PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)

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第 1卷第2 1期 2 00 4年 3月

中国水产科学 J u n lo ih r ce c so ia o r a fF s ey S in e fChn

V11 N . o. l o 2 M ac rh 20 0 4

P R法制备地高辛标记 D A探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血 C N组织坏死病毒 (H V) I HN杨冰， 黄健，宋晓玲，史成银， 莉，刘刘庆慧(中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 267 ) 60 1

摘要：用非放射性标记物地高辛 ( I )通过 P R方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N利 DG, C IH V)D A探 N针，针长度 75b .探 0 p标记产量为 2 g I。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证，果 0n/ L x结表明，探针具有较高的灵敏度和较强的特异性，该检测 IH V D A的检出灵敏度为 2 . g可检出 2 . g患病对虾 H N N 4 8P, 66n组织 D A中的 IH V, 204n健康虾组织 D A、 25n健康虾匀浆液， N H N与 5 . g N 2 . g 0 白斑综合症病毒 ( S WSV)D A和肝胰腺 N细小病毒 ( P )D A均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、 HV N苗种的培育和无特定病原 ( P ) S F对虾种群的选育及 I H V流行病学调查， H N并具有较高的应用价值、

关键词：性皮下及造血组织坏死病毒 (H N ) P R探针；点杂交传染 I H V;C;斑中图分类号：9 14￥4 . 1文献标识码： A文章编号： 0— 77 20 )2 09— 4 1 5 83一(04 0— 0 5 0 0

传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N自 I H V)

本研究在已建立的 P R检测方法的基础上， C利

2 0世纪 8 0年代初在美国夏威夷地区养殖对虾中被用非放射性标记物一地高辛 ( I )过 P R方法制 DG通 C发现以来，分布的地理范围迅速扩大，其可感染世备 D A探针， N应用斑点杂交检测法检测传染性皮下界各地养殖对虾，尤其对对虾幼虾的危害最大，严重及造血组织坏死病毒 (H N。该方法的建立将为 I H V)影响养殖业的发展。

世界动物卫生组织 ( I )对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒病的诊断及无 OE,

水生动物健康法典 (三版 )将它列为“向 O E特定病原( P )第 需 I S F对虾选育提供可靠的技术手段。申报的甲壳动物重大疾病”一。随着世界贸易及之地区问流动的不断发展，迫切需要建立一种快速、灵1材料和方法1 1材料 .

敏的病毒检测方法。

原位杂交和 P R检测 I H V具有较高的灵敏 1 1 1对虾样品健康南美白对虾 ( eau 1, C H N .. P nes31 0, 1一

度

a e)病，但其所需仪器设备昂贵，操作复杂繁琐。核 n m i为本实验室提供；虾为引进南美白对虾仔

酸探针斑点杂交检测方法具有既快速又灵敏的特虾活体，长 0 7c共约 3 0尾。体 . m, 0点，在疾病诊断中得到广泛应用。。。C r等利用 1 1 2试剂和材料 1 ar .. 0×地高辛 ( I标记混合 D G)

D A提取试剂盒、性磷酸酶标记的抗地高辛碱商品化的 I H V核酸探针斑点杂交检测试剂盒物、 N H N( hi P o e一 I NV, D a xt s Wio . C S r rb m HH igoi, c ln t T,

( I抗体、高辛 ( I标记检测试剂盒、酸纤 D G)地 DG)硝

糖原 ( l oe )地高辛 ( I标记 D A产 g cgn、 y DG) N U A) S对南美白对虾进行 S F筛选， P同时设立原位杂维素膜、 oh公司，5m o g 1、 2 m￣LM Cz1 0交作对比试验，结果证明该方法是一种快速、敏、量测定标准均购自 R ce灵 可靠的诊断方法。利用非放射性标记物地高辛

xP R缓冲液、/ L T q D A聚合酶购自 Po C 5 U a N r—

ea其他试剂为国产分析纯。引物由本实验 ( I通过 P R方法制备 D A探针对对虾白斑综 m g公司， DG) C N合症病毒的检测已有相关报道。。但用该方法对室设计，上海生工生物工程公司合成。.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N检测 1 2方法 I H V) 12 1 D A的提取 . . N的应用在国内尚属首次。收稿日期： 0— 9— 3修订日期： o—1— 0 2 3 0 0; 0 2 3 1 2. o

分别取健

康和患病南美白对

基金项目：国家“7’ 93’重点基础研究项目( 19020 )助；岛市科技发展计划项目( 2 2一 j h 7 ) G 99 102资青 0— k— h一 4资助 作者简介：杨通讯作者：黄冰(9 5,,士研究生， 17一)女硕主要从事水产养殖动物疾病学研究 . E—m i aui ul、d s n a: qd@p bcq dc l s i健.E— a: qi pbcq .dC m i ads ul.d s.l l@ i l

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9 6

中围水产科学

第 1卷 1

虾鳃丝 2 5 g按 D A提取试剂盒说明提取对 5~ 0 m N虾鳃组织 I A )。 N

L )和 H V D A( P N 1

L, )各样品煮沸变性，冰浴

2n n每样取 l L点于硝酸纤维素膜上，0q烤膜 l, i 8 C

1 22 P R法检测 1 . . C HHN感染样品按史成银 2h6 C V ,5q预杂交 2h加入地高辛 ( I ), D G标记的 I H H—等 C“P R技术检测 I H\方法进行， H N同时设立健 N V探针 ( 0n/ L, 2 g m )杂交过夜，涤，入抗体，洗加显

康虾组织 D A及阴性对照： N1 23 P R法制备地高辛 ( I标记 D A探针 . . C D G) N 10 L反应体系中： 0 xP R缓冲液 l L 2 0 1 C 0 ,5 l L正向引物 ( 0, 1 p ) . L反向引物 ( . 03, L 1

色。2结果

m l/ g 18 L 1高辛 ( I ) n lLM C2 ,0x地 o D G标记混合物 2 1 P R反应产物琼脂糖凝胶电泳分析 . CP R产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 1由图中 C, p ) . L模板 ( 9 . g p 2 p,离子水结果可见，C . 03 L, 18 5 p/ . .去 L) L P R制备地高辛 ( I标记 D A探针和 DG) N6 . L混匀后进行一个热启动 9℃ 1 l 5感染 I H V南美白对虾 P R产物为 75b, 8 9t。 x 4 0 nn,5 i H N C 0 p与预设

5 l。加入 5U￣ a N nn i /x T qD A聚合酶 0 5 L按产物片段大小一致。 L ., 以下循环，进行 P R扩增：4 q 1n n 5 C l参数 C 9 C l,7q i nn 7 C l l, l,

2q i 4 i n n 0个循环；2。延伸 5B n4q保 7【= i; C温：

4 3 2 1 M b p

取出 l LP R产物作电泳分析， 9 C存 9

已标20 0 0 10 0 0 7 0 5 50 0 2 0 5 1O O

记的 P R产物中加入 2 g m C 0 r/ L糖原 ( l oe ) a g cgn y1 L 2 0 mmo D A( H 8 0 0 L 4 0 m lI ,0 UL E T p . )1, . o J

LC l. i1 10,

终止反应，加入无水乙醇 (一 0c 30 2 c)6

充分混匀后于一7静置 1 h 4条件下 0 ,

l 0 3 0g离心 3 l,去上清液， 7%乙醇 0 0 nn倾 i用 0 ( 2 C 50 L洗涤沉淀物， q一 0q )0 4 C条件下 1 0 0g 3 0 离心 1 t,去上清液，淀于室温晾 0nn倾 i沉 f后加入 4 LT 0 E溶解。 12 4 P R产物的琼脂糖凝胶电泳分析 . . C取1 2 2 . .

图1 P CR反应产物琼脂糖凝胶电泳分析图Fi . Ag r s e l c r ph r ss o h CR r du t g1 a o e g le e t o o e i f t e P p o c

及 1 23中 P R产物， 10、电压下于 15 .. C在 0 _ .%琼脂糖凝胶中电泳 4 l, 5n n紫外灯观察并拍照。 i12 5地高辛 ( I标记 D A探针产量的测定 .. D G) N

M: 1, 0D A分子量标准； .感染 I H V南美白对虾 P R结 D 0 N 2 0 1 H N C果；.健康南美白对虾 P R结果；.阴性对照 ( 2 C 3去离子水 )4地高；.辛 ( I) DG标记 IH VD A P R结果 H N N CM:D1,0 2 0 0 DNA L d e;L n l:DNA tmpae e ta tdfo I adr a e e lt xrce rm HHNV—

地高辛 ( I ) D G标记标准 D A进行 10p/,0p/ N 0 g L 1 gL l g,. p/,. 1 g, P/ L 0 1 g L 0 0/ L梯度稀释； P地高辛 ( I际记 D A探针进行 1一，/ ~,/ D G) N 0 13x1 0 19 x1~,/ 7 x1一，/ lx 1~梯度稀释，取 0 12 0 18 0 各

i f c e H e

Ⅱn a￣i a n 2:DNA e l t x r c e r m HH— n e t d Pe nⅡ n n:L e t mp a e e t a t d fo I

NV—fe n P sⅡ n re PeⅡ u n ame; L n 3: Ne a ie c nrl a n 4: I i ae g tv o to;L e HHNVDN fo Pe a u a n n a e e y d g x g n n A r m n e sv n a￣il b l d b io y e i

. C D G) N l I 点于尼龙膜上，按地高辛 ( I标记检测试剂 2 1 P R制备地高辛 ( I标记 D A探针产量 D G)测定结果盒说明操作。

12 6地高辛 ( I标记 D A探针检测传染性皮 .. D G) N

D A探针测定结果见图 2通过对杂交斑点显 N,

计 H N N下及造血组织坏死病毒 (HH V)异性用 P R色深浅和显色面积大小，算得 I H V D A探针 I N特 C 0n/ L方法制备的地高辛 ( I )记 D A探针检测 I H 的质量浓度约为 2 g。 DG标 N H— . D G) HH V D A N N病虾组织 D A,康虾组织 D A,康虾 2 3地高辛 ( I标记 I N N探针斑点杂、 D A, N健 N健

组织匀浆液， S N和 H V D A。将 I H V交检测各样品 WS V D A P N H N检测结果见图 3其中 A~ 9为 I H V D A;, l A H N N D A( 9 . g L,虾组织 D A( 1. g N 18 5 p/ )病 N 2 2 7 n/ l B N C 9为健康虾组织 L, )健康虾组织 D A( 5 . g L,康虾组织 B~ 9为病虾组织 D A; 1~C N 20 4 n/ )健 N D~D E为 S N 匀浆液 (0 . g L按 l 2 l 4 1 8 1 1、:2 D A; 1 9为健康虾匀浆液； 1 WS V D A; 2 2 5n/ ):、:、:、:6 l 3、2为 H V D A; 3为 T P N E E缓冲液； 4为采样液 E 1 6 l 18 1:5:4、:2、 2 6梯度稀释， S A( 7 g E WS V DN 35 n/

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第2期

杨

冰等：C P R法制备地高辛标记 D A探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N ) N[H V

9 7

( E P— S ); 5~ 9为空白对照。 S M SC E E

1 2 3 4 5

现。西半球大多数养殖南美白对虾和红额角对虾 A B C D Er

中都有感染，感染的对虾没有明显的外观症受I

状，’。但可引起南美白对 2 虾慢性疾病“虾幼矮小残

A●

●

缺综合症”即 R S。Lg t r¨ ( D) i n等研究发现感 he 3

B●

染传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N ) I H V或患病 4后存活下来的红额角对虾和南美白对虾会终生带 5

图 2 P R制备地高辛 ( I标记 D A探针产量测定结果 C D G) NFi . Pr du to fI HNV g 2 o c i n o H DNA o e l b ld b i o y pr b a e e y d g x -g nn e i

毒，并可通过垂直传播和水平传播把病毒传给下一 6代和其他种群。也有报道 7养殖的中国对虾 ( eau, P nes ci ni携带病毒，通过电子显微镜超微结构 h es ) n s且8 观察发现受精卵细胞内有传染性皮下及造血组织坏 9 死病毒 (H N感染¨ I H V)。由于该病毒病不同于对虾白斑综合症具有明显的外观症状，因此对疾病的诊断带来一定困难。本实验中的患病南美白对虾外

A—A:高辛 ( I标记 I H V D A探针 l l 5地 D G) H N N O~,/ l 3×1~,/ 0 19× 0, 2×1~,/ l× 0; 1 B:高辛 ( I标记 D A 1 1 7 0/ 18 1~ B 5地 DG) N

产量测定标准涕度 1 gI, g I, p/ L0 1p/ L 00 0 p 1 p L l gI,. gI, . 1 0/L 0/ L L L Lp/I gL LAl— A5:3一 fl eily d ltd io y e n— lb ld H HNV po e: od s ral iue dg x g ni a ee I rb Bl’B5:1一tl e al i e g x g ni 0 bd s r ly dl d dio y e n— lb ld c nr lDNA i ut a ee o to

观健康，无临床症状，研究结果表明其携带传染性皮下及造血组织坏死病毒 (H N。在养殖或区域间 I H V)

用 P R制备地高辛 ( I标记 I H V探针斑流动过程中极有可能将病毒传播开，生潜在的威 C DG) H N产点

杂交检测 I H V D A的检出灵敏度为 2 . g H N N 4 8P,胁。 可检出 2 . g 6 6n病虾组织 D A中 I H V, 2 0 4 N H N与 5.WS、 D A和 I gH V D A均不发生交叉反应。 S N P N

分子生物学诊断技术在水产养殖疾病中的应用 (H N ) I H V是无囊膜的二十面体，子大小为 2 m,粒 2n

n健康虾组织 D A、0 . g g N 2 2 5n健康虾匀浆液，7 g正迅速地发展，染性皮下及造血组织坏死病毒 3 5n传

线性单链 D A, N长度为 4 I b。本研究对 I H V . k H ND A探针特异性检测结果表明，探针对 I H V N该 H N

D A的检出灵敏度为 2 . g且与健康虾组织 N 4 8p, D A、 N健康虾匀浆液及对虾白斑综合症病毒 ( S WS V)D A和对虾肝胰腺细小病毒 ( P N H V)D A均不发生 N

交叉反应，明其具有较高的灵敏度和特异性。应说用 P R方法可快速、量地合成特异性探针， C大通过斑点杂交进行大批量样品检测，作简便、全，操安易图 3 I H V D A探针斑点杂交检测各样品结果 H N NFi . Do g3 t— b o y rdia i n t e e t I l t h b i z to o d t c HHN V DNA f o s m p e s n i o y e i—l b l d pr b a ls u i g d g x g n n a ee o e

于推广。本方法的建立可有效指导健康亲虾、苗虾和 S F种群的选育及 I H V流行病学调查， P H N有利于

A~ 9 I H VD A2梯度稀释； I B:虾组织 D A2倍梯 l A: N N倍 H B~ 9病 N

我国对虾养殖的健康管理。该方法可通过斑点显色的强度初步判定样品感

度稀释：I 9健康虾组织 D A 2梯度稀释； I一3:康虾匀 C—C: N倍 D 1健 9浆液 2倍梯度稀释； l WSV D A E: P N; 3 T E: S N: 2 H V D A E:E缓冲液；E:样液 ( E P— S ) E 4采 SM S C;5一E:白对照 9空Al—A9:2一fl e al ltd I o ds r lydi e HHNV DNA:BI—B9:2一fl ei— i u od sra l

染 I H V程度的强弱及

携带病毒的情况， H N不适于对病毒感染活性的估测，有关组织细胞的感染程度及其病毒扩增状况可应用原位杂交做进一步分析研

l i td DNA xrce r m HHN\一 ifce h mp: CI— C v dl e u e ta td fo I ne td s r i 9:2一fl eilv dltd DNA xr ce rm HHNV—fe h mp;DI— I: od s ral i e u e ta td fo I re s r i ) 9

究。参考文献：『] Lg te 1 ihB rD V.R d a , e e m nR M B lT A.Ifc osh p dr l a d l net u yo ema n ih mao oei e rss wl e o nz d vr ie s fp n ed e tp itcn co i,ane y rc g ie iusd sa eo e a i

s e aa to HHNV— fe h mp i S uD m tn fI re s r n EMP— S C; El W S V i S: S DNA;E 2:HPV DNA;E3:TE u e;E4:S bfr EM P— S C;E5一 E S 9:Bln f a k o c nr l 0 to

3讨论传染性皮下及造血组织坏死病毒最初在美国夏威夷地区养殖红额角对虾 ( eau s lots中发 P nes t i si) y r r

sr p J . ne ertPto g, 9 3 4:2— 0 h m[] Iv t a a l y 18 . 2 6 7 - i rb e h o『 1 K aaa 2 a g y H.G dn D,K n e .I l n -i o n a aR, t 1 a HHN v u s t lg i s e oo。 r aa i n

ia fc ri L t eomi y do ( D ) o vnl P n es cl at ngB—dfr t sn rme R S f u e i eau o I y j e

dr, cl r n H w i[] Wo d A uclr Sc t. nⅡ ut e i a a J‘, ud i r qauue oiy l t e

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9 819, 2 4:3 2 3 9 1 2 ( ) 2 5~ 4 .

中国水产科学20, 12: 1 24 0 1 3 ( )2— 0 . 0

第 l卷 1

:: O i ne aoa dsE i oe i n scm n a f 0 ac 3 tc I r tnl e

pz ts a ot aul raut i e t n i o i D g i o iaia d ess M] 3de.20 . 5 26 n l i ae[ . r d 00 23— 6 m s4一

Nu n L M . De eo me t fa n n— rdo cie g n r b y na v lp n o o a ia tv e e p o e b

P Rf e co h eptydo e i s wsv[] vr C r t tn f i osnr r ( s ) J . i o d ei ow ts m v u .oo ia t o,1 97 6 1 3—2 . lgc lMeh ds 9 3:9 01,

Lg te V,Po lsB T.B u eL e 1 ihn rD u o rc ta.De eo me ta d a p i v lp n n p l—,

c to fg n mi r b sfru e a ig otca d rs ac e g ns aino e o cp o e o s sda n si n e e r hr a e t frte P na i h i n'vr ssI 0 h e ed s rmppa o i e HHNV a d HP a A— u n V nd BP USMS 0t An ies r FP 1 h n v ray.

史成银，黄

健，杨

冰，应用 P R和 R等. C T—P R技术对 4 C 健，核酸斑点杂交分析法检测对虾皮等.

种对虾病毒的检测[]海洋水产研究， 0, 4 1:— . J. 2 3 2()1 5 0 史成银，玲，宋晓黄( ):8 5 4 6—4 0 9.Lg te ,Re ma M .BelT ihn rD V d n R l A. Dee t n o HHN i s tci fI o vr u

R v w:: C L Sei ula ei C .G R: pc P b c— e l a i

t n,1 9 i o 9 4. 1: 9— 8 5 5

下及造血组织坏死病毒 ( H B ) J .海洋与湖沼， 9, 0 H N V[] 1 9 3 9

5 L h e Pu s ,B c, t 1 e ee p et i: i t r V, ol T r eL e a.N wdvl m n gn D oB u o snP na i i o:Ap lc to fbo e h oo yi e e c n s e ed vml￣- p iaino itc n lg n rs a h a d di— r

e e i n s r h m i ss f ocr

eA ecs A . s dg s si a a oif r pv e ne i t m r a:: o u r oc n nh iDie s so utr d P n ed s rmp i i nd t ie tts s a e fc l e e a i h i n Asa a he Untd Sae u

i P nesti siad vra e ipr dioH w iJ . n eau s lots n a m im ot t a m[] y r r m e n W o l rc lu eSo it rd Ma iutr cey,1 3,1 21—2 5 98 4: 2 2 Lg te D ihn r V A h db o f s rmp ah lg a d ig s c n a o k o h i p t oo y n da not i.

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6 Vvrs , uso ulc c rbsnaut at io: i e P G e nJ c iaipoe i q ac c r 1 a C d N e d ib eo—g L j A uc l r,19, 0:4 1 4 q aut e 9 2 1 7 17— 5 . J u

p cdrs fd esso cl r eai s ip[ .B t r eue o i a f uue pne h m M] a n o s e t d d r oRo g u e:W ol u c lu e S cey,1 9 rd Aq a utr o it 9 6.

7 Cnw S eny N nn . t . h s o a f tu: a" H, w ee N, ua ea T e e fni e i s J L 1 u n coh p d r l d e tp itc n co i i sg n rb eo ig y o ema a h mao oei e r ss vr e e p o e s rda— n u n si ed k tor te ce nng o a dd t s e i c ah g n— o tcf l i i f h sr e i f c n iae p cf p to e i

S n Xiqn,Z a g Jn i g A su y o a o e so hn s u ui h n ix n t d n p t g n f C ie e h

panvu i ae[] h cao L nl 95 3 3: r i s s w r de s J .C i O enl i o,19,1( ) n m2 4—28 . 8 8

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8

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9雷质文，银，:史成黄

26 4 6

杂交检测白斑综合症病毒 ( S::青岛海洋大学学报， WS\) J

De e t n o HHNV n s rm p b o l th b i i a i n wih d g x g n n l b ld t c i fI o i h i y d tb o y r d z to t i o i e i a e e

DNA r b y PCR p o ebY G Bn, UA G J,ON iol g S IC egyn LU L,I igh i AN ig H N i S G Xa—n,H hn—i,I iLU Qn—u e i( e o e ihr sR sac ntue hn s c d m f i eyS i cs Q n do2 6 7,C ia Y l w S aFsei eerhIs tt,C ieeA ae yo s r c n e, ig a 6 0 hn ) l e i Fh e 1 Ab ta t HHNV ( ne t u p d r l n mao oei Ne rssVi s sr c:I Ifci sHy o ema d He tp it co i r )DNA lb ldb o o a c u a ee yn n—rd o c a ia—t e lb l

dg xg n n u ig P a sd a rb o ee t gI i a e io ie i sn CR w su e spo efrd tci HHNV o h i . T e sz fteDI— l— r n fs r mp h ie o G h a

b ld fa me t s7 5 b n h a ee rd cinwa 0 n/n o lth b d zt n tes n i v ee rg n 0 p a d t elb ld po u t s2 g L wa o igd t o y r i i h e st— b i ao ii n p cfct e etse t HHN DNA,DNA e t ce rm HHNV—if ce h i t a ds e i i w r e tdwi I v i y h V xr tdfo I a n e td s rmp,DN e t c A xr— a.

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