次,每次2 0h,第1次加12倍量乙醇,第2次加8倍量乙醇。结论:含量测定方法准确,提取工艺稳定可行。关键词:银杏叶;提取工艺;正交试验中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1002-2406(2010)05-0018-03

ExtractionProcessofActiveIngredientfromGinkgoLeaf

GUOMei-hua,ZHANGXin-jian,DUANLi-juan,MAMan-ling(1.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China;

2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Abstract:Objective:Tostudytheoptimalextractionconditionsofactiveingredientsinginkgoleaf Methods:ThecontentofactiveingredientsweredeterminedbyHPLC,Orthogonalexperimentaldesignwasadopted Theindexesweretheyieldofalcoholextractandthecontentoftotalflavonoidsandbilobalidesintheextract Re sults:Thebestextractionconditions:70 ,andextracted2timesby70%ethano,lThetimeforeachextrac tionwas2 0hours Thefirsttimeused12timesalcoho,lwhilethesecondused8timesalcohol Conclasion:Theextractionprocedureisstableandfeasible Keywords:ginkgolea;fextractionprocess;orthogonalexperiment 现代化学研究表明,银杏叶中所含成分相当复杂,包括黄酮类、内酯类、萜类、生物碱、多糖类、氨基酸、微

[1]

量元素等。银杏叶制剂具有扩张血管,改善微循环,抗血小板激活因子,抗氧化、清除和抑制氧自由基

[2]

等作用。笔者以干膏收率、黄酮醇苷及萜类内酯含量为指标进行工艺条件优选,以确保有效成分的提取效果,保证制剂的质量及疗效。1 材料

Waters600高效液相色谱系统(2996PDA检测器,ELSD2000蒸发光检测器,717自动进样器,Em power数据管理系统);AE240型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);药材(市售)由本院药品质控室鉴定为银杏科乔木银杏(GinkgobilobaL )的干燥叶;银杏内酯A(批号110862-200004),银杏内酯B(批号110863-200406),银杏内酯C(批号110864-200505),白果内酯(批号110865-200404),槲皮素(批号100081-200406),山萘素(批号110861-200606),异鼠李素(批号110860-200407),以上对照品均购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈、四氢

基金项目:黑龙江省卫生厅资助项目(2006-077)

作者简介:郭美华(1978-),女,药师,现为黑龙江中医药大学在职硕士研究生,主要研究方向:临床药学及药品质量控制。

收稿日期:2009-12-08修回日期:2010-03-01

1,2

1

1

1

呋喃(色谱纯);水(超纯水);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2 1 提取工艺研究 通过预试验得知,对提取物的干膏收率和有效成分含量影响较大的因素有溶媒用量、提取时间、提取次数、醇浓度和提取温度等因素。分析以上因素,将溶媒用量、提取时间、提取次数分别组合成溶媒用量-提取次数,提取时间-提取次数两个因素,与醇浓度和提取温度构成四个因素,每因素各设3

4

水平,选用L9(3)正交设计表。同时根据生产实际,设计因素水平。见表1,根据对工艺的影响作用的大小及预试验结果,规定干膏收率、总黄酮醇苷、萜类内酯含量的权重系数分别为0 2,0 4,0 4。

表1 银杏叶有效成分提取工艺正交试验因素水平表

水平123

A607080

B10(6,4)20(12,8)30(18,12)

C507090

D提取时间(h)2 0(1 0,1 0)3 0(1 5,1 5)4 0(2 0,2 0)

醇浓度(%)溶媒用量(倍)提取温度( )

取银杏叶药材,粉碎后,置干燥箱中干燥(60 ),取银杏叶粉末9份,每份约100g,精密称定,按表1中实验条件进行正交试验,重复3次,以平均干膏收率(%)和总黄酮醇苷、萜类内酯含量(%)为指标,筛选最佳工艺条件,结果见表2。

2 2 干浸膏收率和总黄酮醇苷、萜类内酯含量的测定2 2 1 干浸膏收率 取相当于生药50g提取液,浓缩

银杏叶有效成分的提取工艺

至干,置干燥箱中干燥3h(105 ),置干燥器冷却,称

重,计算。结果见表2。

2 2 2 总黄酮醇苷的含量的测定 按2005版!中国药典 方法测定。

2 2 2 1 色谱条件 分析柱:SinoChromODS-BP柱(4 6mm#200mm,5 m);流动相:甲醇-0 4%磷酸溶

-1

液(55 45);检测波长:360nm;流速:1 0mL min;柱温:35 。

2 2 2 2 对照品溶液的配制 分别取槲皮素、山奈素和异鼠李素对照品,置五氧化二磷减压干燥器中干燥过夜,精密称定,加甲醇制成浓度分别为31 g -1-1-1mL、28 g mL、19 g mL的混合对照品溶液。2 2 2 3 供试品溶液的的制备 取提取液,合并,过滤,浓缩,定容至1000mL,精密量取50mL(约相当于5g生药),浓缩至粘稠状(60 ),加甲醇20mL超声溶解,移入250mL烧瓶中,加25%的盐酸5mL,水浴回流30min,放冷,精密转移至50mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀滤过即得。

2 2 2 4 测定法 分别取对照品溶液和供试品溶液过滤后进样,进样体积10 L,测定,分别计算槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量,按%总黄酮醇苷的含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)#2 51&计算总黄酮醇苷的含量。结果见表2。

2 2 3 萜类内酯的含量的测定 按2005版!中国药典 方法测定。

2 2 3 1 色谱条件 分析柱:SinoChromODS-BP柱(4 6mm#200mm,5 m);流动相:正丙醇-四氢呋喃

-1

-水(1 15 84);流速:1 0mL min。

2 2 3 2 对照品溶液的配制 精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压真空干燥24h的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量,加50%甲醇制成每1mL含1 05mg、0 95mg、0 96mg、0 52mg的混合对照品溶液,摇匀即得。

2 2 2 3 供试品溶液的制备 按2005版!中国药典 方法测定。取银杏叶的乙醇提取液,合并,过滤,浓缩,定容至1000mL,精密量取15mL(约相当于1 5g生药),浓缩至粘稠状(60 ),加甲醇50mL,称定重量,超声处理20min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液20mL,回收甲醇,残渣加水,置水浴中温热使溶解,置分液漏斗中,加2%盐酸2滴,摇匀,用乙酸乙酯萃取4次(15mL、10mL、10mL、10mL),合并提取液,用5%醋酸钠溶液20mL洗涤,醋酸钠溶液,用乙酸乙酯10mL洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液,再用水洗各2次,每次20mL,合并水洗液,用乙酸乙酯10mL洗涤,合并乙酸乙酯液,回收至干,残渣用甲醇溶解并移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度、摇匀,即得。

2 2 2 4 测定法 分别取对照品溶液和供试品溶液过滤后进样,对照品溶液进样5 L、20 L,供试品溶液进样20 L,测定,用外标两点法对数方程分别计算白

果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量,按%萜类内酯的含量=白果内酯含量+银杏内酯A含量+银杏内酯B含量+银杏内酯C含量&计算萜类内酯的含量。结果见表2。

表2 正交试验结果

试验号

123456789k1k2k3R

A111222333

因素BC123123123

123231312

干膏收

总黄酮醇

萜类内酯含量(%)0 210 340 290 380 310 360 420 470 511.8402.0932.3930.553

综合评分

1 511 932 282 662 032 152 202 241 98

D率(%)苷含量(%)16 170 4823312231

7 639 1311 017 698 528 539 017 522.1232.0672.1370.070

0 660 850 760 930 750 810 620 681.9672.1902.1700.223

1.9072.2802.1400.373

2 3 正交试验结果 正交试验结果见表2,方差分析

结果见表3。

表3 方差分析

方差来源

ABCD

SS0.2130.0080.0920.460

自由度2222

F26 6251 00011 50057 500

﹥0 05﹤0 05P﹤0 05

F(0 05)(2,2)=19,F(0 01)(2,2)=99。

2 4 单因素条件试验 分别对表2中的干膏收率及总黄酮醇苷、萜类内酯含量直观分析,结果见表4。

表4 正交试验直观分析结果

指标

k1

k2k3R

总黄酮醇苷的含量

k1k2k3Rk1

萜类内酯的含量

k2k3R

A7 6439 0738 3531 4300 6630 8130 7030 1500 2800 3500 4670 187

B8 5708 1108 3900 4600 6830 7370 7600 0770 3370 3730 3870 050

C7 9008 7208 4500 8200 6170 7000 8630 2460 3470 4100 3400 070

D7 1278 2278 7172 5900 6970 7400 7430 0460 3430 3730 3800 037

干膏收率

2 4 1 干膏收率 分别以醇浓度(A)、溶媒用量(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为横坐标,以干膏收率(k1、k2、k3)为纵坐标作图,结果见图1。

2 4 2 总黄酮醇苷含量 分别以提取浓度(A)、溶媒用量(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为横坐标,总黄酮醇苷含量(k1、k2、k3)为纵坐标作图,结果见图2。2 4 3 萜类内酯含量 分别以提取浓度(A)、溶媒用量(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为横坐标,以萜类内酯含量(k1、k2、k3)为纵坐标作图,结果见图3。

银杏叶有效成分的提取工艺

2 5 结果分析

2 5 1 从表2、3可知,四因素对各评价指标的综合影响大小依次为D>A>C>B,且A2>A3>A1,B3>B1>B2,C2>C3>C1,D3>D2>D1,其中A、D因素对三项评价指标均有显著影响(FA=26 625,FD=

57 500)。从表4可知,对干膏收率的影响大小依次为D>A>C>B,且A2>A3>A1,B2>B3>B1,C3>C2>C1,D3>D2>D1

。

图1

各因素对干膏收率的影响

图2

各因素对总黄酮醇苷含量的影响

图3 各因素对萜类内酯含量的影响

对总黄酮醇苷含量的影响大小依次为C>A>B>D,且A2>A3>A1,B3>B2>B1,C3>C2>C1,D3>D2>D1;对萜类内酯含量的影响大小依次为A>C>B>D,且A3>A2>A1,B3>B2>B1,C2>C1>C3,D3>D2>D1。

2 5 2 从图1、2、3可知:随着醇浓度升高,萜类内酯含量随之升高,而其他二者均先增后降,说明并非醇浓度越高越好,而应据实际情况选择适当的醇浓度;随着溶媒用量的增加,对干膏收率的影响不稳定,且不显著,其他二者随之增加而增加,但趋势渐缓;随着提取温度的升高,总黄酮醇苷含量随之升高,而其他二者均

试验号

123

药材用量(g)99 8832100 0443100 4298

干膏收率(%)

8 468 728 43

1 87RSD(%)

先增后降,说明提取有效成分时,并不是提取温度越高

越好;随着提取时间的延长,三者均为增加趋势,尤其干膏收率增加明显,而其他二者趋势渐缓。

综上所述,从实际出发,应选择的最佳提取工艺为A2B2C2和D3。即:70%乙醇提取2次,每次2 0h,第1次加12倍量乙醇,第2次加8倍量乙醇,每次提取温度均为70 。

2 6 工艺验证 取银杏叶药材,粉碎后,干燥(60 ),取粉末3份,每份约100g,精密称定,按最佳工艺条件提取,测定干膏收率、总黄酮醇苷和萜类内酯的含量,结果见表5。可知,该工艺稳定。

RSD(%)1 95

萜类内酯含量(%)

0 3810 3830 371

1 70RSD(%)

表5 最佳工艺验证结果

总黄酮醇苷含量(%)

0 7490 7710 743

3 讨论

以预试验结果为基础,将影响因素进行科学筛选、组合,简化步骤,提高效率;采用正交试验法,以浸膏收率和有效成分含量为指标,筛选出了银杏叶的最佳提取工艺,该工艺省时,耗能少,简便可行,并按此工艺进

行了重复性试验,为下一步工作打下了基础。参考文献:

[1] 张丽颖 银杏叶的药理研究及临床应用近况[J] 中国药事,2006,20(2):114-117

[2] 韦丽华,李懿 银杏叶制剂的药理作用及不良反应[J] 海峡药

学,2007,19(7):101-102

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/gsm1.html