法对天然抗氧化物质抗羟自由基性能的测定

两种分光光度法对天然抗氧化物质抗羟自由基性能的测定

闫有禄

（云南省红河学院理学院化学系2001级化学教育化教AB班蒙自661100）

摘要：为了检测Fenton试剂（H2O2/Fe2+体系）产生的羟自由基（.OH），本文采用了亚甲基蓝和邻二氮菲—Fe2+两种分光光度法对六种天然的野生植物抗氧化剂对羟自由基的作用进行了分析和检测。两种分光光度法对羟自由基的分析检测及抗氧化剂的抗羟自由基性能检测方法，对研究工作都具有很好的实用性。从茶叶、黄草、甘草、葛根、姜、枇杷籽中提取的抗氧化物质与羟自由基清除率具有明显的量效关系，具有很好的抗氧化能力及羟自由基清除作用，方法稳定性好，操作简便，测定快速，能简便的筛选抗羟自由基的清除率和有效抗氧化剂药物的方法。

关键词：羟自由基、羟自由基检测、分光光度法、自由基清除率、抗氧化作用、抗氧化剂。

引言：

羟自由基是体内最活泼的活性氧，是一种氧化能力很强的自由基，是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可导致许多病理变化，它可以通过电子转移、夺取氢原子（加成）和羟基化（脱氢）等反应方式与生物体内的多种分子作用，在生物体内，需氧代谢的氧化还原反应所产生的羟自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构及功能，使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等都发生氧化，使物质的氧化性遭受损伤和破坏，造成细胞坏死或突变。同时羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关，羟自由基的检测对于自由基的生物作用研究有重要意义。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标，因此，加强对羟自由基作用的研究是很有必要的。产生羟自由基的方法除经典Fenton反应外，还有Cu+—H2O2、Co2+—H2O2体系也能产生羟自由基，只是它们的最大吸收波长不同。目前分析检测羟自由基的方法有电子自旋共振法、化学发光法、脉冲辐解法、细胞色素C氧化法、无机荧光法、高效液相色谱法、薄层扫描法等。采用这些方法时所需仪器特殊，试剂昂贵，因而使其应用受到限制。本文采用两种不同的分光光度法进行羟自由基的产生及物质的抗氧化性能进行分析、检测和研究。天然物质抗氧化作用的研究及抗氧化剂的开发目的就是为了清除自由基，使生物体能够健康生长和发展。此两种分光光度法由于所需设备简单、仪器通用、操作简便、快速，便于广泛应用。 1、 实验部分六种天然植物中抗氧化物质的提取： 1.1实验部分 1.1.1仪器和试剂

a.仪器：蒸馏装置、回流装置、过滤装置、恒温水箱及其它的辅助实验仪器装置。 b.试剂：95%的乙醇溶液、10%的乙醇溶液、0.5%的稀氨水和蒸馏水。 1.2实验方法：

1.2.1茶叶的提取：用95%的乙醇一次回流提取，称取茶叶末100g，用500ml乙醇（95%）于1、实验部分90±1℃下回流提取1小时，趁热过滤，将所得滤液蒸馏为深褐色液体置于棕色试剂瓶中备用。

1.2.2甘草的提取：称取甘草切片100g加入回流连续提取器中，分别加入含0.5%稀氨水和含10%乙醇溶液600ml，在1、实验部分50—55℃条件下连续提取4小时，最后将提取液过滤，用蒸馏装置将滤液蒸馏浓缩至棕色液体置于棕色试剂瓶中备用。

1.2.3葛根的提取：称取葛根粉末340g，用95%的乙醇600ml在回流提取器中，连续提取两次（每次1小时），趁热过滤，将滤液用蒸馏装置蒸馏浓缩至棕色液体置于棕色瓶中备用。 1.2.4黄草的提取：称取黄草200g，每次用95%的乙醇600ml在回流连续提取器中连续提取两次（每次1小时），趁热过滤，将滤液用蒸馏装置蒸馏浓缩至棕褐色液体置于棕色试剂瓶中备用。

1.2.5姜的提取：称取姜粉末60g，用95%的乙醇400ml在回流提取器中连续提取两次每次1小时，趁热过滤，将滤液用蒸馏装置蒸馏浓缩至黄色液体置于棕色试剂瓶中备用。

1.2.6枇杷籽的提取：称取枇杷籽100g，用95%的乙醇800ml在回流提取器中连续提取两次每次1小时，趁热过滤，将滤液用蒸馏装置蒸馏浓缩至黄色液体置于棕色试剂瓶中备用。 2、 亚甲基蓝分光光度法检测Fenton试剂产生的羟自由基。

自由基和抗氧化剂的研究，最主要的工作就是建立活性氧或自由基的发生体系，然后过检测其中产生的自由基和抗氧化剂或自由基清除剂对所产生自由基的抑制清除行为。Fenton反应能够产生羟自由基，产生的羟自由基与亚甲基蓝发生反应后，亚甲基蓝的颜色发生变化，亚甲基蓝具有特殊的深蓝色，利用其褪色效应，可以采用分光光度法对其进行研究。利用分光光度计测定其在617nm波长处的吸光度值A，可以计算其△A617值，可以间接测定羟自由基的产生量。在未产生羟自由基前加入抗氧化剂或自由基清除剂可以清除一部分羟自由基或抑制产生的羟自由基的行为，采用分光光度计测定其在617nm波长处的吸光度值A，可以间接测定羟自由基的清除率或可推知抗氧化剂的抗氧化能力。采用本方法稳定性好，操作简便，测定快速，可作为一种简便的筛选抗氧化剂的方法。 2.1实验部分。 2.1.1仪器和试剂：

a.仪器：Unico—WFJ—7200型可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）

b.试剂：FeSO4标准溶液：0.2mmol/L，亚甲基蓝：0.015%，NH3H2O—NH4Cl缓冲溶液PH=9.0，过氧化氢：2%（体积分数），所用试剂都为分析纯，蒸馏水，天然抗氧化物质（剂）样品溶液的浓度分别为：茶叶提取物0.3295g/ml，甘草提取物0.461425g/ml，葛根提取物0.13515g/ml，黄草提取物0.04684g/ml，姜提取物0.056575g/ml，枇杷籽提取物0.178275g/ml。 2.1.2实验方法：

a.测定原理：Fenton反应是产生羟自由基的经典方法，所产生的羟自由基与亚甲基蓝作用后，使其吸光度值变化，利用分光光度法所测到的吸光度值变化间接测定所产生的羟自由基。

b.羟自由基检测法：在10ml具塞比色管中，加FeSO4溶液1.0ml，亚甲基蓝溶液1.0ml，缓冲溶液3.0ml，过氧化氢1.0ml，用水稀释至刻度。在30℃下反应20min后，以1cm比色皿，测617nm波长处的吸光度值A，计算其与空白参比A617之差（△A617）。

c.自由基清除率的计算：抗氧化剂清除羟自由基作用按上述方法，加入抗氧化剂后测A617（加药），则得自由基清除率K的计算公式如下：

K＝（A1—A2）/（A3—A4）×100% 其式中：

A1为加入抗氧化剂反应后亚甲基蓝溶液的吸光度值；

A2为不加抗氧化剂，羟自由基与亚甲基蓝溶液反应后的吸光度值； A3为不加抗氧化剂和2%的H2O2，亚甲基蓝溶液的吸光度值 ； A4为空白参比蒸馏水的吸光度值。 2.2结果与讨论：

按上述实验方法加入不同体积的抗氧化剂，各提取物的浓度分别为：茶叶0.3295g/ml、甘草0.461425g/ml、葛根0.13515g/ml、黄草0.04684g/ml、姜0.056575g/ml、枇杷籽0.178275g/ml，测出A1、A2、A3、A4，根据实验中加入不同体积和不同浓度的各种抗氧化剂所测出的不同吸光度值A，再根据自由基清除率公式K=（A1—A2）/（A3—A4）×100%，计算出其相应的自由基K，结果见表1、图1和图2。 不加抗氧化药亚甲基蓝溶液受损伤后的吸光度A1=1.632，

不加抗氧化剂也不加H2O2亚甲基蓝溶液未受损伤的吸光度值A3=1.645， 以蒸馏水为参比的空白试样其吸光度值A4=0。

抗氧化药物名称 茶叶 所加的体积（V） V0=0.0ml V1=0.1ml V2=0.2ml V3=0.3ml V4=0.4ml V5=0.5ml 吸光度值（A） A0=1.632 A1=2.193 A2=2.709 A3=2.723 A4=2.767 A5=2.783 A0=1.632 A1=2.010 A2=2.265 A3=2.317 A4=2.602 A5=2.683 A0=1.632 A1=1.731 A2=2.081 A3=2.388 A4=2.634 A5=2.670 自由基清除率（K） K0=0.0% K1=34.1% K2=65.5% K3=66.3% K4=69.0% K5=70.0% K0=0.0% K1=23.0% K2=38.5% K3=41.6% K4=59.0% K5=63.9% K0=0.0% K1=6.0% K2=27.3% K3=45.2% K4=61.1% K5=63..1% 抗氧化药物名称 所加的体积（V） 吸光度值（A） 自由基清除率（K） 葛根 V0=0.0ml A0=1.632 V1=0.1ml A1=1.831 V2=0.2ml A2=1.933 V3=0.3ml A3=2.032 V4=0.4ml A4=2.382 V5=0.5ml A5=2.634 K0=0.0% K1=12.1% K2=18.3% K3=24.3% K4=45.6% K5=60.9% K0=0.0% K1=54.8% K2=64.7% K3=66.3% K4=68.1% K5=70.0% K0=0.0% K1=28.9% K2=38.8% K3=40.0% K4=42.3% 甘草 V0=0.0ml V1=0.1ml V2=0.2ml V3=0.3ml V4=0.4ml V5=0.5ml 姜 V0=0.0ml A0=1.632 V1=0.1ml A1=2.533 V2=0.2ml A2=2.696 V3=0.3ml A3=2.723 V4=0.4ml A4=2.752 V5=0.5ml A5=2.783 黄草 V0=0.0ml V1=0.1ml V2=0.2ml V3=0.3ml V4=0.4ml V5=0.5ml 枇杷籽 V0=0.0ml A0=1.632 V1=1.0ml A1=2.107 V2=1.5ml A2=2.270 V3=2.0ml A3=2.290 V4=2.5ml A4=2.328 V5=3.0ml A5=2.2.376 K5=45.2% 表1 抗氧化剂性能检测结果80.00p.00`.00P.00@.000.00 .00.00%0.00%0.0ml0.1ml0.2ml0.3ml0.4ml0.5ml0.6ml枇杷籽抗氧化剂性能检测结果50.00%自由基清除率（K）自由基清除率（K）茶叶甘草黄草葛根姜40.000.00 .00.00%0.00%llllll0m3.3.0m0m5m0m5m0.1.1.2.抗氧化剂的体积（V）图1抗氧化剂的体积 （V）图2

从表1、图1和图2可知，对于具有清除羟自由基能力的物质其清除羟自由基的能力与抗氧化剂用量均呈量效关系：随着抗氧化剂用量的增加，其清除羟自由基的能力也明显增强。从图1和图2还可知，所做的各种抗氧化剂加入不同体积、不同浓度，其清除羟自由基的能力也各不相同，从提取物的浓度看，清除羟自由基的能力为：甘草＞茶叶＞枇杷籽＞葛根＞姜＞黄草，而实际却不是这样其顺序为：姜＞黄草＞茶叶＞葛根＞甘草＞枇杷籽。各种提取物中抗氧化物质的有效成分不同，有的含量高些，虽然浓度很稀，但是其抗氧化物质的浓度也很高。有的含量低些，虽然浓度很高，但是其抗氧化物质的浓度却很低，是由于提取物中含有较多的杂质，就如图2中的枇杷籽，用的体积较大，但清除羟自由基的能力却不是很强。

2.5ml3、邻二氮菲—Fe2+分光光度法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基。

自由基的检测和清除，抗氧化剂的研究和开发利用是当今科学界上的热门课题，自由基是对生物体毒性最大、危害最大，导致许多病理变化，尤其是羟自由基，科学界正在研究阻止、抑制自由基产生的办法，寻找各种各样的能够清除自由基的天然抗氧化物质。此方法H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生羟自由基，邻二氮菲—Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲—Fe3+后，其536nm最大吸收峰消失，邻二氮菲—Fe2+水溶液的特殊颜色—橙红色发生变化，可以采用分光光度法对其进行分析和检测，利用分光光度计测定其在536nm波长处的吸光度值A，可以间接测定羟自由基的清除率或可推知抗氧化剂的抗氧化能力。根据上述原理，我们建立了以A536变化反映羟自由基氧化作用的比色测定法，该法设备简单，试剂便宜，操作简便，适于广泛应用。 3.1实验部分 3.1.1仪器与试剂

a.仪器：Unico—WFJ—7200型可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）。 b.试剂：50mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液，5mmol/L邻二氮菲水溶液，0.75mol/LPH=7.4磷酸盐缓冲溶液[（1：3.5）KH2PO4：Na2HPO4]，0.75mmol/L的FeSO4溶液，过氧化氢：0.01%（体积分数）所用试剂全部为国产分析纯，蒸馏水。天然抗氧化物质（剂）样品溶液的浓度分别为：茶叶提取物0.16475g/ml，甘草提取物0.30762g/ml，黄草提取物0.04684g/ml，葛根提取物0.13515g/ml，姜提取物0.056575g/ml，枇杷籽提取物0.178275g/ml。 3.1.2实验方法：

a.测定原理：前面已经提到Fenton反应是常见的产生羟自由基的手段，它以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化剂，链反应的中间过程可产生极活波，极具氧化能力的羟自由基：Fe2++H2O2→Fe3++.OH+OH-,其中产生的.OH可通过氢抽提，单电子转移或加成等方式攻击、氧化其它物质。从本实验知，在羟自由基的作用下，邻二氮菲可被氧化，从而其吸光度发生变化，△A的大小可表征羟自由基的攻击效果，不难理解，羟自由基产生得越多则△A越大，从而可以间接测得羟自由基的产生量。

b.羟自由基检测法：以H2O将50mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释至5mmol/L，在10ml具塞比色管中加入5mmol/L的邻二氮菲水溶液1.5ml，0.75mol/LPH=7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS）0.4ml充分混匀后，加FeSO4溶液，每加一管立即混匀，以H2O补充体积，最后加H2O2，反应液在37℃保温一定时间后，以1cm比色皿测536nm波长处的吸光度值（A536），计算加H2O2管与H2O代替H2O2管A536之差值（△A536）。

c.抗氧化药清除羟自由基作用：

依上述方法实验，邻二氮菲5mmol/L，FeSO40.75mmol/L，PH=7.4（PBS）150mmol/L，H2O20.01%，加抗氧化药后加H2O2，37℃保温1小时，测A536，未损伤管不加H2O2及抗氧化药。羟自由基K的计算公式为：K=[A（加药）—A（损伤）]/[A（未损伤）—A（空白）]×100%其式中：

A（加药）为加入抗氧化药和H2O2反应后邻二氮菲—Fe2+溶液的吸光度值A； A（损伤）为不加抗氧化药而加H2O2反应后邻二氮菲—Fe2+溶液的吸光度值A； A（未损伤）为既不加抗氧化药也不加H2O2邻二氮菲—Fe2+溶液的吸光度值A； A（空白）为只加蒸馏水作为空白参比的吸光度值A。 3.2结果与讨论：

按上述实验方法加入不同体积的抗氧化剂，各种提取物的浓度分别为：茶叶0.16475g/ml，甘草0.30762g/ml，葛根0.13515g/ml，黄草0.04684g/ml，姜0.056575g/ml，枇杷籽0.178275g/ml，测出A（加药）、A（损伤）、A（未损伤）、A（空白），根据实验中加入不同体积和不同浓度的各种抗氧化剂所测出的不同吸光度值A，再根据自由基清除率公式：

K=[A（加药）—A（损伤）]/[A（未损伤）—A（空白）]×100% 计算出其相应的自由基清除率（K），结果见表1、图1和图2。

不加抗氧化药邻二氮菲—Fe2+溶液受损伤后的吸光度值A（损伤）=1.513

不加抗氧化药也不加H2O2而是以水代替H2O2其邻二氮菲—Fe2+溶液的吸光度值A（未损伤）=1.598

以蒸馏水为参比的空白试样其吸光度值A（空白）=0。

抗氧化药物名称 茶叶 所加的体积（V） V0=0.0ml V1=0.2ml V2=0.3ml V3=0.4ml V4=0.5ml V5=0.6ml 甘草 V0=0.0ml V1=0.3ml V2=0.4ml V3=0.5ml V4=0.6ml V5=0.7ml 黄草 V0=0.0ml V1=0.2ml V2=0.3ml V3=0.4ml V4=0.5ml V5=0.6ml 吸光度值（A） A0=1.513 A1=1.683 A2=1.979 A3=2.232 A4=2.363 A5=2.490 A0=1.513 A1=1.646 A2=2.024 A3=2.219 A4=2.415 A5=2.436 A0=1.513 A1=2.135 A2=2.451 A3=2.482 A4=2.498 A5=2.524 自由基清除率（K） K0=0.0% K1=10.6% K2=29.2% K3=45.0% K4=53.2% K5=61.8% K0=0.0% K1=8.3% K2=32.0% K3=44.2% K4=56.4% K5=57.8% K0=0.0% K1=38.9% K2=58.7% K3=60.6% K4=61.6% K5=63.3% 抗氧化药物名称 所加的体积（V） 吸光度值（A） 自由基清除率（K） 葛根 V0=0.0ml A0=1.513 K0=0.0% V1=0.2ml A1=1.677 K1=10.3% V2=0.3ml A2=1.924 K2=25.7% V3=0.4ml A3=2.270 K3=47.4% V4=0.5ml A4=2.345 K4=52.1% V5=0.6ml A5=2.363 K5=53.2% 姜 V0=0.0ml A0=1.513 K0=0.0% V1=0.2ml A1=1.761 K1=15.5% V2=0.3ml A2=2.328 K2=51.0% V3=0.4ml A3=2.443 K3=58.2% V4=0.5ml A4=2.482 K4=60.6% V5=0.6ml A5=2.498 K5=61.6% 枇杷籽 V0=0.0ml A0=1.513 K0=0.0% V1=1.0ml A1=1.656 K1=8.9% V2=1.5ml A2=2.053 K2=33.8% V3=2.0ml A3=2.237 K3=45.3% V4=2.5ml A4=2.415 K4=56.4% V5=3.0ml A5=2.451 K5=58.7% 表1

抗氧化剂性能检测结果70.00`.00P.00@.000.00 .00.00%0.00%0.0ml0.2ml0.3ml0.4ml0.5ml0.6ml0.7ml0.8ml自由基清除率（K）枇杷籽抗氧化剂性能检测结果70.00%自由基清除率（K）茶叶甘草黄草葛根姜60.00P.00@.000.00 .00.00%0.00%0.0ml1.0ml1.5ml2.0ml2.5ml3.0ml3.5ml抗氧化剂的体积（V）图1抗氧化剂的体积 （V）图2

抗氧化剂清除羟自由基作用，茶叶、甘草、黄草、葛根、姜、枇杷籽提取物均为羟自由基清除剂，检测这六种药清除羟自由基的效应，可以证明该方法的有效性。从表1、图1和图2

可知，以邻二氮菲—Fe2+氧化法检测，它们清除羟自由基均有明显的量效关系，随着抗氧化剂用量的增加，其清除羟自由基的能力也明显增强。从表1、图1和图2还可知，所做的各种抗氧化剂样品，加入不同体积和不同浓度其清除羟自由基的能力也各不相同，从提取物的浓度来看，清除羟自由基的能力为：甘草＞枇杷籽＞茶叶＞葛根＞姜＞黄草，而实际却不是这样，其清除羟自由基的顺序为：黄草＞姜＞甘草＞茶叶＞葛根＞枇杷籽。邻二氮菲—Fe2+是一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。羟自由基是一种强氧化剂，作为反应物，H2O2与Fe2+作用可通过Fenton反应产生羟自由基。从前面的实验可知随H2O2浓度的增加，△A536逐渐增大，可反映出Fenton反应产物羟自由基浓度逐步增加的趋势。Fenton反应是体内产生羟自由基的重要机理，羟自由基是造成组织过氧化，蛋白质解聚.、聚合，核酸断裂，多糖解聚的重要活性氧。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标，邻二氮菲—Fe2+氧化法简单价廉，稳定可靠，是羟自由基性能检测和研究的有效方法。

[参考文献]

[1] 郭亚力，李 聪，欧灵澄，三种分光光度法对抗氧化物质抗自由基性能的分析检测。

[2] 李铭芳，王慧琴，李淑芳，亚甲基蓝光度法检测Fenton试剂所生产的羟自由基2003年10月，第25卷第5期，江西农业大学学报。

[3] 金 鸣，蔡亚欣，李金荣，邻二氮菲—Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基 北京市心肺血管医疗研究中心。

[4] 吴 南，任凤莲，吴心传，茜素紫显色剂检测Fenton反应产生的羟自由基，2001，23（1），42～43。 [5] 吴 南，任凤莲，唐 征，茜素紫显色检测Cu+催化H2O2产生的羟自由基，2000年12月第29卷第4期。

[6] 任凤莲，吴 南，吴心传，茜素紫光度法检测H2O2/Co2+产生的羟自由基，2000年12月第31卷第6期，中国工业大学学报。

[7] 贾之慎，邬建敏，唐孟成，比色法测定Fenton反应产生的羟自由基，浙江农业大学无机及分析化学教研室。

[8]黄兆龙，郭俊明，张东壁，葛根有效成分的提取和测定。

可知，以邻二氮菲—Fe2+氧化法检测，它们清除羟自由基均有明显的量效关系，随着抗氧化剂用量的增加，其清除羟自由基的能力也明显增强。从表1、图1和图2还可知，所做的各种抗氧化剂样品，加入不同体积和不同浓度其清除羟自由基的能力也各不相同，从提取物的浓度来看，清除羟自由基的能力为：甘草＞枇杷籽＞茶叶＞葛根＞姜＞黄草，而实际却不是这样，其清除羟自由基的顺序为：黄草＞姜＞甘草＞茶叶＞葛根＞枇杷籽。邻二氮菲—Fe2+是一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。羟自由基是一种强氧化剂，作为反应物，H2O2与Fe2+作用可通过Fenton反应产生羟自由基。从前面的实验可知随H2O2浓度的增加，△A536逐渐增大，可反映出Fenton反应产物羟自由基浓度逐步增加的趋势。Fenton反应是体内产生羟自由基的重要机理，羟自由基是造成组织过氧化，蛋白质解聚.、聚合，核酸断裂，多糖解聚的重要活性氧。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标，邻二氮菲—Fe2+氧化法简单价廉，稳定可靠，是羟自由基性能检测和研究的有效方法。

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