western blot实验方法

Western blot

Western Blotting采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 试剂

1.30%丙烯酰胺

配方：丙烯酰胺 29g 甲叉双丙烯酰胺 1g 去离子水定容至 100mL

配法：向烧杯中加入60mL去离子水，充分搅拌溶解丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，加去离子水定容至100mL，用045μm滤膜滤去杂质，于棕色瓶中（避光）4℃保存，用时恢复至室温且无沉淀。 2. 10%SDS

配方： SDS 10g 去离子水定容至 100mL

配法： 称量10g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80mL去离子水，50℃水浴溶解，定容至100mL，室温保存。 3. 10%过硫酸铵

配方：过硫酸铵 1g 去离子水定容至 10mL

配法：临用前新鲜配制，或保存在-20℃，超过两周则扔掉。 4. 1.5M Tris-Hcl（pH8.8）

配方：Tris 18.17g 去离子水定容至 100mL

配法：称量18.17g Tris 置于烧杯中，加入约80mL去离子水，充分溶解搅拌，用浓盐酸调节pH值至8.8.将溶液定容至100mL高温高压灭菌后，室温保存。 5. 1.0M Tris-Hcl（pH6.8）

配方：Tris 12.10 去离子水定容至 100mL

配法：称量12.10g Tris 置于烧杯中，加入约80mL去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节pH值至6.8.将溶液定容为100mL。高温高压灭菌后，室温保存。

6. 还原型5×SDS上样缓冲液

配方： 1.0 M Tris-Hcl（pH6.8） 0.25mL DTT（二硫代苏糖醇） 78mg 溴酚蓝 5mg

甘油 0.5mL

去离子水溶解后定容至 1mL

配法： 混匀后，分装于1.5mL离心管中，4℃保存。上样时与样品1:4比

例加样。

7. 电泳缓冲液

配方：Tris 3.03g 甘氨酸 18.77g SDS 1g

去离子水定容至 1000mL

配法：精确称量，加入约800mL去离子水，搅拌溶解，加去离子水定容至1L后，室温保存。 8. 电转缓冲液

配方：甘氨酸 8.7g Tris 17.4g SDS 1.11g 甲醇 600mL 去离子水定容至 3000mL

配法：加600mL去离子水充分搅拌溶解后，加1800mL去离子水定容至2400mL后，加甲醇600mL，室温保存，可重复使用3～5次。 9.TBST缓冲液

配方： NaCl 8.8g 1.0M Tris-Hcl（pH6.8） 20mL Tween-20 0.5mL 去离子水定容至 1000mL

配法：向烧杯中加入800mL的去离子水，充分搅拌溶解，再加入0.5mL Tween-20后充分混匀，加去离子水定容至1000mL， 4℃保存 10. 封闭液

配方：TBST 100mL BSA 5g

配法：称量5g BSA（牛血清白蛋白）加入到100mL的TBST缓冲液中，充分搅拌溶解，4℃保存待用。 方法

1先作SDS-PAGE电泳， 2转膜:分为湿转和半干转

湿转:

（1） 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移缓冲液浸泡 （2） 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，

用玻璃棒在凝胶上来回滚动到最边上以去除所有的气泡。

（3）转膜顺序：阴极碳板+海绵+滤纸+胶+膜+滤纸+海绵+阳极碳板 （4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

（5）接通电源,选择合适的转膜电流和转膜时间,开始电泳转移。 （6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 半干转

(1)将凝胶和膜像三明治一样夹在用缓冲液湿润的滤纸之间进行转膜。

(2)加入适量电转液. 接通电源,选择合适的转膜电流和转膜时间,开始电泳

转移。

（3）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

3 封闭

将薄膜漂在5%脱脂乳液体中，4℃过夜，次日室温下用TBST洗涤薄膜3次,每次五分钟。 4 加一抗

加入以适当比例用5%BSA的TBS buffer稀释的一抗，37℃孵育1小时或4℃过夜。由于一抗太贵,必要时可回收一抗。膜在室温下用TBST洗涤薄膜3次,每次五分钟。 5 加二抗：

加入以适当比例用5%BSA的TBS buffer稀释的二抗，37℃孵育1小时，室温下用TBST洗涤薄膜3次,每次五分钟。 6 显色：

化学发光法。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/gef.html