HPLC操作规程和注意事项

HPLC操作规程

1.所需的流动相，应该用合适的0.45μm滤膜过滤。

2.样品溶液和标准溶液 ，也应该用合适的0.45μm滤膜过滤，滤膜也分为水相和有机相。

3.开机顺序：开泵，开检测器，进入色谱工作站。

4.泵的启动：用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（9ml/min)或用冲洗键 PURGE 进行排气，观查出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。

5 .将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏，初始平衡时间，一般约需30分钟。平衡的标志是泵压不波动和基线平直，说明已经平稳。

6. 检测器的开启：开启电源，选择光源（氘或钨）灯，选定检测波长，待预热15分钟方可用于分析测试。

7.压力表无压力显示或压力波动时不能进行分析，应检查泵中气泡是否已排除，各连结处有无漏液，排除故障后方能进行操作。如压力升高，甚至自动停泵，应检查柱端有无污染堵塞，如有堵塞，应该用相应的溶剂清洗。如果清洗不了，可小心卸下开柱的进口螺帽，挖出被污染填冲剂后，补入同类填充剂，仔细安装好，再进行操作。

8.分析完毕后，先关检测器和色谱工作站，再用适当经过滤和脱气的溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水然后用甲醇冲洗，再用分析流速冲洗，各冲洗溶剂一般冲洗30-60分钟，特殊情况应延长冲洗时间，粗的柱子流速控制在0.5ml/min以下,细柱控制在0.5ml/min以下。 9. 关机顺序：退出化学工作站，接着关检测器，最后关泵。开机顺序刚好和关机顺序相反。

HPLC使用注意事项

1. 含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜，最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。 2. 气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 3. C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 4. 每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

5. 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6. 不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 7. 更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振荡边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 8. 不要高压冲洗柱子，不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱

9. 溶剂瓶中的砂芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤； 10. 操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。

11. 在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。 12. 装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。 13. 使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。 14. 如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

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