TRIzol法提取RNA
更新时间:2023-12-09 14:46:01 阅读量: 教育文库 文档下载
总RNA提取(TRIzol法)
仪器和材料:氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头(1000μL,200μL,
10μL)、移液枪、无RNA酶EP管(有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格)、75%乙醇(尽量现配现用,配制好后置于4℃冰箱待用)、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等
注:上述材料标记好提RNA专用,自己保管好!
操作步骤:
1.细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol,贴壁细胞直接加TRIzol裂解,(1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol,可根据需求来添加),裂解数分钟(5~10分钟,可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况),反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。
2.将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中,每个EP管做好标记,按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,用力振荡(手动)15秒,在室温下放置10~15分钟(观察到明显分层即可);然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。
3.将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内(离心后分为3层,注意吸取第一层水相时不要吸到第二层,一般可吸到500μL左右),按照每1mL TRIzol加500μL异丙醇的量加入异丙醇,盖上EP管盖子,轻轻颠倒混匀,在室温下放置10分钟,然后4℃离心机12000rpm离心10分钟。
4.轻轻弃掉上清,避免把沉淀倒走,如果是较多的贴壁细胞可观察白色的沉淀(上清或者少量细胞看不到),按照每1mL TRIzol添加1mL75%乙醇进行洗涤,上下颠倒混匀,室温放置5分钟,然后4℃离心机7500rpm离心5分钟。
5.轻轻弃掉上清液,将EP管管口倒置于滤纸上,吸掉残液,让沉淀的RNA在室温下自然干燥,5~15分钟(残留的水分不要太多,也不要晾的太干了)。
6.用DEPC水溶解RNA沉淀,一般为20μL(10~20μL均可,加入水量太多会导致单位体积RNA浓度过低)。
注意事项:
1.用TRIzol法提取RNA时,将离心机设置到4℃提前预冷,将离心机内擦拭干净(均在4℃温度下离心);
2.操作台面用酒精擦拭,保持干净、整洁,佩戴手套,口罩、穿戴实验服; 3.所有加样需要在通风橱进行操作!
4.本方法适用于贴壁细胞,细胞悬液,动物组织;
5.如若在6孔板等细胞培养板里单独提取几个孔的RNA时,加入TRIzol后请用Hanks清洗至少两遍,残留的TRIzol会导致其他孔的培养细胞脱落;
6.如若当天不提取,加入TRIzol后的样品可置于-80℃超低温冰箱保存。提取后的RNA放置于冰盒上,最好马上进行反转录反应,隔天置于-20℃,超过3天放置于-80℃超低温冰箱贮存,RNA容易发生降解!
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