百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

西北植物学报,2008,28(4):0651-0656ActaBot.Boreal. Occident.Sin.

文章编号:1000 4025(2008)04 0651 06*

百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

刘鲜艳,刘雅莉*,王跃进,张宗勤

(农业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室,陕西省农业分子生物学重点实验室,西北农林科技大学园艺学院,陕西杨陵712100)

摘 要:以亚洲百合 Polyanna (Liliumspp.)花瓣为材料,根据已报道的百合ACC氧化酶基因片段设计1对末端扩增特异引物,采用RACE方法,获得百合ACC氧化酶基因的全长cDNA(GenBank登录号为EU296623).该cDNA全长1152bp,具有一个954bp的开放阅读框,编码318个氨基酸.Blast搜索结果显示,百合ACC氧化酶基因核苷酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有71%~82%的相似性,氨基酸序列有70%~87%的相似性,聚类分析表明,与单子叶植物百合科郁金香首先聚类,其次与双子叶植物聚类,最后与单子叶禾本科和兰科植物聚类.

关键词:ACC氧化酶;cDNA克隆;百合;基因中图分类号:Q785

文献标识码:A

CloningandSequencingFull lengthcDNAEncodingACCOxidaseinLilium

LIUXian yan,LIUYa li*,WANGYue jin,ZHANGZong qin

(KeyLaboratoryofNorthwestHorticulturePlantGermplasmandGeneticImprovementoftheMinistryofAgricultureofChina,KeyLaboratoryforMolecularBiologyofAgricultureofShaanxiProvince,CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:TotalRNAwasextractedfromLilium Polyanna (Asiatichybrid)withmodifiedSDS/phenolmethod.ThefulllengthACOcDNAofLiliumwasgeneratedviaDNASTARbySplicingthetwosequencesobtainedfrom3!RACEand5!RACEtechnologywithprimersdesignedbasedontheESTsequence(Gen Bankaccessionnumber:DQ062133)thatwereported.LiliumACCoxidasecDNA(GenBankaccessionnumberEU296623)was1152bpinlength.Withinthefull lengthcDNA,aclearopenreadingframe(ORF)was954nucleotides,coding318aminoacids.TheresultsofhomologousanalysisinGenBankdem onstratedthatthesequencehad71%~82%identityonthenucleotidesequenceand70%~87%identityonthededucedaminoacidsequence.TheresultsofphylogeneticanalysisshowedthatACCoxidasefromLili umandfromTulipagesnerianaL.clusteredtogetherfirstly,andthencamethosefromdicotyledon,Orchi daceaeandGramineaecamesubsequently.

Keywords:ACCoxidase;cDNAcloning;Lilium;gene 百合花朵大、色彩雅,姿态优美,是世界上著名的五大切花之一,具有广阔的市场前景.百合属于乙烯跃变型花卉[1],其中ACC(1 氨基环丙烷 1 羧酸)

氧化酶(ACO)是乙烯生物合成的关键限速酶,并且

ACO基因的表达是非组成型的,其转录水平上的调控可能控制着乙烯的生成速率[2].因此利用反义

*

收稿日期:2007 12 21;修改稿收到日期:2008 03 31基金项目:国家自然科学基金(30371013)

作者简介:刘鲜艳(1981-),女(汉族),在读硕士,主要从事百合生物技术育种研究.E mail:lxianyan2008@,,,.E

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RNA或RNAi技术把百合ACC氧化酶基因片段导入到百合优良品种中,可以在一定程度上抑制或干扰其内源ACO基因的表达,从而抑制乙烯的生物合成,进而延缓切花衰老,使百合的保鲜期得以延长.目前国内外报道的克隆ACO基因主要是在黄杉(PseudotsugasinensisDode.)[3]、甘蔗(Saccharumof ficinarumL.)[4]、仙人掌(OpuntiacompressaMacb.)、柿果(DiospyroskakiThunb.)等植物中,观赏植物仅见康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)[7]和矮牵牛(PetuniahybridaVilm.)[8]等,而百合中从未见有所报道.

RACE(rapid amplificationofcDNAends)主要用特异引物和公用引物从低丰度转录本中快速扩增已知cDNA片段旁侧的5!和3!末端的简单而有效的方法,具有快捷、方便、高效等优点,成为目前克隆全长基因的一个常用方法.本研究在前期工作的基础上,采用BDSMARTTMRACEcDNAAmplifi cationKit,克隆百合ACO基因的cDNA全长,并进行序列比对分析,以期为ACO生化性质的研究与进一步利用基因工程手段实现品种改良奠定基础.

[5]

[6]

总RNA样品中的DNA的去除参照张今今等[10]的方法.

1.2.2 百合ACO基因cDNA片段3!端和5!端的扩增 RACEcDNA扩增采用BDSMARTTMRACEcD NAAmplificationKit(BDBiosciencesClontech),方法按照在说明书的基础上稍加改良.

(1)RACE引物设计及扩增反应 根据前期工作获得的EST核心序列(GenBank登录号DQ062133),利用Primer5.0软件设计基因特异引物GSP1(3!RACE引物)5! CCGTCACCTCCCCACCTC CAACAT 3!,和GSP2(5!RACE引物)5! CCTTCT TCAAATACCCTTTCTCCAACCC 3!.2个引物之间重叠区为150bp,GSP1与GSP22个引物扩增的产物作为对照.按ClontechSmartRACE试剂盒说明操作,采用15 L体系,各组分按比例缩减.循环参数为94 30s,(94 30s,68 30s,72 3min)35个循环,72 10min.

(2)RACE产物的克隆测序 1.5%琼脂糖凝胶回收3!RACE和5!RACE扩增产物,连接pGEM Teasy载体,转化E.coliTop10感受态细胞,蓝白斑筛选阳性菌落,培养后提取质粒DNA,分别进行质粒PCR检测以及EcoR#酶切鉴定,确定为阳性克隆后送公司测序.应用DNASTAR软件去除载体污染序列,将5!RACE和3!RACE测序结果拼接,将所得到的序列在NCBI的Blast进行比对.

1.2.3 ACO基因cDNA全长的获得及生物信息学分析 据RACE已得到的序列,利用Primer5.0软件设计基因特异引物ACO R:5! TCTTTGGAGTT GTGGTATGTGGTT 3!,与ACO F:5! CCGTCAC CTCCCCACCTCCAACAT 3!;15 L反应体系包括5! RACE readycDNA0.75 L,ACO R0.3 L,ACO F0.3 L,dNTPMix0.3 L,10%BDAdvantage2PCRbuffer1.5 L,50%BDAdvantage2PolymeraseMix0.3 L,PCR Gradewater11.55 L;循环参数同1.2.2(1),退火温度60 ,克隆测序.利用DNAS TAR软件分析测序结果的序列与拼接结果的序列.最终将所得到的序列在NCBI的Blast进行比对,核苷酸序列的相似性比对在NCBI的Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn)中分析,并确定开放阅读框分析(ORF),将其推导相应的氨基酸序列.蛋白质氨基酸相似性比对在NCBI的Blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)中分析;同样,运用Mega软件对推导的氨基酸序列与已知[11]

1 材料和方法

1.1 材 料

亚洲百合 Polyanna 购于西安花卉市场,参照郝福玲等[9]的方法将半开花瓣存于-80 冰箱中.RACE试剂盒购自Clontech公司,pGEM TEasyVector购自Promega公司,限制性内切酶EcoR#为TaKaRa公司产品,测序由上海生工完成.1.2 方 法

1.2.1 百合花瓣RNA的提取 采用改进的SDS/酚法,称取0.1g样品,在液氮条件下研成粉末,迅速转入到已加入800 L裂解液[SDS质量分数为1%;EDTA(5mmol/L);Tris碱(20mmol/L);NaCl(200mmol/L)]与50 L 巯基乙醇的2mL的离心管中,充分混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入等体积的酚 氯仿 异戊醇(25 24 1)和等体积的氯仿,混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入1/3体积的KAc(5mol/L),混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入等体积的酚 氯仿 异戊醇和等体积的氯仿,混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入1/3体积的LiCl(8mol/L),-20 沉淀2h以上,4 、12000r/min,离心15min;弃上清,75%的乙醇洗涤2次,30 L的DEPC水.

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4期 刘鲜艳,等:百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

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2 结果与分析

2.1 RACE产物的分析

改进的SDS/酚法提取百合花瓣的总RNA,利用紫外光吸收法测定RNA的浓度和OD值,浓度达到500ng/ L,OD260nm/OD280nm值为1.8.电泳图片显示,28S与18S比为2 1(图1),所以利用这种方法,提取的RNA不仅浓度高而且纯度好,完全能够满足下一步RACE的需要.

参照RACE试剂盒说明书,以逆转录分别合成的3!RACE Ready cDNA和5!RACE Ready cDNA为模板,GSP与UPM(10%UniversalPrimerAMix)为引物,分别进行5!RACE和3!RACE扩增(图2).以3!RACE Ready cDNA为模板,GSP1与UPM为引物扩增得到约840bp条带.以5!RACE Ready cDNA为模板,GSP2与UPM为引物扩增得到约450bp的条带.以5!RACE Ready cDNA为模板,以GSP1、GSP2为引物扩增到与预期大小相同的约150bp的条带.

上述产物经回收后,连接克隆载体pGEM Teasy,转化大肠杆菌,蓝白斑筛选,随机挑取1~2个阳性克隆,小量提取质粒,分别进行质粒PCR检测

和EcoR#酶切鉴定(图3).结果表明,含3! RACE和5! RACE产物的重组质粒均能检测到预期大小的片段.经鉴定为阳性的重组质粒送公司测序.2.2 全长cDNA片段的获得

测序结果经DNASTAR软件去除污染载体,并将3!RACE和5!RACE所得到的序列进行拼接,设计1对该拼接序列的特异引物,PCR扩增后,得到与预期大小相同的约1200bp的条带(图4).然后将PCR产物回收,连接到pGEM Teasy,操作同2.2,进行质粒PCR检测和EcoR#酶切鉴定,结果表明重组质粒均能检测到预期大小的片段(图5),经鉴定为阳性克隆的重组质粒送测序,测序结果分析与拼接结果一致.

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量为36.22KD.该基因暂时命名为LACO,其Gen Bank登录号为EU296623.

2.3.2 百合ACO基因核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性及系统进化分析 LACO核苷酸序列与已报道的其它植物ACO基因序列有71%~82%的相似性,与百合科的郁金香相似性最高,均在80%以上,其次是桑树、向日葵、梅、毛竹、卡特兰、蝴蝶兰等(同源性分别为74%、72%、72%、73%、72%和71%),同源性均在70%以上(表1).结果表明,本研究从百合中克隆到的ACO基因与已报道双子叶植物核苷酸序列相似性高于单子叶植物.

从LACO推导的氨基酸序列与已知其它植物ACO基因序列同源性有70%~87%相似性,其中与郁金香ACO基因相似性最高,为85%以上,其次是桑树、向日葵、绿茶、牵牛、蝴蝶兰、卡特兰、毛竹等,相似性分别为77%、72%、72%、71%、70%和70%(表1).结果表明,本研究从百合中克隆到的ACO基因推导的氨基酸序列与大部分已经报道的双子叶植物相似性高于单子叶植物.

对GenBank同源性搜索获得的其它植物ACO基因氨基酸序列进行系统进化分析,发现百

合

图5 重组质粒的鉴定

M.DL2000;1.cDNA全长片段的重组质粒PCR检测;

2.EcoR#酶切含cDNA全长片段的重组质粒

Fig.5 Identificationofrecombinantplasmid

M.DL2000;1.Identificationofrecombinantplasmidcontaining

productsofthefull lengthgenewithPCR;2.Digestion

ofrecombinantplasmidcontainingproductsof

thefull lengthgenewithEcoR#

2.3 生物信息学的分析

2.3.1 百合ACO基因cDNA全长核苷酸序列分析 测序得到百合ACC氧化酶基因的全长cDNA核苷酸序列大小为1152bp,其中起始密码子ATG位于34bp处,终止密码子TAA(即终止子)位于987bp,推导的氨基酸序列含318个氨基酸(图6),分子

图6 百合ACO基因cDNA全长的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列

Fig.6 Nucleotidesequenceanddeducedaminoacidsequenceofthefull lengthACOcDNA

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(EU296623)最先与百合科郁金香(BAE20195,BAE20196,BAE20197)聚类合并,其次与双子叶植物(天竺葵AAB70883,花叶木薯ABK59094,欧洲白桦ACO2AAN86821,牵牛ABL67954,天竺葵ACO3AAB70884等)聚类,最后与单子叶植物兰科(卡特兰AAT02192,蝴蝶兰AAT02194)与禾本科

植物(毛竹BAB32502,甘蔗ABM74187)聚类(图7).聚类分析结果表明,本研究克隆的ACO基因与双子叶植物的亲缘关系更近,与单子叶植物一些.

聚类分析发现,欧洲白桦ACO(AAN86821)与欧洲白桦ACO2(CAA71738)没有聚为一类,反而是梅(BAA90550)与欧洲白桦ACO(AAN86821)聚

表1 百合ACO基因和已知其它植物的ACO基因核苷酸与推导的氨基酸序列相似性比较Table1 AlignmentofEU296623andsomeplantACOnucleotidesequencesandaminoacidinGenBank

物种Plant

郁金香Tulipagesneriana(ACO3)郁金香Tulipagesneriana(ACO2)郁金香Tulipagesneriana(ACO1)桑Morusalba(ACO)

向日葵Helianthusannuus(ACO)梅Prunusmume(ACO)

甘蔗Saccharumofficinarum(ACO)牵牛Ipomoeanil(ACO)绿茶Camelliasinensis(ACO)花叶木薯Manihotesculenta(ACO)欧洲白桦Betulapendula(ACO)欧洲白桦Betulapendula(ACO2)

天竺葵Pelargoniumhortorum(ACO3)天竺葵Pelargoniumhortorum(ACO)毛竹Phyllostachysedulis(ACO)卡特兰Cattleyalabiata(ACO)蝴蝶兰Phalaenopsisamabilis(ACO)

GenBank的登录号AccessionNo.inGenBank

AB232767AB232766AB232765DQ785807L29405AB031027EF189711EF127818DQ904328EF035079AY154649Y10749U67861U19856AB044747AY598793AY598795

相似性Similarily/%

核苷酸Nucleotide

8082827472727372737173737374737271

氨基酸Aminoacid

8786857775727272727272727274717070

图7 Mega软件分析不同来源的ACO基因推导的氨基酸序列聚类分析结果

Fig.7 PhylogeneticanalysisofaminoacidsequencesofACOfrom

sugarcaneandotherplantsinGenBankdatabase

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为一类,而欧洲白桦ACO2(CAA71738)单个聚为一类.这有可能是因为它们本为同一基因家族不同成员,进化结果不一致,因此产生这种差异;也有可能是同一基因诱导方式的不同而形成不同转录本,从而导致蛋白的表达产生差异.其中,天竺葵ACO3(AAB70884)、天竺葵(AAB70883)可能因为上述的原因,二者差异也比较明显.而郁金香可能因为ACO基因不同成员,乙烯生物合成途径相似,尽管有不同的诱导方式,转录途径相似,因此,其不同的基因家族成员同源性比较高.

术逐渐取代前两种技术成为克隆基因全长的常用方法.近年来,RACE成功地应用于基因的分离[12 14],充分显示了其巨大的应用潜力.

本研究采用RACE技术,首次在百合中获得了ACO基因的全长序列,对该序列分析发现,该基因全长1152bp,开放阅读框为954bp,编码318个氨基酸,通过Blastn与Blastp分别进行同源性比对分析,LACO与已报道的植物同源性都在70%以上.聚类分析结果表明,本研究从百合中克隆出来的ACO基因最先与双子叶植物聚类合并,最后才与单子叶植物的兰科植物与禾本科植物聚类合并,这个结果与Blastn与Blastp分别对核苷酸与氨基酸同源性比对所得的结果基本上一致.其结果表明不同物种的ACO基因进化程度不同.

LACO全长的获得,一方面,可以体外表达大量酶蛋白,对其生物性质进行研究;另一方面,还可以构建反义或RNAi载体,转化百合,控制转基因植株的乙烯生成,延长百合切花的瓶插期,达到改良性状的目的.

3 讨 论

cDNA完整序列的获得对基因的结构和蛋白质表达等研究至关重要.5!和3!端的克隆与序列测定是全长基因分析中的关键,通过cDNA文库筛选或者电子克隆获得的基因往往存在5!和3!端不完整或缺失的现象,这为其后期研究基因的结构与蛋白表达带来困难.而RACE技术已经能够克服这些缺点,并很快地得到完整的全长片段.因此,RACE技

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/gh2q.html