丝羽乌骨鸡BAC文库的构建和黑色素相关基因TYRP1和ID的研究

中国农业大学

博士学位论文

丝羽乌骨鸡BAC文库的构建和黑色素相关基因TYRP1和ID的研究

姓名：刘薇

申请学位级别：博士

专业：生物化学与分子生物学

指导教师：李宁;胡晓湘

20040601

摘要

为研究丝羽鸟骨鸡体内黑色素合成和沉积的分子机制，本研究构建了丝羽乌骨鸡的基因组细菌人１：染色体（ＢＡＣ）文库。利用构建的ＢＡＣ文库对Ｚ染色体上黑色素相关基冈酪氨酸酶相关蛋白ｌ基冈（ＴＹＲＰＩ）的基冈结构以及该基因的表达与黑色素沉积的关系进行了研究，同时构建了位于ｚ染色体上缺乏标记区段的表皮黑色素抑制因子基因（／／３）的ＢＡＣ重叠群。

（一）本文构建了中国特有的丝羽鸟骨鸡的ＢＡＣ文库，结果如ｒ：

（１）该文库共有１３８，２４０个ＢＡＣ克隆（分为７２个超级池，每个超级池由２０块９６孔板组成）。

整个文库以两级３维的结构保存，建立了高效快速的ＰＣＲ筛选系统。

（２）对随机挑选的４５２个ＢＡＣ克隆的插入片段进行鉴定估计文库的平均插入为１１８ｋｂ，文库的基网组覆盖率为１３．３４倍，预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为９９．９８４％。用４０个微卫星标记和８个功能基因对整个文库进行ＰＣＲ筛选，得到的平均田｜性克隆数分别为１０．４２３和１１．１２５。对３２个ＢＡＣ克隆的荧光原能杂交结果表明，文库的最大嵌合率为６％。

对筛选得到的６个含ＬＭＢＲｌ序列的ＢＡＣ克隆酶切分析的结果表明ＢＡＣ克隆之间是相互重叠的。

（二）本文对ｚ染色体上与黑色素相关的基因ＴＹＲＰｌ和仍的研究结果如Ｆ：

（１）获得了１０，０６６ｂｐ的ｒ玎冲』的全长基因组序列，分析结果表明：丝羽鸟骨鸡的ＴＹＲＰｌ外显子与人的ＴＹＲＰｌ外显子同源性为７０．１％。鸡ＴＹＲＰｌ基冈比人ＴＹＲＰｌ基冈缺少１个内肯子：内含子中有２个微卫星序列。利用内含子１中的微卫星对家系进行基冈组扫描，卡方检验结果表明删，与皮肤色和爪色显著相关（０．０Ｉ＜Ｐ＜Ｏ．０５），和胫色极显著相关

（Ｐ＜Ｏ．０１）。用荧光原位杂交进行ＴＹＲＰｌ的染色体定位，首次将７１朋矿，定位在ｚ和ｗ染色体长臂近着丝粒的位置。

（２）在丝羽乌骨鸡、白莱航鸡、绿壳蛋鸡和寿光鸡的ＴＹＲＰＩ的７个外显子和内含子６中寻找ＳＮＰ．比较ＰＣＲ产物测序结果，只在内含子６中发现两个ＳＮＰ。经过预测，发现其中的一个ＳＮＰ可能使丝羽鸟骨鸡的内含子６中出现了新的转录冈子的结合位点。对丝羽鸟骨鸡ｎ碾Ｐ，内含子６中相对于其他３种鸡的突变序列进行的凝胶阻滞试验，证实了丝羽鸟骨鸡的ＴＹＲＰｌ在这个突变位置产生了与转录因子的结台伉点。

（３）＿ＬＩＪＲＴ－ＰＣＲ检测丝羽鸟骨鸡Ｏ．５到１６天胚胎各组织中ＴＹＲＰｌ的表达，结果表明ＴＹＲＰＩ在６大的鸡胚眼中开始表达，１０天以后开始在其它组织依次表达。ＲＴ－ＰＣＲ检测闩莱航和鸟骨鸡的８天、１６天胚胎和出生后２天各组织的ｎＲ．Ｄ』表达，结合对表型的观察发现，鸟骨鸡各组织中黑色素的沉积随ＴＹＲＰｌ的表达出现，而向柴航（除肾脏外）只在有黑色素沉积的眼睛中表达ＴＹＲＰＩ，其他组织既无ＴＹＲＰｌ的表达也无黑色素沉积。可见ＴＹＲＰｌ的表达与黑色素的沉积前１分布是一致的。

（４）以离ｚＤ摄近的ＡＣＯｌ（ａｃｏｎｉｔａｓｅ１，顺鸟头酸酶）基因为起点，设计引物筛选含ＡＣ０１的ＢＡＣ克隆，ｆ【＿Ｉｊ染色体步行的方法得到１６个ＢＡＣ克隆。通过ＢＡＣ指纹分析，构建起包含１３个克隆，覆盖了３８７ｋｂ的ＢＡＣ重叠群。通过荧光原位杂交确认了这个重叠群处于Ｚ染色体末端。

中国农业大学博｛。学位论义摘要本研究构建了中国特有鸡种丝羽鸟骨鸡基因组ＢＡＣ文库并进行了文库质鼙鉴定，它所具有的１３倍高基冈组覆盖率、６％的嵌合率和部分重叠的克隆使其成为完善鸡的基因组幽谱、研究基因功能和构建ＢＡＣ重叠群的优质资源。其次。本文对首次测定的ＴＹＲＰｌ的全基因序列和ＳＮＰ进行分析，发现丝羽岛骨鸡的ＴＹＲＰｌ具有与其它鸡种不同的微卫星标记和转录调控位点，说明ＴＹＲＰＩ的序列和ＳＮＰ造成的表达调控的变化可能与乌骨鸡独特的黑色素沉积方式有关。通过对乌骨鸡与白莱航鸡不同发育期胚胎的ＴＹＲＰＩ表达谱和对鸡胚的黑色素沉积时间和分布的观察，进一步证明了力１妒，与黑色素沉积存在密切的关系，为研究丝羽鸟骨鸡体内黑色素沉积的分子机理提出了新的假设和新的证据。最后，本文在ＩＤ基因区域进行染色体步行，构建了覆蔫３８７ｋｂ的ＢＡＣ重叠群，建立了构建染色体未知区域物理图谱的技术方法、Ｊ，ｊＩＤ基网朱来的定能和克隆打Ｆ了良好的基础。

关键词：黑色素，丝羽乌骨鸡，ＢＡＣ文库．ＴＹＲＰＩ，１Ｄ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

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ｑ∞．ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＴＹＲＰｉｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｎｄｉｔｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｅｌａｎｉｎａｃｃｎｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄＴＹＲＰＩｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａＢＡＣｃｏｎｔｉｇｎｅａｒ／ＤｌｏｃｕｓｗｈｉｃｈｗａｓｏｎａｒｅｇｉｏｎｓｈｏｒｔｏｆＤＮＡｍａｒｋｅｒｉｎＣｈｒ．Ｚ．

Ｉ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＳｉｌｋｙＢＡＣｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：

（Ｉ）ＴｈｅｃｈｉｃｋｅｎＢＡＣｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆ１３８，２４０ＢＡＣｃｌｏｎｅｓｉｎｔｏｔａｌ（７２ｓｕｐｅｒｐｏｏｌｓ，ｅａｃｈｆｏｒ２０９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ）．Ｔｈｅｓｔｏｒｅｄｌｉｂｒａｒｙｗａｓｏｒｇａｎｉｚｅｄｉｎｔｗｏｇｒａｄｅｓａｎｄ３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔａｎｄａＰＣＲｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｗａｓｂｕｉｌｔ．

（２）Ａｖｅｒａｇｅｉｎｓｅｒｔｓｉｚｅｏｆｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｉｓ１１８ｋｂｅｖａｌｕａｔｅｄｆｒｏｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆ４５２ＢＡＣｓｒａｎｄｏｍｌｙｐｉｃｋｅｄｆｒｏｍｌｉｂｒａｒｙ，Ｓｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｃｏｖｅｒａｇｅｏｆｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｉｓ１３．３４ａｎｄｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｔｏｆｉｎｄａｓｉｎｇｌｅ—ｃｏｐｙｇｅｎｅｉｎｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｉｓ９９．９８４％．Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｂｙ４０ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓａｎｄ８ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅ１０．４２３ａｎｄ１１．１２５ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄｍａｘｉｃｈｉｍｅｒｉｓｍｒａｔｅｉｓ６％ｅｓｔｉｍａｔｅｄｆｒｏｍＦＩＳＨｒｅｓｕｌｔｓｏｆ３２ＢＡＣｓ．ＰＦＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆ６ＥｃｏＲＩｄｉｇｅｓｔｅｄＢＡＣｓｃｌｏｎｅｓｗｈｉｃｈＷｅｒｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｌｉｂｒａｒｙａｎｄｃｏｎｔａｉｎｅｄＬＭＢＲＩｓｅｑｕｅｎｃｅｐｒｏｖｅｄｔｈｅｏｖｅｒｌａｐａｍｏｎｇｔｈｅＢＡＣｓ．

１１．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｓｔｕｄｙｏｎＴｙＲＰｊａｎｄ／Ｄ：

（１）Ｗｅｆｉｒｓｔｓｅｑｕｅｎｃｅｄｔｈｅ１０，０６６ｂｐｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎｒ豫Ｐ，．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔ：ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｕｍａｎＴＹＲＰｊ．ｃｈｉｃｋｅｎＴｙＲＰｌｉｓｓｈｏａｏｆａｎｉｎｔｒｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｔｗｏｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｉｎｉｎｔｒｏｎｓ．ＧｅｎｅＳｃａｎｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｉｎｒｅｓｏｕｒｃｅｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｉｎｉｎｔｒｏｎｌｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔＴＹＲＰｉａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｃｏｌｏｒｏｆｓｋｉｎａｎｄｃｌａｗｏｎａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｖｅｌ（０．０１＜Ｐ＜Ｏ．０５）．Ａｎｄｒ豫Ｐ』ａｆｆｅｃｔｓｌｅｇｃｏｌｏｒｏｎｅｘｔｅｍｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｖｅｌ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｈｉｃｋｅｎ力便Ｐ，ｅｘｏｎｓｓｈｏｗ７０．Ｉ％ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｈｕｍａｎｅｘｏｎｓＦＩＳＨｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｔｈａｔＴＹＲＰｌｌｏｃａｔｅｓｏｎｔｈｅｌｏｎｇａｒｍｏｆＺａｎｄＷｎｅａｒｔｏｔｈｅｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ

（２）ＷｅｓｅａｒｃｈｅｄｆｏｒＳＮＰｓｉｎ７ｅｘｅｒｔｓａｎｄｉｎｔｒｏｎ６ｏｆｒ】：ＲＰ，ｂｙＰｅＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｕｓｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍ４ｂｒｅｅｄｓ．ＴｈｅｙａｒｅＳｉｌｋｙ，ＷｈｉｔｅＬｅｇｈｏｍ，ＢｌｕｅＳｈｅｌｌＬａｙｅｒａｎｄＳｈｏｕｇｕａｎｇ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ２ＳＮＰｓｉｎｉｎｔｒｏｎ６．Ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｗａｓｆｏｒｅｃａｓｔｅｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｉｎｉｎｔｒｏｎ６ｏｆＳｉｌｋｙＴｙＲＰｉＧｅｌ—ｓｈｉｆｔｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｉｓｍｕｔａｔｉｏｎｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅａｒｏｕｎｄｔｈｅｍｕｔａｔｅｄｓｉｔｅ．

（３）ＴＹＲＰ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｒｏｍ０．５ｔｏ１６ｄａｙｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ

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Ｖ

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：Ｉ＇Ｗ：垆。尹年Ｃ，ｑ∥日

关于论文使用授权的说明

…烹人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留煮享篓吝竺复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复型三粤孽存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。‘‘。

（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）

研究生签名导师签名

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文献综述

引言

人类基因组计划在美国正式启动以来己获得了巨大进展，２０００年底人类基冈组的序列草图绘制成功。随后的儿年，全世界的分子生物学家和遗传学家都从人类的基闭组图谱中获得了人量宝贵的信息席崩于白己的研究，促进了整个生命科学领域的发展。随后，果蝇、小鼠、斑马鱼等模式动物的基冈组计划也迅速的开展起来并敬得了丰寓的成果。

基冈组物理图谱不仅是基冈组测序的产物和基冈图位克隆的桥梁，而且对研究基冈的结构、功能、时空表达调控以及基因间的关系研究都是极其重要的。模式生物的全基冈组物理图谱一旦得以构建，即可通过基因组序列分析找到大量的功能基冈，还能发展新的分子标记以增强遗传图谱上分子标记的密度，加速基因图位克隆的进程。

鸡是脊椎动物中唯一的鸟类模式生物，在发育生物学、免疫学等基础生物学研究中发挥着重要的作用。最甲．在鸡中发现了Ｂ淋巴细胞以及病毒的肿瘤特性，抗体的基因组合选择形成机制，脊椎动物形态发生过程的分子机制。以及免疫系统（ＭＨＣ）的分子和基因组进化机制等（ＢｒｏｗｎＷ．Ｒ．Ａ．ｅｔａ１．。２００３）。鸡作为模式生物的优势在于：①拥有众多的近交系可供选择，每一近交系都有经过选择的独特的疾病和生产性状；②亲本群体可以产生大最的Ｊｉ彳裔家系，并进行个体性状评定，从而减少遗传试验的负担：③商业＿｝＝｝ｊ鸡只都有准确的系谱记录，成本低廉：

④红细胞有核，有助于大规模、高品质的ＤＮＡ提取：⑤鸡的基因组较小，约是哺乳动物的一’ｈ较易了＿＿克隆所要研究的基因；⑥鸡胚胎发育过程大都在体外进行，易丁操作，是发育生物学研究的极好实验材料。而且，研究发现鸡同人之间基冈组序列的同源性或同线性（ｓｙｎｔｅｎｙ）

程度要高于其与鼠之间的同源性，能利用人类基因组计划的数据和结果进行比较基冈组学研究，阐明鸡的基冈组功能。

继人、小鼠和果蝇等模式动物的测序计划之后，鸡的基因组测序计划被提到日程上来。为了鸡的基因组测序丁作．世界上的几个课题组构建了鸡的基因组细菌人■染色体（ＢＡＣ）文库，用以测序的ＢＡＣ重叠群构建丁作和测序：１：作于２００３年底已基本完成，部分序列己Ｔ＇２００４年３月释放。但是所有的文霹都不可能覆盖全部的基因组，而且测序工作中必然会存在困难和错误．所以目前得到的序列数据中还有大量的缺口需要填补。在很长的时间内鸡的基因组图谱还需要利用其它的基因组文库对其进行补充和完善。

本文构建的具有高基因组覆盖率的丝羽乌骨鸡的基冈组ＢＡｃ文阵，对于鸡ｆｌ匀基冈组测序ｒ作是非常有价值的资源，可以用以补充和完善现有的基冈组幽谱。

另一方面，人类的许多疾病都与黑色素有芙，如黑色素瘤、着色性干皮痈、帕金森氏症、亨廷氏舞蹈症等。本文朋以构建基田组文库的中国的地方鸡种丝羽鸟骨鸡，与其它鸡种相比体内含有人蟹的黑色素，是研究黑色素沉积和分布机制的理想研究对象。基于二鸡的模式动物的地位，研究黑色素基因在鸡中的表达和调控及对表型的影响必然会对人类与黑色素沉积相关的疾病的研究提供重要的参考信息。

为了研究黑色素沉积和分布的机理，本文利用丝羽鸟骨鸡的基闳纽ＢＡｃ文库，应用比较基因

中国农业大学博士学位论文第一章立献综述组学和鸡的遗传图谱、物理图谱的研究结果和研究方法，对位于ｚ染色体上影响丝羽鸟骨鸡的黑色素沉积的候选的基因（ＴＹＲＰＺ）进行了基因结构的分析和它的表达与黑色素沉积的芙系的研究。对用传统遗传学方法定位的影响胫色的表皮黑色素抑制基因（ｄｅｒｍａｌｍｅｌａｎｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｇｅｎｅ，ＩＤ）所在区段进行了ＢＡＣ重叠群构建的丁作，期待在不久的将来可以克隆这个基冈。

２

１鸡的基因组研究

基闭组学（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）是遗传学研究进入分子水平后发展起米的一个分支，主要研究生物体内全基因组的（ｇｅｎｏｍｅ）的分子特征。一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组或染色体组，它包含了该物种自身的所有基因（朱军，２００１）。

基因组学的重要组成部分是基因组计划（ｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），人体可分为Ａ．构建基因组的遗传图谱（ｇｅｎｅｔｉｃｍａｐ）；Ｂ．构建基因组的物理图谱（ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐ）；Ｃ．测定基冈组的全部序列；Ｄ．构建基因组的转录本图谱：Ｅ分析基因组的功能。

基冈组计划的开始始于１９９０年人类基因组计划（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＧＰ）的启动。１９９６年构建了标记密度为０．６Ｍｂ的人类基因组遗传图谱。２０００年完成了人类基冈组草图的构建，并测定了基因纽的大最核苷酸序列。人大促进了生物信息学等学科和新的实验技术、研究系统和实验设备的发展。

由丁以人类为对象的研究实际上受到诸多的限制，人类的基困组计划还需对其他模式生物如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪等进行相应的研究，为研究人类基因绸的战略提供重要的依据。伴随人类基闻组计划的提前完成帮ｌ美国国家人类基因组研究院（ＮＨＧＲＩ）今后工作目标的公布（ＣｏｌｌｉｎｓＦ．Ｓ．等，２００３），基因组时代已经到来。目前已有多种模式生物的基因组序列已全部测定。

鸡的基因组测序计划在美国华盛顿火学基因组中一Ｏ（ＷＵＧＳＣ）、英国Ｓａｎｇｅｒ研究所及中国北方基因组研究所暨华大基因研究中心的合作Ｆ展开。于２００３年１２月，原始序列的测定已经完成，覆盖基冈组６倍以上的序列正在拼接和定位分析之中，全部Ｉ：作应在２００４年底完成（ＰｅａｒｓｏｎＨ等，２００３）。

１．１鸡的基因组图谱

家鸡（Ｇａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）起源于东南弧，其祖先被认为是红色原鸡（ｒｅｄｉｕｎｇｌｅｆｏｗｌ），丁公元前ｌ，４０００年最先出现于中国。

鸡的基因组由３９对染色体组成，约１．２×１０９碱基对，包括８对火染色体（ｍａｃｒｏ。ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．ＭＡＣｓ），１对性染色体（ｚ利Ｗ），其它３０对被认为是微小染色体（ｍｉｃｒｏ．ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．ＭＩＣｓ）。鸡的ｌ到６号染色体大小相似，最大的有８ｒｔｍ。鸟类的性染色体表现出异配型特点．雌性个体是异配型（ｚｗ），雄性则是同配型（ｚｚ），这与哺乳动物有所不同。鸡染色体大多是常染色体。ＨｊＣ带技术对异染色质进行染色（ＳｕｍｎｅｒＡＴ．等，１９７２），只有ｚ染色体末端火部分是Ｃ带特性，ｗ染色体则儿乎全是异染色质，小染色体人都具有小的ｃ带。

鸡基因组同其他动物一样有重复序列。在许多动物基因组中，如两栖动物爪蟾（Ｘｅ”ｏｐｕｓ）中．住２ｋｂ的简单拷贝序列间散布有短的重复序列０．３ｋｂ。鸟类基因约的组成有类似果蝇基因组的长散布模式特点。目前所知，鸡基因组重复序列中唯～典型的是鸡重复成分１（ｃｈｉｃｋｅｎｒｅＤｅａｔ１ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＲＩ），是由Ｓｔｕｍｐｈ等（ＳｔｕｍｐｈＷ．Ｅ．等，１９８１）发现的中度重复序列。该成分是古３

老的重复序列，在鸡中有六个砸族，其中四个有共同祖先（ｖ柚ｄｅ喀ｏｎＴ．Ｌ．等，１９９４）。超过９５％的ＣＲｌ成分被鉴定出来，它的平均长度３００ｂｐ，最大的有２．３ｋｂ（ＢｕｒｃｈＪＢ、Ｅ．等，１９９３）。该成分具有截断的５，末端和一致的３’端，包含有两个或两个以上的八个核苷的重复。ＣＲＩ成分是非长末端重复逆转座子（ＣｈｅｎＺ等，１９９１），有类ｐｏｌ的开放阅读框．负责编码逆转录酶，使该成分在整个基因组中转移。据估计，整个鸡基因组中大约有１００，０００拷贝。

在进行人规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部序列的重要一环。在变成基冈组全序列图之前．鸡基因组图谱是一种整合例谱，它将遗传图谱和物理图谱中的放射杂交图谱（ＲＨｍａｐ）、细胞遗传学图谱、转录图谱和基因图谱的共有信息进行综台．形成一致图谱（ＳｃｈｍｉｄＭ等，２０００）。

１．１．１鸡的遗传图谱

遗传图谱的构建是根据任一遗传性状（如己知的多型性基因位点、功能未知的ＤＮＡ标记、可鉴别的表型性状）的分离比例，将其定位在基因组中。因此遗传图谱是根据等位基因在减数分裂中的重组频率，来确定其在基冈组中的顺序和相对距离的。

１１．１．１图谱标记

图谱构建中需要可以鉴别的标记（ｍａｒｋｅｒ）。构建遗传图谱中，可用基冈和ＤＮＡ标记。

（１）基冈标记。基因控制表型，所以就是利用可以鉴别的形态、生化等表刑性状做标记。遗传学中最早的果蝇连锁图就是利用控制果蝇眼睛的一些基冈作为标记，分析备基冈间的连锁关系及遗传距离，绘制出连锁图谱。

（２）ＤＮＡ标记。ＤＮＡ可作为构建遗传幽谱的标记，ＤＮＡ至少具有西种不同的存在方式（等位基｜天１）。ＤＮＡ标记有３种类型。

Ａ．限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）：限制性内切酶能识别和切割特异核苻酸序列，ＤＮＡ序列能不能被某一酶切，实际上相当于一对等位基因的著异。

Ｂ．简单序列长度多态性：简单序列长度多态性（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＬＰ）是一些长度不等的重复序列。分为可变数目串联重复（ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅＤｅａｔ．ＶＮＴＲ）和简单重复序列（ｓｉｍｐｌｅｔａｎｄｏｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ），即微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｌｔｅ）。

Ｃ。单核苷酸多态性：单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏ／ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）是基冈中的点突变，存在的数量多。是当前应用前景最好的标记。

１．１．Ｉ，２遗传图谱的构建

遗传图谱的构建通常按以Ｆ儿个步骤进行：

Ｉ．选择适台做圈的遗传标记

２．进行试验设计，确定作图群体的亲本和规模

３．培养并繁衍作图群体－得到较大规模的遗传标记处于分离状态的屙代群体（资源群、参考群）

４．检测每个后代个体的各个标记位点的基因型

５．分析标记间的连锁关系，绘制标记遗传连锁图谱

１．１．１．３鸡的遗传图谱

鸡遗传图谱经历了近百年的发展历史。１９０８年Ｓｐｌｉｍａｎ揭示斑纹（ｂｍ＇ｒｉｎｇ）基因是性连锁的，标志着鸡染色体图谱研究的开始。１９３６年ＨＵＲ等建立了第一张鸡的遗传连锁图谱（ＨｕＲＦ等，１９３６：ＢｕｍｓｔｅａｄＮ．等，１９９２），该图谱包含５个连锁群的１８个位点。这张图谱同时也是畜禽品种中的第一张图谱。此后利用经典的形态学及多态型突变标记，人们相继定位了许多常染色体和性染色体上的基因，其中绝大多数为质量性状基因。

１９９２年，Ｂｕｍｓｔｅａｄ和Ｐａｌｙｇａ（ＢｕｍｓｔｅａｄＮ．等，１９９２）利用两个抗病性不同的白莱航品系做亲本采用同交设计建立了Ｃ群体（Ｃｏｍｐｔｏｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）。随后使用限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）分析，发表了第一张鸡基冈组图谱（Ｃｏｍｐｔｏｎ图谱）。这张图包含１００个标记，覆盖鸡基１］；ｌ组５８５ｃＭ，有１８个连锁群。

１９９３年，Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ等选用红色原鸡与白莱航鸡为基础群建立了Ｅ群体（ＥａｓｔＬａｎｓｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ＣｒｉｔｔｅｎｄｅｎＬＢ．等，１９９３），在ＥａｓｔＬａｎｓｉｎｇ群体中做出了一张包含１９个连锁群９８个标记的遗传连锁图（含传统的红细胞抗原基因、ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ及鸡的ＣＲＩ重复序列多态标记）（ＬｅｖｉｎＩ．等，ｌ９９４）。将Ｃｏｍｐｔｏｎ和ＥａｓｔＬａｎｓｉｎｇ图谱进行比较，发现实际上Ｃｏｍｐｔｏｎ群体中存在着较大的重组．有２，７００ｅＭ，而ＥａｓｔＬａｎｓｉｎｇ只有２，１００ｃＭ。随后，１９９７年，Ｃｒｏｏｉｊｍａｎｓ等用白洛克鸡（ｗｈｉｔｅｐｌｙｍｏｕｔｈｒｏｃｋ）建立了第三个资源家系ｗ群体（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ＯｒｏｅｎｅｎＭ．Ａ．Ｍ．等，１９９８），Ｗ群体的信息的加入导致３大家系的图谱完全整合．三张遗传图谱分别得到了补充和完善。一致图谱（ｃｏｆｌｓＢｎｓｕｓｍａｐ）包含标记位点１８８９个，其中框架位点４８０个，分别位＿丁５０个连锁群中，覆盖长度达约３，８００ｃＭ。图１．１为２号染色体的一致图谱。

１．１．２鸡的物理图谱

１．１．２．１构建物理图谱的原因

构建物理图谱的原因有两个

（１）遗传圈谱的分辨率有限。对低等生物，可重复多次进行杂交、测交，短期内产生大量群体，可以得到大量重组交换的子代群体用于分析，因而可以构建高密度的遗传图谱。而对于高等真核生物来说，不可能褥到火量的子代群体，而只能分析一定数量的来自减数分裂的群体，使连锁分析受到限制。因此需要采用１Ｆ遗传学途径，绘制基冈组图谱。

（２）遗传图谱的精确率不高。在减数分裂中同源染色体之间发生的交换重组，并不是在整个染色体上随机发生的，在染色体上有一些重组热点（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｏｔｓｐｏｔ），其发生重组的频率高于其他伉点，从而影响到重组位点附近区段遗传图谱的准确性。

１．１．２．２物理图谱的构建途径

基闪组物理图谱的构建不需要经过减数分裂的世代群体．可以直接利．【＿ｆＪＤＮＡ分子分析。主要有以Ｆ途径。

中国农业人学博卜学位论文第一章文献综述ｌ１．２．２ｌ限制性酶图谱

利＿Ｌ｝；Ｉ限制性内切酶绘制图谱，对ｔ－ＤＮＡ分子长度在５０ｋｂ以Ｆ的片段没有什么困难。对丁１人于５０ｋｂ的ＤＮＡ分子，可选用稀有切点的内切酶切ＤＮＡ。可选用识别核苷酸较多的内切酶，

如Ｎｏｔｌ。或是选＿｝＝Ｉｊ其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶，如Ｓｍａｌｌ。

Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２

图ｆｉ鸡２号染色体的一致图谱

Ｆｉｇ１，ＩＴｈｅｃｏｎｓｅｎＳＵＳｍａｐｏｆｃｈｉｃｋｅｎｇｅｎｏｍｅｏｆｃｈｍｍｏＳｏｍｅ２

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１．１．２．２．２荧光原位杂交及其应用

荧光原位杂交技术（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）是另一种物理图谱构建方法。

它通过荧光标记的探针与ＤＮＡ分子杂交．使染色体上的杂交信号在显微镜下可直接观察。原｛＝：７＝杂交分成单一的原位杂交、多重的原位杂交和多色的原位杂交３种（干昌留等，２００３）。早期的原位杂交采用放射性标记作探针，其检测手段采用放射自显影。虽然该法灵敏度高，杂交信号强，尤其是对单拷贝ＤＮＡ顺序定位十分有用，但具有实验周期长，放射性标记的探针不稳定，对操作人员有危害，废物难以处理等缺点（ＧｅｒｈａｒｄＤＳ等，１９８１）。因此，非放射性标记的染色体原位杂交技术应运而生。从２０世纪８０年代后期开始，人们用更为安全可靠的非放射性物质如荧光酶、地高辛、生物素等标记的探针进行原位杂交。非放射性标记原位杂交具有以下优点：标记的探针稳定，非特异杂交信号污染少，检测简便、快速和安全等（黄梅等，２００１）。特别是荧光信号可以被特定的相机或激光扫描显微镜检测并记录下来，通过数字成像显微技术以获得更为准确的图谱（任南等，１９９８：张明等．２０００）。

荧光原位杂交技术的原理非常简单，它利用荧光标记的ＤＮＡ或ＲＮＡ分子，根据ＤＮＡ．ＤＮＡ｝ＩＪＤＮＡ．ＲＮＡ碱基的配对原则与染色体上相对应的序列杂交。进行原１１：）＝杂交时，先用高温或碱处理ＤＮＡ分子，使之发生变性。当温度Ｆ降或ＤＨ值恢复到中性，变性的ＤＮＡ会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键，恢复到原来的双链结构（杨易等，２００２）。

荧光原位杂交的操作步骤可概括为：（１）制各染色体；（２）标记探针；（３）将探针与实验材料的靶序列进行杂交：ｆ４）检测杂交的结果。

ＦＩＳＨ技术是基因作图的～个简单、有效、准确、可靠的方法，它可直接确定ＤＮＡ分子在染色体上的位置。常应用于以Ｆ几个方面：

①构建ＤＮＡ物理图谱。遗传图谱的构建方法由于重组点在染色体上分布的不均匀．靠近着丝粒的异染色质区的ＤＮＡ重组率远比距着丝粒远的低得多，从而造成两个分子标记之间的遗传距离发生误筹（ＷｉｅｄｏｍＫＨ等，１９９９）。ＦＩＳＨ在构建ＤＮＡ分子图谱时，所用的分辨率是指两个不同的ＤＮＡ探针能够检测到的最小距离，它决定了图谱的准确性和精密程度。ＦＩＳＨ技术发展至今，已可以在不同水平上进行染色体定位。在中期染色体上用ＦＩＳＨ技术构建染色体分子图谱的分辨率大约为１－３Ｍｂ：在减数分裂的粗线期染色体上的分辨率大约为１００ｋｂ；在间期核的染色质上的分辨率可达５０ｋｂ左右：在游离的染色体上用ＦＩＳＨ技术构建染色体分子图谱，其ＦＩＳＨ分辨率接近１２ｋｂ：在ＤＮＡ纤维上用Ｆ［ＳＨ技术构建染色体分子图谱分辨率能达到１－２ｋｂ（史娟．１９９９；孙春晓，２０００）。高分辨率的ＦｌｓＨ能快速准确地得到探针序列之间的顺序、方向及真实的物理距离冈而被广泛地应Ｊ＿｝；ｊｒＤＮＡ物理图谱的构建。

②基因组分析。用一个样本的基因组ＤＮＡ作探针，与另一样本进行染色体原位杂交，可有效地将同源性比较接近的两个染色体组（如同一属内的不同种之间）区分开来，这就是比较基因组杂交（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＣＧＨ）技术。它将待测ＤＮＡ和参照ＤＮＡ进行不同的荧光标记，以相同比例让两者竞争性地与正常染色体进行原位杂交，检测两种颜色的荧光强度，根据两种颜色的比率情况来显示基因组的结构状况，如发现两种颜色比率改变，则说明该区域存在ＤＮＡ序列的缺失或扩增。如待沁ＪＤＮＡ有过量扩增，则与染色体结合的荧光占优势，信号增强。如

待测ＤＮＡ有缺失，则只显示参照ＤＮＡ所标记的荧光颜色（杨林等，１９９８１周晓ｔ１９９８）。另外，利用特定的ＤＮＡ片段作为探针通过染色体原位杂交还可以反映染色体结构（如端粒和着丝点）或有关核酸序列标记的空间物理位置，以确定染色体是否重排（史娟，１９９９）。

③转移基因整合位点的检测。目前，将外源基因直接导入动植物基因组已成为创造新品种的常用方法。转移基冈的表达和整合位点有关，整合位点不同，基因的表达有明显差异。转移基因的整合还可能会引起插入突变，产生明显的表型效应。荧光原位杂交技术可用来直接检测到外源基冈是否整合及整合位点。另外，通过标记的ＤＮＡ探针与转基因动植物细胞中的ｍＲＮＡ杂交，观测其显示信号的强弱。还可获得转基囡表达的信息（刘蔽等，２００１：温昱等，２００１）。

１１．２．２．３序列标签位点

利＿Ｉ＿｛ｊ某一已知序列为标签的位点（ｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｇｅｄｓｉｔｅ，ＳＴＳ）作探针．与基闭组ＤＮＡ杂交．绘制物理图谱。作为ＳＴＳ，需要具备两个条件，一是其序列是已知的，以便用ＰＣＲ检测；二是在基因组中仅一个位点，没有重复。表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）和随机ＤＮＡ片段（只要不是重复序列）都可作为ＳＴＳ。

１．１．２．２．４辐射杂交图

辐射杂交系（ｒａｄｉａｔｉｏｎｈｙｂｒｉｄ）是指啮齿动物细胞含有另一个生物的染色体片段的细胞株。

细胞遗传学研究表明，用３０００－－８０００ｒｄＸ射线处理后．人的染色体会出现随机断裂，再将处理的染色体与正常的仓鼠或其他啮齿动物细胞融合，断裂后的人染色体可与仓鼠染色体融合，并

随其复制。有一种仓鼠缺失突变细胞，不能合成胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｅｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）

或次黄嘌呤转磷酸核糖激酶（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｆｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＨＰＲＴ），这两种酶缺失的细胞株不能在含有次黄嘌呤（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｈ）、氨基喋呤（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ，Ａ）利胸腺嘧啶脱氧核

营（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，Ｔ）（三者统称为ＨＡＴ）的培养基上生长。将融合后的仓鼠细胞在ＨＡＴ培养基上选择，能生＆的就是含有外源人染色体的细胞。

若增大辐射剂量，双链断裂（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢ）可以出现于整条染色体上。１，５００

ｒａｄ剂龄足以使细胞死亡，４，０００ｒａｄ能产生两个位点间的一个双链断裂。Ｃｏｘ等（ＣｏｘＤ．Ｒ．等，１９９０），使用该技术建立了一个来源于中国仓鼠．人体细胞杂交的辐射杂交系，包含有一条人

２ｌ号染色体的单拷贝。

Ｗａｉｔｅｒ等（ＷａｌｔｅｒＭ．Ａ．等，１９９４）进一步使用该技术发展出了全基因组辐射杂交（ｗｈｏｌｅ

ｇｅｎｏｍｅｍｄｉｍｉｏｎｈｙｂｒｉｄｓ，ＷＧ?ＲＨ）法。人成纤维细胞用３，０００ｒａｄ致死后，用ＴＫ缺乏的仓鼠细

胞培养。这些ＷＧ—ＲＨ克隆随后在ＨＡＴ培养液中培养，来选择含人染色体的克隆．然后用ＦＩＳＨ

来分析１４号染色体上的标记。ＷＧ?ＲＨ由于使连锁图谱内的非多态ＹＡＣｓ和ＥＳＴｓ的定位成为

可能，而成为一个强有力的技术。重组数可通过控制放射剂量而控制．剂鼍增大则救链断裂数

增加，冈而重组增加。

但是－ＷＧ＿ＲＨ用于充分覆盖鸡基因组依然很雉，因为微小染色体数目多，冈而需要很大

剂最来获得显著的重组。微小染色体中的一些有可能在ＲＨ中保持完整但是会很快消失。另外

由于ＲＨ克隆可能很快会将外源染色体排除在外．因而克隆应冻存。

鸡的放射杂交板由法国的Ｖｉｇｎａｌ等人构建成功（Ｍｉｒｅ川ｅＭｏｒｏｓｓｏｎ等，２００２），但是仍未包含

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主星銮些查兰彗土茎竺丝耋，，，，，，，，。。，，，，，。，。。，，。。。，。，。。，。二呈二茎，ｉ；些耋查所有的染色体。但这为鸡的基因的物理定位提供了一个极为有用的工具。

１．１－２２．５ＢＡＣ或ＹＡＣ重叠群构建基因组物理图谱

这里的基因组物理图谱是指一系列ＤＮＡ的限制性酶切片段沿染色体的有序排列形式。物理图谱的构建是通过哲落杂交，ＰＣＲ和ＤＮＡ指纹等方法来确定克隆之闻的重叠关系，将顺序重叠的克隆片段排列在一起。

制作重叠克隆群需要具有一定容量的大片段基因组文库。重叠克隆群的制作有三种方法。

Ａ．菌落杂交法。其基本原理是利用基因组某一区域特有的或与所需分离的目的基因紧密连锁的ＤＮＡ分子标记为探针筛选大片段基因组文库．可以分别得到一系列的刚性克隆，这些克隆之间有部分片段是重叠的，根据其重叠部分可以把它们有序地呈线状排列成重叠群（ｃｏｎｔｉｇ）。在两个重叠群之间会出现空隙，需要通过染色体步行来填补。该技术从分离人片段阳性克隆群的左、矗末端入手以它们为探针再次筛选基因组文库，获得新的克隆即为沿着染色体向前走了一步．重复这一过程，就能一步一步地将空隙填满，将两个克隆群整合在一起。这一方法能利用各种分子标记扫描文库，准确得到携带分子标记的阳性克隆，是构建重叠克隆群的酋选燕略。

Ｂ．ＰＣＲ法。即以ＰＣＲ技术为基础发展的一系列技术。包括序列标签能点（ＳＴＳ）、随机扩增多态性（ＲＡＰＤ）、扩增的限制性内切酶多态性（ＡＦＬＰ）、ＤＮＡ扩增产物指纹分析（ＤＡＦ）和Ａｌｕ－ＰＣＲ（Ａｌｕ为出现于人及相关哺乳动物基因组中的一种短重复元件）等已被广泛应用于重叠克隆群的构建。ＳＴＳ策略是利用已知核苷酸序列．从两端合成两个与其配对的引物，利用ＰＣＲ进行扩增，理论上讲具有相同扩增带型的亮隆，即共享一个或数个ＳＴＳ位标的克隆肯定是重叠的。这个方法具有简便、快速、精确度高等优点，是人类基因组计划所采用的主要策略之一。

Ｃ．ＤＮＡ指纹法。其原理是首先对随机克隆的ＤＮＡ选定一个６碱基识别位点的限制性内切酶消化，然后｝；｝ｊ放射性同位素进行末端标记，经标记后ＤＮＡ片段用另～个４个碱基识别位点的限制性内切酶消化，州序列分析胶分离这些片段，然后经放射性自显影检测。这些指纹图谱数据经计算机处理后，根据片段的相似性，构建重蹙克隆群。

１．１．２．２．６构建物理图谱所用的染色体分离技术

１．１．２２．６．１流式核型分析（ｆｌｏｗｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）

流式核型分析是分离出单个染色体并进行分析的技术。大鼙染色体被分离并悬浮在液体中，＿Ｉ；｝ｉ荧光染料染色。单条染色体经过激光柱，按荧光模式分类。荧光模式由ＤＮＡ含量所决定，不同的荧光染料对特定序列有相应的亲和。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８特异亲和Ａ厂ｒ序列，Ｃｈｒｏｍａｒｎｙｃｉｎ

Ａ３与Ｇ／Ｃ区。该技术十分灵敏，因此应设法使其最优化，并使用最纯的染色体来避免精度丢

失ａ若能获得单个染色体．则能使用它们ＰＣＲ扩增，克隆成单个染色体文库，还可直接选择

ＹＡＣ构成单条染色体池。虽然流式核型分析在人和植物的应用中获得了巨大成功，但鸡的染色

体中人量的微小染色体使得分析精度降低而８对大染色体较易分析。流式细胞分析的变异性也

较高，需要用传统细胞遗传学方法证实，但这在鸡中也存在～定的问题。１．１．２．２．６．２染色体微分割（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）

染色体微分割技术随着激光技术的发展而得以实现。将染色体固定于一个光圈中，用激光

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微光柱解剖后，用玻璃针移走。它的优点在于，可以将特定染色体的特定片段分离出来。微分割片段可以用于构建连续的大片段文库，并可用于基因定位研究（ＳｈａｗＥ．Ｍ．等，１９９６）。但是在鸡中分离出正确的染色体依然缺乏信息，因为微小染色体细胞学上不可分。这个技术同时也产生了一些微小的ＤＮＡ片段，使得克隆分割的片段较为困难。使用ＤＯＰ－ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｄ．ＰＣＲ）．用２２一ｍｅｒ的引物在复式退火温度条件Ｆ进行扩增．能生成用丁＝＿克隆的分割染色体的足量ＤＮＡ（ＡｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎＫ等，１９９４）。但分割片段的实际人小仍有１０Ｍｂ，较传统分子遗传学所得的７００ｋｂ要大的多。该技术可以为特定染色体的ＦＩＳＨ研究提供足够的ＤＮＡ。

１．１．２．２．６．３脉冲场凝胶电泳（ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）

ＰＦＧＥ是在琼脂糖凝胶上，在电场不同角度使用变化的电流，可以用于分离超过１Ｍｂ的大片段ＤＮＡ。该技术可分为多种方法，最普通的是钳式同源电场电泳（ｃｌａｍｐｅｄｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｆｉｅｌｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＨＥＦ）．它在琼脂糖胶的周围有一系列的电极。

该技术可以分离从１０ｋｂ到１０Ｍｂ的片段．这样就缩小了标准克隆系统，如质粒、噬菌体和粘粒载体间．以及遗传连锁图谱间的差异。随着酵母人１：染色体（ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．ＹＡＣ）技术和细菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＢＡＣ）等技术的发展，ＰＦＧＥ对所有进行基因组定位研究的实验室变得更为重要。

１．１．２．３鸡的基因组物理图谱

世界上已有儿个鸡的基因组大片段ＢＡＣ文库构建成功用以构建鸡的基因组物理图谱。ＴｅｘａｓＡ＆Ｍ大学的Ｚｈａｎｇ，Ｄｏｄｇｓｏｎ等建了一个含大于１１５，０００ＢＡＣ克隆的文库，使用了三种不同的限制性内切酶来获得部分酶切的插入片段（ＬｅｅＭ．．Ｋ．等，２００３）。他们用的基因组来自～只雌性的野生红色原鸡（家鸡的祖先），它所属的家系曾用于构建用于构建遗传图谱的ＥＬ回交资源群。使用这种鸡有助于通过它的序列和其他商用或试验鸡种之间的比较寻找ＳＮＰ。

Ｚｈａｎｇ的试验室对分别来自３个酶切文库的ＢＡＣ克隆进行指纹分析，组台成重替群。整个基因组的ＢＡＣ重叠群物理图谱已于２００３年底完成并发表（ＣｈｅｎｇｗｅｉＲｅｎ等，２００３）。该物理图谱对５７，０９１个ＢＡＣ克隆（约７．９倍基因组覆盖率）用限制性酶切和高清晰度的聚丙烯胺电泳得到ＢＡＣ指纹图进行分析。该物理图谱包括２３３１个相互重叠的ＢＡＣ重叠群，估计覆盖了Ｉ５２０Ｍｂ的物理长度。ＢＡＣ重叠群用３６７个标记筛选进行确认。共有３６１个重叠群被定位｝ｑ现有的鸡的遗传图谱上。

鸡的基冈组洲序计划在美国华盛顿大学基因组中一Ｄ，（ｗｕｏｓｃ）、英国Ｓａｎｇｅｒ研究所及中国北方基冈组研究所暨华大基因组研究中心协同并进。项目分Ｊ：为：华盛顿大学中心测定６倍原鸡的基因组序列，中国和英国测定三个家鸡种１倍的序列以获得更多的ＳＮＰ资源。２００３年１２月，原始序列的测定完成，２００４年初，用鸟枪法测得的全基因组原始序列已经被锚定到ＢＡＣ重叠群上?覆盖大于６倍的鸡基因组。ＷＵＧＳＣ的ＢＡＣ重叠群物理图谱，来自１３３．０００个ＢＡＣ的指纹图，由２８０个重叠群组成，其中的２／３已被定能到遗传连锁图谱和染色体图谱上。将覆盖５．２倍基冈组的序列进行拼接，可以覆盖约１亿碱基．约９７％的基冈组．其中ＧＣ含量为４１％．包括＾总序列的７％ｆｆ＇３７３Ｍｈ的散在重复序列。因此估计整个基冈组应为１．１—１．２ＧｂＤ。

鸡的基因组序列和图谱已释放到公众数据库中。比如ＥｎｓｅｍｂＩ：

网站：ｈ堑Ｐ；丛塑幽坠￡ｎｓ￡堡垒！：Ｑ￡型；ＵＣＳＣ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／；ＷＵＧＳＣ

鱼姐；丛ｇ璺旦鱼ｍ垦：型坠剑：趔丛垃画曼￡堡尘ｂｌ昼酲￡世。在ＮＣＢＩ的ＴｒａｃｅＡｃｈｉｖｅ和ＧｅｎｅＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）中也可查到释放的鸡基冈组序列。全部－｜＿＝作应在２００４年底完成。

１．２鸡的功能基因组研究

功能基冈绸学（后基冈组学）是研究基因在特定组织中、在发育的不同阶段或是疾病不同时期的功能及其表达情况（杜忠强，２００３）。基因的功能主要包括：生物化学功能．如作为蛋白质激酶对特异的蛋白质进行磷酸化修饰：细胞学功能，如参加细胞间和细胞Ｉ．１：ｌ的信号传递途径；发育上的功能，如参与形态建成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）等。基因的时空差异表达是生物发育、分化、衰老和抗逆等生命现象的分子基础。基因在不同组织、不同器官以及不同环境条件下的差异表达特征．为基冈功能的研究提供了重要的信息。

１．２．１从基因型到表型

功能基因组的研究审，除了对基因的识别和克隆之外，还应使＿｝＝Ｉｊ各种策略和技术手段将基因与动物的表型性状联系起来进行分析。

１．２．１．１ＲＮＡｉ技术

ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ），即ＲＮＡ干扰技术，是指双链ＲＮＡ特异性的降解同源ｍＲＮＡ，从

而使同源基冈表达沉默的过程。它可作用于具有不同表达水平的基冈．最近在鸡中也获得了成功。化学合成的小链干扰ＲＮＡ（ｓｈｏＨｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）．一般十分有效。但价格较贵。体外转录的ＲＮＡ或质粒基础上的短发夹ＲＮＡ表达系统，有望今后起主导作用。

ＭｃＭａｎｕｓ和Ｓｈａｒｐ（ＭｃＭａｎｕｓＭ．Ｔ等，２００２）详细介绍了ｓｉＲＮＡ技术在哺乳动物中的应用，其中包括与免疫、疾病与基田功能有关的研究（ＧｉｔｌｉｎＬ．等，２００２；ＪａｃｑｕｅＪ．Ｍ．等，２００２；ＤｙｒｓｋｊｅｔＬ等，２００３）。ｓｉＲＮＡ起初在植物的转录后基因沉默（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＰＴＧＳ）中发现，其ｌ：艘达约为２１－２５个ＲＮＡ核营。其后在线虫中义发现了小链暂时ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｔｅｍｐｏｒａｌＲＮＡ，ｓｔＲＮＡ），其Ｋ＝度同ｓｉＲＮＡ相似，也约为２１．２３个ＲＮＡ核苛。

１．２．１．２转基因鸡与细胞系

鸡的细胞较难培养，但是现在已有许多细胞系可供使．Ｉ｛｛。如ＤＦｌ是成纤维细胞系，ＤＴ４０是病毒诱导的淋巴细胞系，能在外源ＤＮＡ导入后发生高效率的同源重组。因而ＤＴ４０细胞系也被ｊ‘泛麻Ｊ｛；ｊ丁基冈打靶和体细胞敲除，也可被用于体内操作克隆基闻米产生诱变，还可以被用丁建立人Ｌ．染色体。鸡的胚胎干细胞系也已建立，可以用ｒ嵌台体和转基冈鸡的研究（ＢｒｏｗｎＷ．Ｒ．Ａ．等，２００３）。

使用病毒载体就可以生产转基因鸡。但转基因的种系整合率很低。嵌合体鸡可以通过胚胎细胞的移植来生成，而转染胚胎细胞或选择转基因细胞来制造嵌合体的方法正在积极的研究之

中。从整体来说，鸡的转基因．Ｉ：作还需更多的努力。

１＿２２生物信息学

生物信息学是分子生物学和信息科学与技术、物理、数学等学科交叉、结合的产物，它的出现极大地推动了分子生物学的发展。生物信息学随着基因组计划的启动和推动而迅猛发展，它为基嗣组研究提供的海量数据是生物学历史上前所未有的。

利用计算机来协助克隆基因，被称为电子克隆，是与定位克隆、定位候选克隆并列的方法之一。同时，计算机分析是基因克隆中的重要手段，越来越多的基因克隆建立在生物信息学分析的基础上。进行同源性比对和计算机辅助结构、功能分析。尤其是ＥＳＴ技术的使用，为火规模进行基冈克隆和表达分析奠定了基础．也为生物信息学的功能的发挥提供了空间。

１．２．３渐成基因组学（ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ）

基冈组学的研究目的之一就是为详细阐述生命现象的复杂性提供参考数据，而构成细胞或有机体复杂功能特性的一个原因就是渐成学（ｅｐｉｇｅｎｅｓｉｓ）。渐成基因组学就是研究为基冈或接个基因组所提供的信息系统和运作规则的－－ｆ］科学，其中包括印迹（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）、代谢网络、胚胎发育的遗传时空秩序以及基因作用的渐成遗传学机制等（Ｂｅｃｋｓ．等，１９９９）。基因的转录和翻泽过程受到多种因素的制约，与染色质相关的蛋白（连接组蛋白、转录因子）的重构、基因组甲基化、组蛋向的乙酰化、组蛋白组装及核小体形成的不同形式等，研究生物的渐成遗传学机制将提供生物的渐成基因型。基因组甲基化是基因组建成遗传修饰和基因绗功能调节的主要手段．ＤＮＡ甲基化可以改变ＤＮＡ与蛋白质之间的作用，提供非编码序列（包括内含子、重复序列、以及一些蕴藏着的活性转座成分）和发育相关基因沉默的可遗传机翻ｊ（ＫａｎｇＹ．．Ｋ．等，２００１）。组萤向除了（去）乙酰化外，还能发生磷酸化、甲基化和泛素化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ），它们影响着基因的活性状态。这些共价修饰之间也可能存在着联系（ＫａｎｇＹ．．Ｋ．等，２００２；ＫｕｒｄｉｓｔａｎｉＳ．等．２００３）。

在功能基冈缀时代，不同技术间的渗透结台对生物基因组中各基冈的时空表达调控研究是必不可少的。对基冈功能的研究，可以了解基冈所形成的代谢网络，如何在不同冉ｑ环境条件卜影响个体发育过程，并最终解释复杂的生命过程。

１．３比较图谱与比较基因组学

比较基冈统学是基因组学的重要分支。它是随人类基因组计划，特别是随人类与其它生物基冈组的火规模序列分析而发展起来的新学科，现已成研究生物基因组的最重要的策略与手段。利＿ｌ｝ｊ不同物种基闭组之间编码序列和组织结构上的同源性．克隆控锏性状的基冈，揭示基因的功能和性状发生的分子机制，阐明物种进化的关系及基因组的内在结构．这就是比较基因组学。

在整个生物圈中，所有物种的基因都是由一个或一组始祖基团通过加倍（ｄｕｐｉｉｃａｔｉｏｎ）与丈规模的遗传扩展（ｅｎｏｒｍｏｕｓｇｅｎｅｔｉｃｅｘｐａｎｓｉｏｎ）演变而来。这一演变的规模与层次可以是一段不

艮的核酸分子，也可能是能对选择压力进行反应的较为独立的结构与功能单位，也可能包括许多这样的单位、彼此有一定联系的染色体片段，也可能是一个较为完整的染色体，还可能是整

１２

土量垒兰叁兰生：：兰竺鎏耋。，，。。，，。。。。。。。。。。，，。。。。，，，，。。，，，耋三：耋ｉ：坠耋耋个基冈组的加倍及多倍体化（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ），这些进化代表了一个物种所有遗传信息的基因

组进化，而不是个别基因、片段进化事件的简单累加与修饰。可以这样假设，人类与其他哺乳动物有一个麸同的祖先，在漫长的进化中，染色体发生断裂、重排，ａｎ上基因内部的不断变异，

成为各种不同的物种。但是未发生断裂重排的完整片段内部的基嗣的组织和连锁顺序在不同的

物种中保持不变，从而在相当程度上保留了基冈的整体性与连续性．即不同物种基因连锁的同

线性关系（ｓｙｎｔｅｎｙ）。这也是比较基因组学研究和基闻组比较作图的基础所在。

比较遗传定位使检测亲缘关系较远的动物间的同源染色体片段成为可能。对鸡的基因组研

究结果表明，鸡的基冈组与人的基因组有很好的同线性关系。因此与其他模式生物相比较，鸡

可能是一种研究人类基因组的更好的模式生物。鸡的一个染色体组有３９条染色体，但由于其中

的３０条为微小染色体，所以研究起来较为困难。然而对ＣｐＧ岛和ＧＣ含量的研究结果表明，

仅占基因组ＤＮＡｌｌ４人小的这些小染色体很可能含有鸡的多数基因（Ｓｍｉｔｈｊ等，２０００ｂ），从而使

基冈的平均密度可能达到１０ｋｂ一个基因。而且鸡的基因内含子比人类同源基因的内含子要小。

由丁』鸡的基因组的特性，有关鸡的基因组的比较研究已经引起了更多的兴趣。

１．４鸡的ｚ染色体研究

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尝｝呶吨喘虬虬叭

叭虬叭虬叭虬咆咆

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图ｌ２鸡ｚ染色体细胞遗传图谱。

Ｆｉｇｌ２ＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃＭａｐｏｆＧＧＡＺ

目前定位在Ｚ染色体上的ＱＴＬ包括产蛋数量，产蛋质量，初产蛋时问，蛋壳强度，疾病垫譬等性状（ＰａｕｌＭ－Ｈｏｃｋｉｎｇ等，２００３）。此外ＩＤ基因也通过经典遗传学的方法定位在ｚ染色体

末端。但是鸡ｚ染色体的基因组学研究却很缺乏。

目前定能在ｚ染色体上的分子标记仅为８１个（见表１．１），覆盖２０１ｃＭ。其中包括１７个

基因或ＥＳＴ标记，２１个微卫星标记或小卫星标记，４１个ＡＦＬＰ，ＲＡＰＤ，ＲＦＬＰ，ＣＲｌ标记，

中国农业大学博士学位论文第一章文献综述其连锁关系如图１．２和图１．３（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｕｌｔｒｖ．ｍｐｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｃｏｎｍａｐ／ｃｏｎｍａｐ．ｈｔｍ）。基因组草图公布后，ｚ染色体上的信息有所增加。目前可以使用的基闲组序列中共包括３０８３２４９２ｂｐ己排列好的连续序列，跨越了染色体３３６５１１６９ｂｐ染色体区段。同时还包括１４３４８６１５ｂｐ的随机序列，跨越了１４９９４５７０ｂｐ的染色体区段。但是这个草图距离全面地完成基因组序列图谱还有很大的距离（一ｈｔｔｐ：ｌ／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ，ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｈｉｃｋｅｎｌｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）。目前在ｚ染色体上还有许多缺口需要填补，而且未定位的序列占到整个区域的ｌ，３左右，冈此还需要迸一步完善。

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图１．３鸡ｚ染色体的一致图谱。

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