实验四 - - 高效液相色谱实验(3.7)
更新时间:2024-04-18 08:28:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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实验一 高压液相色谱系列实验
一、实验目的
1.熟悉岛津 液相色谱仪的整套装置、工作原理、工作流程;会较熟练操作和使用LC Solution工作站。
2.掌握外标法测定植物胡萝卜素的实验方法。 二、 实验原理
液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分,由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同,随流动相在色谱柱中运行时,在两相间进行反复多次(103~106次)地分配过程,使得原来分配系数具有微小差别的各组分,产生了保留能力明显差异的效果,进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同,经过一定长度的色谱柱后,彼此分离开来,最后按顺序流出色谱柱而进入信号检测器,在记录仪上或色谱数据机上显示出各组分的色谱行为和谱峰数值。测定各组分在色谱图上的保留时间(或保留距离),可直接进行组分的定性;测量各峰的峰面积,即可作为定量测定的参数,采用工作曲线法(即外标法)测定相应组分的含量。
液相色谱仪工作原理图
高效液相色谱仪是实现液相色谱分离分析过程的装置,如上图所示。贮液器中存贮的载液(用作流动相的液体常需除气)经过过滤后由高压泵输送到色谱柱入口(当采用梯度洗脱时,一般需用双泵系统来完成输送)。样品由进样器注入载液系统,而后送到色谱柱进行分离。分离后的组分由检测器检测,输出信号供给记录仪或数据处理装置。如果需收集馏分作进一步分析,则在色谱柱出口将样品馏分收集起来,对于非破坏型检测器,可直接收集通过检测器后的流出液。其中输液泵,色谱柱及检测器是仪器的关键部件。
三、仪器与试剂 1.仪器
1)液相色谱仪(岛津公司) 2) 微量注射器、容量瓶等 2.试剂
甲醇(色谱纯)、二次蒸馏水、胡萝卜素、异丙醇、乙腈 四、实验条件
UV检测器:280nm 流动相:乙腈:醇=4:1 流速:1.0ml/min 进样量:20 μl 柱温:25
五、实验步骤
1、熟悉仪器基本构成、流动相的流路系统;熟悉仪器的基本操作
2.配制测定溶液 各取200ul胡萝卜素标准溶液及样品溶液于2ml试管中混合。 3.开启电脑及色谱仪各部分,等系统稳定后准备使用。
4.用微量注射器准确抽取20.0 μL溶液,注射入进样口。注意不要将气泡抽入针筒。在相同的色谱条件下,以内标法确定样品的浓度。
六、思考题
1.如何快速建立未知物的液相色谱方法?一般应考虑哪些主要因素?如何选择合适的色谱柱?
2.哪些条件会影响浓度测定值的准确性? 3. 与气相色谱法比较,液相色谱法有那些优点?
HPLC操作程序 开机:
附:
检查流动相 开启检测器、柱温箱、泵LC-10AT B电源 开泵LC-10AT A电源(因为有记忆功能,自动记忆已开启的部件) 开启电脑 进入LC Solution软件 Anlysis 1 系统配置:选择所有已经开启的元件型号,进入右边的栏目后,按“确定”(或者用Auto Configuration健自动配置) 参数设置:设置pump的流速;检测器波长;柱温箱温度,设样品采集时间(Data acquisition time);如果是时间程序就设置程序 Download 保存Method file Instrument On 待 柱温箱温度稳定后出现Ready
就可进样 Single start Data file保存按OK
关机:
柱子清洗:用100%甲醇流动20~30min, 用甲醇清洗加样器六通阀 按Instrument On关闭系统 退出LC Solution系统 关LC-10AT A电源
关其它元件电源
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